某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响'

药物生物技Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００１，８（６）；３３９一３４１３３９

某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响’ 李兴‘，林哲甫２ （１．贵阳医学院，贵阳５５０００４：２．中山大学，广州５１０２７５）

，，“温度恒定时Ａ，菠萝中菠萝蛋白。的热失活过＊遵循一级蜕变规律：争一Ｋａ一，失活半寿期是常数，可以用作衡公菠萝蛋白醉热稳定性的指标。某些较酸盐和金属离子能明显延长菠萝蛋白酶在较高ａ度下的半寿期。这些物质的稳定化作用可能是由于它们影响了溶剂结构和疏水相互作用，从而维护了酶分子的活性三维构象的结果。 关健词菠萝蛋白酶；热稳定性 中图分类号：０５５文献标识码：Ａ文众绮号：１００５－８９１５（２００１）０６－０３３９－０３

关皿。

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酶作为一种生物催化剂，其催化效率非常高，催化作用专一，作用条件温和。但是，酶作为蛋白质，凡是能使蛋白质变性的因素，如强碱、强酸、高温等条件都能使酶失去活性。即使没有这些变性因素的存在，酶在常温、常压下也会逐渐失去活力。这是因为不管在任何温度下，总会有少量酶分子处于较高能量状态，这些分子会越过能障成为非活性分子川，称之为热失活。热失活是酶制剂在运输、储藏过程中失活的主要原因。随着科学技术的发展，酶在生产、医学和科研领域中得到了广泛应用。但是，酶易失活的缺点极大地限制了其优越性的发挥和实用性。因此，提高酶的热稳定性、延长酶的储藏寿命就成了一个ＥＩＲ待解决的课题。国内外科学工作者对这一课题的研究可归纳为４个方面：嗜热有机体中酶的研究［ｘ，３１蛋白质变性的研究川、蛋白质分子的化学修饰Ｌ５１添加剂对酶的保护作用１６１。目前，有关添加剂对酶的保护作用的研究，还是一种经验性很强的工作，缺乏理论指导，但是这种经验性工作非常必要，它为延常酶的使用寿命提供了可能性。对于价格昂贵而又缺乏稳定性的酶来说，尤其重要。同时也为理论研究提供信息和研究线索。 本文借用动力学方法，以菠萝蛋白酶的热失活半寿期为热稳定性的指标，定量研究了梭酸盐和Ｃａ２十，Ｚｎｘ士对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影

响，以期找到一种高效、可行的增强菠萝蛋白酶热稳定性的方法，

１材料和方法１．１材料 新鲜菠萝榨汁，菠萝蛋白酶活力为６２４　ＵＪｒｎｌ｝

１．２ ＇Ｘｉ定方法 测定见ＴａｋａｓｈｉＭｕｒａｃｈｉ方法［７，１３菠萝蛋白酶热撼定性实验方法 新鲜菠萝榨汁１００川加人到５５℃预保温的一定浓度梭酸盐（Ｃ，２　Ｉ或Ｚ．＂）溶液中，不同保温时间侧定菠萝蛋白酶活力，按２．１方法求出菠萝蛋白酶的半寿期口

２结果２．１菠萝蛋白酶热失活遵循动力学一级反应规律Ｌｅｔ 温度恒定时，若酶的热失活是动力学一级反＊。。一Ｋｄ＿。、斗二、｝．ｎ二．＊ｄｌ国应，即Ｅ＿，｝－＇Ｅｉ－ｉ－据如物论，则有旦岁

＝一Ｋｄ．［Ｅ，①，［Ｅ」为活性酶浓度，失活常数，将公式①转化为积分形式：Ｉｎ 。「二：今。二、、缺ａｉｒｆｉｃ，ａｔ，．，．＿工三工一、’‘””’‘甲，Ｌ卿ＪＪｄ４Ｐ７Ｔ／Ｊ　％［７ｔＬＪｒ　Ｌ仄ｒ７１’“【氏１

