大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
原代细胞传代培养步骤
原代细胞传代培养步骤引言原代细胞传代培养是细胞生物学研究中常用的技术手段之一。
它是指从活体组织或器官中分离得到的原代细胞，通过定期的传代培养，使其继续生长并保持其生物学特性。
本文将详细介绍原代细胞传代培养的步骤和注意事项。
准备工作在进行原代细胞传代培养之前，我们需要准备好以下工具和试剂：•细胞培养基：选择适合特定细胞系的培养基，常用的有DMEM、RPMI-1640等。
•离心管：用于离心细胞，分离上清液和沉淀。
•培养皿：提供细胞黏附和生长的平台，常用的有培养瓶、96孔板等。
•传代液：通常为含有生长因子和抗生素的培养基。
•培养箱：提供细胞培养所需的恒温和二氧化碳环境。
步骤步骤一：细胞收集1.准备组织或器官：选择合适的组织或器官，并保持其在解剖过程中的无菌状态。
2.组织分离：将组织或器官剪碎，并加入适当的消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶等进行消化。
3.离心分离细胞：将消化后的组织离心，以分离出上清液和含有细胞的沉淀。
步骤二：细胞培养1.细胞计数：使用细胞计数板或血细胞计数仪进行细胞计数。
2.接种细胞：将细胞按照一定比例加入含有细胞培养基的培养皿中。
3.培养条件：将培养皿放入预先调试好的培养箱中，保持适当的温度（通常为37摄氏度）和二氧化碳浓度（通常为5%）。
4.观察细胞生长：每天观察细胞的生长情况，记录细胞的形态和数量等信息。
步骤三：传代培养1.细胞达到80%～90%的密度时，可以进行传代培养。
2.清除培养液：将培养皿中的培养液倒掉，用无菌PBS对细胞进行冲洗，以去除残留的培养基和细胞碎片。
3.添加胰蛋白酶等消化酶：根据细胞系的特性和耐受性，加入适量的胰蛋白酶，进行细胞的消化。
4.停止消化：加入含有细胞培养液的离心管，停止细胞的消化过程。
5.离心分离：将细胞悬液离心，以分离出上清液和细胞沉淀。
6.细胞计数：使用细胞计数板或血细胞计数仪对细胞进行计数。
7.接种细胞：将计数后的细胞按照一定比例加入含有传代液的培养皿中。
低渗对体外培养星形胶质细胞增殖的影响
２ ５３
讨
论
细胞 Ｂｄ ｒｕ阳性 率 没有 明显 改变 ； 通过 流式 细胞 技 术 检 测也 提示 低渗 干预 组 与 对 照组 细 胞 相 比 ， 细 胞 周 期 其
在 脑缺 血 的病理 损伤 过 程 当 中 ， 星形 胶 质 细 胞 的 活 化增 殖 扮 演 了极 其 重 要 的 角 色 Ｊ 。尽 管 这 些 增 殖 的胶质 细胞 在早 期 发 挥 一定 的神 经 保 护 作 用 ， 是 过 但 度 的增 殖仍 是 神经 修 复 的主 要 障 碍 之 一 ＿ 。 目前 普 ２ 遍认 为缺血 微 环境 、 血脑 屏 障损伤 、 炎性 反 应等 都 与脑 缺 血后 星形 胶质 细胞 的 活化 增 殖 相 关 Ｊ但 其 具 体 机 ，
Ｍｅ ｉ ａ Ｃ ｌ ｇ ，Ｈｕ ｚ ｏ ｇ Ｕｎ ｖ ｒｉ ｆ ｃｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｄｃ ｌ ｏ ｌ ｅ ｅ ａ ｈ ｎ ｉｅ ｓ ｙ ｏ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ，Ｗ ｕ ａ ３ ０ ０，Ｃｈｎ ｔ Ｓ ｈ ｎ４ ０ ３ ｉａ Ｃｏ ｒ ｓ Ｏ ｄ ｎ ｕ ｈ ｒ： ＹＵ Ｚ ｉ ｕ ｎ Ｅ ｉ ：ｈ ｙ ａ — ｕ １ ６ ｔ ｍ． ｒｅ ｐ ｎ ｉｇａ ｔ ｏ ｈ — ａ ， ｍａｌ ｚ ｉｕ ｎ ｙ ＠ ２ ． ｏ ｙ
血后 各种 通 道功 能失 调 ， 水通 道 、 通 道 、 离 子通 如 钾 阴
的发 生机制 提 供 了实验 依据 。
参 考 文 献
［ ］ Ｓ ｆ ｎｅ １ ｏｒ ｉ ＭＶ．Ｍｏ ｃｌｒｄｓ ｃｏ ｆｒａｔｅａｔ ｇｏｉ ａｄ ｇａ ｏ ｗ ｌ ｕａ ｉ ｅｔ ｎｏ ｃｉ ｓｏｌ ｓ ｎ ｌ ｌ ｅ ｓ ｉ ｅ ｖ ｒ ｉ ｓ ｉ
胞周期分布 的情 况。结果
我们发现低渗干预 星形胶质 细胞 １ 恢复 正常培 养基后 １ 、４、８ ， 照组 和 ｈ并 ２２ ４ｈ对 低 渗干 预 ｌ 星形胶 质细胞 的增 ｈ对
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
步骤一、实验材料准备1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。
3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
二、原代培养方法1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
三、传代方法弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。
特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。
在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。
但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。
即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。
其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。
假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。
有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。
在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。
借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。
而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。
传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。
原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。
通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。
但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养。方法分子生物学
小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养。
方法分子生物学篇11.引言：介绍小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的重要性和研究背景。
