第05章-新药临床前毒理学评价-第3节-特殊毒性
新药临床前毒理学研究
引言概述：新药临床前毒理学研究是药物研发过程中至关重要的一环。
通过对新药在动物体内的毒理学特性和安全性进行评估，可以为其进一步的临床试验和上市提供科学依据。
本文将从毒理学研究的目的、研究内容、实验方法、数据分析以及应用前景等方面综述新药临床前毒理学研究的重要性和相关内容。
一、毒理学研究的目的1.评估新药对生物体的潜在危害性2.确定新药的安全剂量范围3.预测新药在人体内的代谢和排泄途径4.制定药物给药方案和用药指导二、毒理学研究的内容1.急性毒性研究a.定义急性毒性指标和评估标准b.通过动物实验确定新药的急性毒性LD50值c.分析急性毒性实验结果2.亚急性和亚慢性毒性研究a.设计长期给药试验方案b.分析药物在长期内对动物生理和生化参数的影响c.评估新药在动物体内的累积毒性3.慢性毒性和致癌性研究a.设计长期致癌试验方案b.评估新药对动物的慢性毒性和致癌潜能c.分析动物实验结果，判断人类的致癌风险4.生殖和发育毒性研究a.评估新药对动物生殖系统的影响b.分析新药对动物繁殖和发育的潜在风险c.预测新药在人类中的生殖和发育效应5.免疫和致敏毒性研究a.评估新药对动物免疫系统的影响b.分析新药对动物过敏反应和免疫功能的潜在影响c.预测新药在人类中的免疫和致敏毒性三、实验方法1.动物模型的选择和建立2.药物给药途径和剂量的确定3.动物观察和记录方法4.生理和生化参数的测定5.病理组织学分析方法四、数据分析1.统计分析方法的选择2.数据可视化和解读3.制定毒性风险评估报告五、应用前景1.提高新药研发的安全性和效率2.预测新药在人体内的药代动力学和薄弱环节3.优化给药方案，制定个体化用药策略4.为新药上市提供科学依据和合规证据5.促进临床药物监管和药物安全监测体系的建立总结：新药临床前毒理学研究是新药研发不可或缺的环节，通过对药物在动物体内的毒理学特性和安全性进行评估，可以为进一步的临床试验和药物上市提供科学依据。
新药的临床前研究与评价分析
新药注册分类：15 类 1类：未在国内外上市销售的疫苗 2类：DNA疫苗 3类：已上市销售疫苗变更新的佐剂，偶合疫苗变更新的载体 4类：由非纯化或全细胞(细菌、病毒等)疫苗改为纯化或者组份疫苗
5类：采用未经国内批准的菌毒种生产的疫苗
6类：已在国外上市销售但未在国内上市销售的疫苗 7类：采用国内已上市销售的疫苗制备的结合疫苗或者联合疫苗
请各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局）加强对辖区 内药物非临床安全性评价研究的监督管理，并通知本辖区内药物非临床安全性评价 研究机构和相应药品研发机构按照以上要求，严格执行GLP。
国家食品药品监督管理局 二○○六年十一月二十日
药品临床前试验管理规范 （good laboratory practice ，GLP）
也称药物非临床研究质量管理规范 GLP是对从事实验研究的规划设计、执行实施、 管理监督和记录报告等实验室组织管理、工作方法 和有关条件所提出的法规性文件。 它主要是针对有关药品、食品添加剂、农药、化 学试剂、化妆品及其他医用物品的动物试验。
药品临床前试验管理规范 （ GLP）
为毒性评价而制定的法规，目的在于严格控制药品 安全性评价的各个环节，包括严格控制可能影响实验结 果准确性的各种主、客观因素，如保证实验研究人员具 备一定素质、实验设计慎密合理、各种实验条件合格、 数据完整准确以及总结资料科学真实等。
新药注册分类：15 类
1类：未在国内外上市销售的生物制品
2类：单克隆抗体 3类：基因治疗、体细胞治疗及其制品
4类：变态反应原制品
5类：由人或动物组织或体液提取、或通过发酵制备的具有生物活性的多组份制品 6类：由已上市销售生物制品组成新的复方制品
7类：已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的生物制品
新药研发临床前安全性评价 PPT
2019/11/22
17
急性毒性研究试验方法
最大耐受量法 最大给药量法 半数致死量（ＬＤ５０）法 固定剂量法 上下法（阶梯法，序贯法） 近似致死剂量法 累积剂量设计法（金字塔法）2019/11/源自218长期毒性研究