2.材料与方法：详细阐述小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养过程，包括所需的试剂、器材、具体操作步骤等。
3.结果与讨论：展示分离和培养的结果，并对其进行讨论，包括细胞的生长状况、形态、纯度等。
4.结论：总结全文内容，强调研究的意义和价值，并提出未来可能的研究方向。
正文小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养是一项重要的研究工作，有助于深入了解这两种细胞在神经系统中的功能和相互作用。
本文将对分离和培养的具体方法进行介绍。
首先，我们需要准备所需的试剂和器材，包括小鼠大脑皮层组织、培养基、胰蛋白酶、离心管、培养皿等。
接下来，按照以下步骤进行操作：1.取出生长良好的小鼠，迅速断头取出大脑，放入预冷的培养基中。
2.在解剖镜下剥离大脑皮层，剪碎成1mm3左右的组织块。
3.加入适量胰蛋白酶进行消化，吹打均匀后置于37℃恒温摇床中消化15分钟。
4.加入适量培养基终止消化，离心收集细胞沉淀。
5.用培养基重悬细胞沉淀，过滤去除组织残渣，将细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的培养皿中。
6.置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，观察细胞生长状况。
通过上述操作，我们可以成功分离和培养小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞。
在培养过程中，需要注意观察细胞的生长状况和形态，以及细胞的纯度。
同时，也需要对培养基的成分和更换频率进行合理调控，以保证细胞的正常生长和增殖。
篇21.引言：介绍小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的重要性和研究背景。
2.材料与方法：详细阐述小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养过程，包括所需的试剂、器材、具体操作步骤等。
3.结果：描述细胞分离和培养的结果，包括细胞的形态、生长情况、纯度等。
4.讨论：对分离和培养过程中可能出现的问题进行分析，并对实验结果的可靠性和有效性进行评估。
星形胶质细胞和小胶质细胞培养
星形胶质细胞和小胶质细胞培养文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上，使用1）于细胞培养前1d，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO2前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0.25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。
分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。
大鼠大脑皮质神经元的原代培养
大鼠大脑皮质神经元的原代培养【摘要】目的探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法。
方法体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元，应用免疫细胞化学法及电子显微镜鉴定神经元。
结果用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达85%，生长状态较佳。
结论以Neurobasal-A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳，纯度较高，是体外研究神经系统相关理论的良好模型。
【关键词】大脑皮质; 神经元; 疾病模型，动物；细胞，培养的ABSTRACT: Objective To establish a primary culture method of the rat cortical neurons. Methods Primary culture of cortical neurons was made from newborn rats. Immunocytochemical and electronic micoscopic methods were used to identify the cultured neurons. Results The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 grew quite well and the purity was about 85%. Conclusion The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 medium are active and rather pure and could be a good model for research of the nervous system.KEY WORDS: cerebral cortex; neurous; disease models，animal; cells，cultured; nuride中枢神经系统的各种疾病如缺氧缺血性脑病、中风等对大脑皮质神经元均有不同程度的损伤，为研究其具体的作用机理及防治措施，建立合适的体内外模型至关重要。
小鼠原代星形胶质、神经元和小胶质细胞培养方法
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大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01
一、试剂
1) Poly-L-lysine（Sigma,P2636）
2) DMEM（Invitrogen,11995-065）
3) FBS（Invitroge,10099-141）
4) HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）
5) 0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）
6) DPBS（HyClone，SH30028.01B）
7) dd H2O
8) 75％酒精
二、器械
1)
手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，
WA3050）、显微剪x1
2) 100 ml小烧杯
3) 200目不锈钢筛
4) 细胞计数器（求精）
5) 50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）
6) 25ml培养瓶（Corning，430639）或75ml培养瓶（Corning，430641）
7) 100ml玻璃瓶（蜀牛）
8) 直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）