相关动物 给药途径 剂量 毒代动力学——药代研究在毒理学研究的延伸 阶段性——以不同给药期限的长期毒性研究来 分别支持药物进入Ⅰ 期、Ⅱ期或Ⅲ期临床试验 （生产）
16
急性毒性研究
最大无反应剂量
未见反应剂量（NOEL） ：No Observed Effect Level 未见不良反应剂量（NOAEL）： No Observed Adverse
Effect Level
最小毒性反应剂量 最大耐受量（MTD）：Maximal Tolerance Dose 最小致死剂量（MLD）：Minimal Lethal Dose 半数致死量（LD50）：Median Lethal Dose
次要药效学（Secondary Pharmacodynamic ）
安全药理学（Safety Pharmacology ）
中枢神经系统
心血管系统
呼吸系统
2019/11/22
8
一般药理研究的特殊情况
追加的 补充的 可免做的
2019/11/22
9
药代动力学研究
药物在体内的处置，ADME的过程及特点 吸收（Absorption） 分布（Distribution） 代谢（Metabolism） 排泄（Excretion）
2019/11/22
31
非临床安全性评价的主要不同
生物制品
小分子化合物
1. 科学的，“case-by-case” 的 设计思路
新药研发临床前安全性评价
评价目的
1. 确定潜在的毒性靶器官和毒性反应出现的时
间、性质、程度及其可逆性
2. 确定临床监测的安全性参数 3. 推算人体使用的安全起始剂量以及随后的剂
量递增方案
2019/1/16
4
一般原则
•具体问题具体分析——品种特点 •最大限度暴露毒性（如果临床上存在某些方面的安全 性担忧时则应进行该方面的非临床安全性研究） •执行GLP •药理毒理研究的整体性、综合性、阶段性 •说明书：“严进”、“宽进”
溶血及红细胞凝聚
–
免疫性溶血——Ⅱ型和 Ⅲ型过敏反应 非免疫性溶血
23
2019/1/16
刺激性
制剂 阴性对照 皮肤刺激性 注射给药部位刺激性 眼刺激性 其他途径给药部位刺激性
2019/1/16
24
过敏性
注射给药
全身主动过敏试验（ASA） 皮肤被动过敏试验（PCA）
经皮给药
豚鼠最大化试验（GPMT） Buehler试验（BT）
过敏反应-人源蛋白豚鼠价值很小，尚无可靠手段
2019/1/16 28
遗传毒性（致突变）研究
•鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验 （Ames试验）
•阴性及阳性对照 •S9代谢激活
•中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）染色体畸变试验
•空白、溶剂、阳性对照 •S9代谢激活
•啮齿动物（小鼠）微核试验
•阴性及阳性对照
药物与血浆蛋白的结合
代谢转化试验 对药物代谢酶活性的影响
2019/1/16 12
主要药代动力学参数
血药浓度－时间曲线下面积（AUC）
半衰期（t1/2）
吸收速率常数（Ka） 消除速率常数（Ke） 峰浓度（Cmax） 达峰时间（Tmax）
新药的临床前研究与评价
常用成年动物 2. 动物 年龄 幼年动物（发育、内分泌）
衰老动物，果蝇（抗衰老） 性别：雌雄不限，雌雄各半，单性别（热板法♀） 体重：与年龄有关，体重相近 种属：家兔和小鼠（不宜用于呼吸循环系统试验）
阿片类（猴犬兔中枢抑制；猫小鼠中枢兴奋） 品系：肿瘤试验（肝癌DBA/2；肺癌C57）
新药注册分类：9 类
1类：未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效成份及其制剂 2类：新发现的药材及其制剂 3类：新的中药材代用品 4类：药材新的药用部位及其制剂 5类：未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效部位及其制剂 6类：未在国内上市销售的中药、天然药物复方制剂 7类：改变国内已上市销售中药、天然药物给药途径的制剂 8类：改变国内已上市销售中药、天然药物剂型的制剂 9类：仿制药
新药的分类 Classification of New Drugs
按国家《新药审批办法》规定分类: 中药（传统药,天然药物）
（traditional Chinese medicine） 化学药品（西药、现代药）
（western drug、chemicals） 生物制品（biologicals）
合成检验 与筛选
花费10亿元美金
新药研发特点
❖ 投资高 ❖ 周期长 ❖ 风险高 ❖ 利润高 ❖ 竞争激烈
新药的临床前研究
1. 药学研究 2. 主要药效学研究 3. 安全性研究 4. 药动学研究
基础药动学研究
特殊毒性研究
全身毒性、局部毒性研究
有效性研究 质量标准、稳定性研究
药效学研究
制备工艺研究
新药发现、选题、设计处方
新药临床前药效学评价培训课件
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临床前处，请联理系学网站评或价本人主删除要。内容
有急性毒性 长期毒性 特殊毒性 局部用药毒性 过敏试验 刺激性试验 药物依赖性试验
• 寻找并发现新药后，就要根据新药评价的内容逐一进行研究。 根据我国《药品注册管理办法》确定该完成哪些内容的实验 研究。新药评价的内容可按学科来分和药品注册管理办法的 具体要求来分。
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新药评价按学科分
1. 药学评价 2. 临床前药理学评价 3. 临床前毒理学评价 4. 临床药理学评价
病的治疗作用有相关性。
药效学模型需符合以下基本要求：
➢ 模型对标准药物有敏感的剂量依赖性特征。
➢ 受试物在模型中表现出的药效作用能与其临床的治疗作用 相关联。
➢ 模型应该有选择性，即受试物在模型中的治疗指征与对其 它指征的作用有明显区别，阳性数据可以反映其对病人的 治疗作用。
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药学评价主要内容
名称 结构 分子式 理化性质 合成路线和工艺 制剂处方和制作工艺
定性鉴别 含量测定 稳定性试验 质量标准 起草说明等
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新药研发临床前安全性评价 PPT资料共35页
30.11.2019
22
局部用药特殊毒性研究
刺激性 给药部位的可逆性炎症改变
过敏性（变态反应或超敏反应）
特异性免疫反应，表现为组织损伤或生理功能紊乱，异常或病理性的
Ⅰ型，快发或速发过敏型，IgE介导 Ⅱ型，细胞毒型或溶细胞型，IgG介导 Ⅲ型，免疫复合物型或血管炎型，IgG、IgM介导 Ⅳ型，迟发型或结核菌素型，T淋巴细胞介导 光敏性
新药的非临床安全性评价
———广州蓝韵医药研究有限公司 专注中药新药及保健食品研发技术服务
新药的安全性及有效性
药理学研究
主要药效学 一般药理学 药代动力学
毒理学研究
30.11.2019
2
毒理学研究
急性毒性 长期毒性 局部特殊毒性 免疫毒性 遗传毒性 生殖毒性 致癌性 依赖性 复方制剂
ห้องสมุดไป่ตู้
30.11.2019
30.11.2019
5
何谓具体问题具体分析？
CASE（要素）
产品的设计思路 分子结构 作用机制、活性特点 安全性担忧 相关动物 免疫原性 临床适应症、用药人群 临床用药周期 已有相关安全性信息 技术、经济可行性等等
CASE（评价） 研究内容（重点）
研究阶段性 试验设计 结果评价
30.11.2019
20
支持临床疗程超过2 周的药物II 期和III 期临床试验所需动 物长期毒性研究的最短给药期限
30.11.2019
21
检测指标
常规指标（一般症状、体重、摄食量） 血液学指标 ：10项 血液生化学指标 ：12项（非啮齿类16项） 尿液分析指标：9项（非啮齿类） 体温、血压、呼吸、心电图及眼科检查（非啮 齿类） 组织病理学检查
新药毒理学安全性评价
化药毒理、药代研究增加的技术要求