9) 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）
10) 过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）
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11) 注射器：50ml、5ml各 1
12) Pipette and pipette tips
13) 冰袋、手套、口罩
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Day 1
1、消毒
1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干
待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、包被培养板
2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100μg/ml。
2.3 以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。25ml培养瓶：3ml；
75ml培养瓶：8ml。过夜。
3、配置培养基、消化酶
3.1 DMEM with 10% FBS
FBS：DMEM=1：10
取FBS 8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。
3.2 0.125％胰酶
取0.25％Trypsin-EDTA,用DPBS稀释2倍。
将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。
4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，
打开紫外线灯消毒30分钟。
Day 2
1、消毒
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打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、洗板
用ddH2O洗涤3 x 5 min，放入培养箱中晾干。
3、解剖新生鼠（所有操作在冰袋上进行）
3.1 将出生24小时之内的新生鼠在100ml烧杯中用75%酒精浸泡5min。
3.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
3.3 取2个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。
3.4 剪去新生鼠的头，将头放入一个培养皿中。
3.5 用眼科剪把新生鼠头骨剪开，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的
培养皿中（将所有的新生鼠都同样处理）。
3.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好
的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。
3.7 将分离好的脑膜用显微剪剪碎脑组织，约1mm3。
4、接种细胞
4.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。
4.2 每支离心管加入3 ml 0.125％胰酶，摇匀，37℃消化15分钟（为增加接
触面积消化更充分可将离心管平放，也可以用60 mm培养皿消化。）
4.3 消化期间整理操作台。
4.4 消化15min后，用移液管除去胰酶，每支离心管加入2 ml 10％ FBS/DMEM
终止消化。
4.5 吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的
15ml离心管中。下面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10％ FBS/DMEM吹
打20次，重复上面的步骤。一共这样分次吹打3次。3次之后如果还有团块在
下面，果断丢弃。（吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很
缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。）
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4.6 过筛网至60 mm培养皿中。
4.7 将培养皿中液体移入2支15 ml离心管中。
4.8 离心：800g/min,5min。
4.9 弃上清，沉淀的细胞加10％FBS/DMEM 3ml重悬，轻柔吹打100次（具体
吹打次数据细胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次
数）。
4.10 用细胞计数板计数：细胞浓度 = (4个大格细胞总数/4) × 104 /ml
4.11 调浓度，接种。接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈
摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。要
左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度）。
具体细胞接种数值：
培养液体积（ml/瓶） 细胞密度（个/ml） 总细胞数（个/瓶）
25cm2培养瓶 4ml 1x106 4x10
6
75 cm2培养瓶 15ml 1x106 6-8x10
6
5、消毒
实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精
灯，打开紫外线灯消毒30分钟。
6、换液
细胞种植成功后24小时全量换液，以后每天观察细胞生长状态，每 3天半量换
液。注意：换液前要将10%FBS/DMEM放入37℃细胞培养箱中预热半小时。
7、传代
7.1待细胞长到第10天或看到细胞细胞爬满培养瓶的90%左右时，在37℃恒温
摇床200g/min震荡12-14小时，全量换液。
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7.2震荡过后，弃培养基，DPBS洗涤2-3次，加入适量0.25%胰酶，37℃消化
1-3min（以镜下看到细胞突触回缩为最佳）。
7.3加入2ml培养基中和胰酶，用移液管轻轻吹打细胞壁，使贴壁细胞脱落。
7.4将培养基移入15ml离心管中，200g/min离心5min，弃上清。
7.5加入新的培养基，吹打100次，使细胞散开。
7.6将细胞移入培养皿中，孵箱培养10-15min后，将皿中培养液移至新的培养
瓶中（不用包被）。
7.7每天观察细胞生长状态，每3天半量换液，待细胞爬满培养瓶的90%左右，
可继续传代或消化后将细胞接种在爬片中，进行下一步实验。
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可
以获得应有的回报）