• 注册分类1： - 明确了对毒代动力学的要求 - 光学异构体：消旋体与单一异构体的比 较毒理学（急毒）。根据消旋体安全可 能需提供单一异构体3个月内或其它毒性 （如生殖毒性）
• 注册分类2：首创改途径，必要时与原途 径比较PK、局部毒性或长毒
• 注册分类3：境外上市改途径，应重视辅 料对吸收或毒性影响，必要时进行PK或 相关毒性
• 注册分类6“未在国内上市销售的由中药、天然药物制成的 复方制剂”
三种情况： 传统中药复方制剂: 工艺、处方、功能主治属传统，处方中
药材具法定标准，且主治病证在国家中成药标准中未收载 一般可免药理、毒理研究，但含法定毒性及现代毒理证明 为有毒药材，或含有十八反、十九畏，应进行毒理试验。 现代中药复方制剂：主要药效、急毒和长毒。含无法定标准 的药用物质，按分类2要求。若方中含天然药物、有效成 分或化学药品，则应研究其药理、毒理相互作用。 天然药物制成的复方制剂：多组分药效、毒理相互影响， 即拆方研究。若含无法定标准的药用物质，应按分类2要 求。
- 化药可不进行试验：不改变给药途径的剂型：胶囊片剂；大-小针（除注射剂安全试验）
- 给药途径改变，如局部-全身、 肌注-静脉，可能需 进行药代、毒性等试验
- 改变酸根、碱基、特殊剂型的毒性研究依情况定 - 中药局部外用，不含毒性药材，一般可不进行长毒，
但应注意局部刺激、过敏，光敏。如果出现全身毒性、 应考虑长毒
化药毒理、药代研究增加的技术要求
• 注册分类4： 改酸根、碱基（或者金属元素）与已上 市药比较PK、一般药理和急毒，以反映 差异；必要时提供长毒和其它药理毒理 研究。
• 注册分类5： 速、缓、控释制剂应与普通制剂（最好 为原发厂家产品）比较单或多次给药的 PK
新药研发临床前安全性评价
溶血及红细胞凝聚
免疫性溶血——Ⅱ型和 Ⅲ型过敏反应 非免疫性溶血
2023/10/12
22
刺激性
制剂 阴性对照 皮肤刺激性 注射给药部位刺激性 眼刺激性 其他途径给药部位刺激性
2023/10/12
23
过敏性
注射给药
全身主动过敏试验ASA 皮肤被动过敏试验PCA
新药的安全性及有效性
❖药理学研究
主要药效学 一般药理学 药代动力学
❖毒理学研究
2023/10/12
1
毒理学研究
急性毒性 长期毒性 局部特殊毒性 免疫毒性 遗传毒性 生殖毒性 致癌性 依赖性 复方制剂
2023/10/12
2
评价目的
1. 确定潜在的毒性靶器官和毒性反应出现的时 间、性质、程度及其可逆性
毒理学研究
急性毒性研究
Ä一次或24小时内多次给予 •动物 •给药途径 •阴性对照组 •判断安全范围
2023/10/12
量
未见反应剂量NOEL ：No Observed Effect Level 未见不良反应剂量NOAEL： No Observed Adverse Effect
哺乳动物培养细胞恶性转化试验 小鼠肿瘤诱发试验
v 长期致癌试验
2023/10/12
30
药物依赖性研究
Ä具有精神神经作用的药物需要提供 Ø 身体依赖性试
Q镇痛药、镇静催眠药 Ø催促试验 Ø诱导试验 Ø自然戒断试验或替代试验 Ø 精神依赖性试验 Ø自身给药
2023/10/12
31
非临床安全性评价的主要不同
Ø 次要药效学Secondary Pharmacodynamic Ø 安全药理学Safety Pharmacology
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2011-12-161一．概论二．急性毒性实验三．长期毒性实验四．特殊毒性实验
五．其它毒性实验六．药品非临床研究质量管理规范（GLP）
中国药科大学临床药学教研室周晓辉
1.致突变实验2.生殖毒性(致畸)实验3.致癌性实验
目的意义y研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起衰老、畸胎及肿瘤等y特殊毒性实验存在着种属差异性y定性差异y定量差异定性差异y反应停：对家兔和７种灵长类动物致畸，但至少对10种品系大鼠、15种品系小鼠、2种家犬、３种田鼠和８种灵长类动物不致畸
y可的松：对家兔和小鼠强力致畸，但对大鼠不致畸
y硫唑嘌呤：对大鼠不致畸，但对家兔强致畸y氨磺丁脲：引起大鼠、小鼠眼畸形，但对家兔却引起脸和内脏畸形
定量差异y致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显表1人类与动物致畸剂量比较
y药物最低致畸剂量（/kg/d) 人与动物比值y人动物
y反应停0.5‐1.0mg 兔2.5mg 5‐2.5y氨基喋呤50μg 大鼠100μg 2y氨甲喋呤42μg 大鼠200μg 4.8y乙烯雌酚20‐80μg 恒河猴200μg 10‐2.5y苯妥英钠2mg 小鼠50mg 25
1.细菌回复实验(Ames实验）+哺乳动物培养细胞基因突变实验+果蝇伴性隐性致死实验2.体外哺乳动物细胞染色体畸变实验+啮齿动物显性致死实验+精原细胞染色体畸变实验3.小鼠骨髓细胞微核实验+程序外DNA合成(UDS)实验+SOS显色实验2011-12-1621、细菌回复实验(Ames实验）y菌株:组胺酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌,采用TA98、100、1535、1537/97、102,检定符合要求,‐80℃或液氮冻存备用
y剂量：由药物对细菌的毒性和溶解度决定y最高剂量：a.一般5mg／皿，b.最高溶解度，c.根据杀菌情况确定最大浓度y最低剂量：一般1μg／皿或0.1μg／皿。y剂量级：5个以上
y代谢活化：加大鼠肝微粒体酶组分(S9)和不加S9平行条件下测试
y对照：阴性、阳性对照和S9对照y方法：标准平板法或预培养法，48h观察结果，如菌落太小，可继续培养并延长到72h观察结果。每一浓度至少三皿，实验至少重复一次
y结果判定：y①受试物所诱发的回变菌落数(ｘ±ｓ)增加，超过对照2倍，量‐‐效关系；②某测试点超过对照2倍以上，呈现可重复的并有统计学意义的增加。
y符合上述任何一条即可判为阳性
y如某些药物有明显杀菌作用，可改用体外哺乳动物细胞染色体畸变实验
y如某些阳性或可疑阳性时，可选择体外哺乳动物细胞染色体畸变实验或果蝇伴性隐性致死实验
2、体外哺乳动物细胞染色体畸变实验y细胞:建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL)或卵巢细胞(CHO),需定期检查核型和有无支原体等污染。‐80℃或液氮冻存
剂量高剂量以％细胞生长抑制浓度为基准y剂量：高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准，
一般最高不要超过5mg/ml。溶解受限时可采用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释法。至少3个剂量组，每剂量组设3个平行样本
y代谢活化：应用诱导剂处理后的肝微粒体酶组分（S9）进行体外代谢活化实验
y药物作用时间:药物和细胞接触非活化组作用24h和32h收获细胞,代谢活化组作用6小时以上
y标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分别在24h和32h收获细胞
y对照：空白、溶剂、阳性和Ｓ９对照y镜检：每种浓度至少观察200个中期分裂象，在油镜下分别记录染色体的结构畸变，多倍体以及畸变细胞数和畸变类型
y受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相关;CHL系统判定如下:
y畸变率<5%阴性(‐)y畸变率≥5%可疑(±)y畸变率≥10%阳性(+)y畸变率≥20%阳性(++)明显y畸变率≥50%阳性(+++)强y注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致死实验或精原细胞染色体畸变实验2011-12-1633、小鼠骨髓细胞微核实验y动物：小鼠，多用雄性，每组至少６只性成熟雄性小鼠
y给药途径与方法：尽可能和临床拟用途径相同，一般为单次给药或诱导给药，必要时可多次给药
y骨髓采样时间：通过预试，在12‐72h不同时间内，取5个作用点，找出合适采样时间，如无差别一般采用24h采样
y剂量：≥3个，最高剂量1/2 LD50y对照组：用溶媒作阴性对照，用已知能诱发微核增加的物质作阳性对照，环磷酰胺多见
y标本制作：脱颈椎处死、取骨髓、涂片、Giemsa染色
y镜检：每只动物至少计数2000个嗜多染红细胞，染色观察其微核出现的频度及嗜多染红Giemsa染色，观察其微核出现的频度及嗜多染红细胞和正常红细胞的比率。
y判定：y1.受试物所诱发的微核率呈剂量相关增加y2.某一测试点微核增加可重复并有统计学意义y符合上述一条即可判为阳性
y注意：y1.对Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果的药物必须用荧光染色以进一步性结果的药物，必须用荧光染色以进一步肯定或否定阳性结果
y2.不易通过骨髓屏障的药物，可补充用哺乳动物胎肝细胞微核实验进一步研究
1.胚胎胎仔发育毒性试验（致畸胚胎胎仔发育毒性试致敏感期毒性实验）
2.出生前与出生后发育毒性试验（围产期毒性实验）
3.生育力及早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性实验）
1、致畸敏感期毒性实验
y动物：首选Wistar或SD大鼠，也可用小鼠、地鼠或家兔
yＩ类药物最好增加家兔或猪、猴、狗之一动物数每组孕大小鼠只孕兔y动物数：每组孕大、小鼠≥20只，孕兔≥12只y剂量：高、中、低三个剂量，限度剂量为1g/kg。y高剂量产生母体毒性，或为最大给药量。y摄食量减少，体重增加缓慢或下降,阴道流血、流产等均是毒性反应表现。
y低剂量无母体和胚胎毒性
y给药途径：同推荐临床给药途径y静脉给药一般不轻易采用腹腔注射代替y口服制剂除灌胃外，还可在严格测定其消耗量的前提下自由摄取或拌入饲料
y染毒时期：于胚胎器官形成期连续给药y大鼠孕后6‐15天y小鼠孕后6‐15天y家兔孕后6‐18天y对照：必须设溶剂对照；必要时设阳性对照2011-12-164y观察和检查：y查到精子或阴栓作为妊娠零天，记录实验动物症状，大鼠于0、3、7、10、13、16、20天称量体重，２０天处死记录孕鼠重黄体数死胎数（着床数吸收胎死，记录孕鼠重、黄体数、死胎数（着床数、吸收胎、早期死胎、晚期死胎）、活胎数、活胎重、性别、外观异常等；y约1/2胎仔固定于福尔马林+Bouin氏液，作内脏检查；y另1/2固定于95%洒精作骨骼畸形检查y报告：将数据列成表，提供：y母体：药物对孕期和胚胎的影响，包括孕鼠数及体重变化，黄体总数及均数，活胎总数及均数，活胎重，性别，死胎总数及着床数吸收胎早期和晚期死胎等死胎总数及着床数，吸收胎，早期和晚期死胎等；
y胎仔：药物对各器官的影响，包括在外观和内部检查中发现的各种畸形；药物对胎仔骨骼发育的影响，包括头颅骨、胸骨、前、后肢骨和其它骨骼的骨化程度，变异和畸形等
y判定：各项数据经统计（计数/计量资料混杂、复杂）处理后判定药物的胚胎毒性和致畸潜力
11.长期致癌实验:啮齿类致癌实验2.短期致癌实验•叙利亚地鼠胚胎细胞体外恶性转化实验•小鼠肺肿瘤诱发短期实验
1、啮齿类致癌实验（RCB）(长期)
y动物：幼年小、大鼠，♀♂各半。每组１００只y剂量：≥３个，低剂量１‐３倍的拟用临床剂量，其余剂量可根据药理毒理作用等因素综合考虑
y对照：空白、溶媒或赋形剂对照。y实验期限：大鼠２年，小鼠1.5年。y给药途径：同临床拟用途径y观察与检查：观察记录一般情况，肉眼观察到肿瘤病变时，取各器官系统做病检
y评定：根据各组肿瘤发生率、潜伏期和多发性等做出全面的科学评价
2、叙利亚地鼠胚胎细胞体外恶性转化实验(短期)
y剂量：≥3组，高剂量一般以抑制50%集落生长浓度为基准
y对照：空白、溶媒、阴性和阳性对照y药物接触时间：药品一般和细胞接触24h，然后再培养10‐20天
y观察报告：将细胞固定、染色、分别计数每皿集落数，转化集落数
y集落形成率(%)＝集落数/接种细胞数*100%y集落转化率(%)＝转化集落数/集落数*100%
y判定：符合下述一条件者可判为阳性，否则为阴性y1.有明确量效关系；若无量效关系但在２个浓度中发生细胞转化y2.若无量效关系，但在≥２个浓度中发生细胞转化；y3.在单一剂量下出现≥３个转化集落时y如判定有困难时，应进一步对细胞进行：
y核型分析y半固体琼脂培养基集落形成率测定
y动物接种致瘤实验