对ｔ作图得一过原点直线，斜率为Ｋｄ，从公式②求得酶的热失活半寿期Ａ／２一瓷。

收稿Ｆｌ期２００１一０１一１５ 作ｖ，简介辛兴（１４６７年生）、贵阳医学院讲师硕士。Ｔｅ１；０８５１一６７８０７２６

万方数据３４０药物生物技术第８卷第６期８０１５０（ｕ叫日）山日州‘１如

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作者考察了菠萝蛋白酶在４５℃、５０℃，５５℃下的热失活动力学特征，结果见图１．　３个温度下的半寿鑫（　ｈ／２）分别为４４５　ｍｉｎ，１５４　ｍｉｎ，５３　ｍｉｎａ可以判定，菠萝蛋白酶的热失活遵循动力学一级反应规律，沮度恒定时，其热失活半衰期为定值可作为衡量热稳定性的指标。在以下的结果中，菠萝蛋亡酶的热失活温度都为５５｀Ｃ　ｏ

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Ｆｉｇ　３ Ｍｏｔｗｃａｒｂｏｘｙｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｂｒｏｍｅｌａｉｎ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ２．３ Ｃａ２＇，Ｚｎ２＋对菠萝蛋白晦热德定性的影响 结果见图４，　Ｃａｔ＇　，Ｚｎ２＋对菠萝蛋自酶有一定＇Ｌｔ度的保护作用。 １６０　ｒＣｔｔ　．

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Ｆｉｇ　２　Ｉ）ｉｃａｒｂｏｘｙ！　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｂｒｏｍｅｌａｉｎ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ

维系酶分子三维构象的作用力包括：氢键、疏水相互作用、静电相互作用、范德华力，有些还包括共价二硫键，蛋白质分子不管是变性、还是增强稳定性，都是通过影响这些作用力来实现的。如Ｃａｔ＋在。一溶菌酶分子内部，通过和酶分子的梭基或拨基的静电作用，增强了酶分子各部分之间的紧密程度，因为在酶分子的疏水内环境中，静电作用是相对较强的。但总的来看，氢键、疏水相互作用在增强酶的稳定性方面起着主要作用。 （１）氢健当蛋白质受热变性时，分子中的

万方数据李兴等：某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响３４１

参考文献Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｒ　Ｅ，　Ｐａｔｒｉｃｉａ　Ａ，　Ｊｏｈｎ　Ａ　Ｒ．　Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ　ｏｆ　ｐｒｏ－ｔｅｉｎｃｒｔａｓ－ｌｉｎｋｓ［Ｊ］．　Ｂｉｃｒｈｅｍｉｓｒｒｙ，　１９７８，１７：１４７９．Ｚｕｂｅｒ　Ｈ．　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｄａｐｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒａｔｅ　ｄｅｈｙｄｍｇｅｎ－［Ｊ］Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ａｓｐｅｃｔｓ，　Ｂｔｏｐｈｙｓｃｈｅｍ，　１９８８．２９（１－２）：１７１Ｆｅｍｔａａａ　Ａ　Ｓ１ｎＱ：ｎｅ　ａｎｄ　ｍｂｉｌｉｔｙｄ　ｄｒａｎｃ树ｌｋ　－ｙ－－．　Ｓｎ　ｔｂ－ｍｔｆ｝ｒｒｄｒｙｎ［Ｊ］．　Ｂａｐａｖｄ　ｍ，　１９９ａ２９（１－２）：１８１Ｋｅｐｉｓ　Ｉ　Ｔ，　Ｎｙｂｅｒｇ　Ｋ．　Ｃｍｔｒｉｂｕｏｏｎ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｔｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９８８，３３３：７８４ＰａｕｌＳＤ，Ｆｉｎｎ　Ｗ，　Ｐｅｒｔ　Ｂ　Ｗ，　ｅｔ以．　Ｓｔａｂｉｌｉｍｔｉｏｎ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ切ｃｕ，ｎｐｌｅ，ｄｎｇ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｄ衍ｔｈｅｍ，司ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｂｉｃｒｈｉｍ　＆妙ｙ，　Ａｒｉａ，　１９７４，　３５０（２）：４３２ｌ；ｏｌａｃｏ　Ｃ．　Ｓｅｎ氏Ｔｈａｎｇａｃｅｌｕ　Ｍ，　ｅａ　ａｔ．　Ｅａｍｒｄｉｎａ，ｙ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ

ｏｆ　Ｅｎｘｙ，ｎｅｓ　Ｄｒｉｅｄ　ｉｎ　Ｔｒｅｈａｋ，ｓｅ：　Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．　Ｂｉａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．　Ｖｏｌ　１０，　Ｓｅｐｒｅｍｂｒｒ　．１９９２．１００７．Ｍｕｒａｃｈｉ　Ｔ．　Ａ　ｙ阮ｒａｓｅｉｒＫ妇ｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｍ］．Ｉｉｉ＇　Ｍｅｔｈｏｄ，　ｉｓＥｎｚｙｍａｌｏｇｙ＂，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐ－，　１９７０，　Ｖｏｌ．　Ｘ　Ｉ　Ｘ，Ｗ　ＢＪａｋｏｄｙ已，２７３Ｗｉｌｅｙ　Ｊ，　Ｓｏｎｓ．　Ｏｎ　ｔｈｅ　ＴｈｅｒｔｎａＬ　Ｄｅｉ：ａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　ＯｘＬ－ｄａｓｅ　［Ｊ］．　Ｂｉａｅｔｈｎｏｆａｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉ，ｔｅｒｉｒｔｇ，１９８２＇　Ｖｏｌ．　Ｘ　ＸＩ　Ｖ：１９１１．Ｂａｃｋ　Ｊ　Ｆ．Ｏａｋｅｎｆｕｌｌ　Ｄ．　Ｓｎｄｔｈ　Ｍ　Ｂ．　Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ

川叫图

氢键结构发生变形，溶剂水分子作为氢键的受体或供体，去和蛋白质分子骨架及侧链上的基团竞争形成氢键，最终导致蛋白质分子结构的崩溃。作者发现，对菠萝蛋白酶起稳定作用的物质大多都有多个ｆｌ基和梭基，能形成氢键，但它们形成氢键的能力比水小，对蛋白质分子氢键结构的破坏力也较小。 （２）跳水相互作用疏水相互作用在维系蛋白质分子三维构象中起非常重要作用，在水和水溶性有机物组成的混合溶剂中，疏水相互作用的大小取决于溶剂的结构，当这个混合溶剂中的水分子最大程度形成氢键时，可获得最大的疏水相互作用。这样看来，多经基和多狡基化合物对蛋白质分子稳定性的影响，就取决于这些物质对水分子结构的影响。实验表明，琉水相互作用在蔗糖或甘油溶液中比在纯水中强。但是，蔗糖或甘油又是如何影响水分子结构呢？Ｔａｌｃ等提出了一种“专一水化模型”，他们认为如果多羚基化合物中ＯＨ的取向使得它能和水分子形成氢键它会在自己周围诱导形成一个由氢键连接起来的水化层，这样水分子的结构更有序，同时增强了非极性基团之间的疏水相互作用。ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓｕｇａｒｓ　ａｎｄ　Ｐｏｙｏｌｓ［Ｊ］

ｉｒｒｒｙ，１９７９，１８（２３）　：５１９１．

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｘｙｌ，　Ｃａｔ十ａｎｄ　Ｚｎ２＋　ｏｎ　Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ＳｔａｂｉｌｉｔｙＬＩ　Ｘｉｎｇｌ，　ＬＩＮ　Ｚｈｅ－ｐｕｔ（１．Ｇｕｉ　ｙｔｎｇ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｙｎｇ　５５０００４；２．Ｚｈｏｎｇ　ｓｈａｎｇ　ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ

５１０２７５）

Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｔ　ｉｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｉｓ　ｋｅｐｔ　ｃｏｎｓｔａｎｔ，ｔｈｅ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｒｕｉｔｂｒｏｍｅｌａｉｎ　ｆｏｌｌｏｗｓ、ｆｉｒｓｔ－ｏｒｄｅｒ　ｄｅｃａｙ　ｌａｗ：罕＝－Ｋｄ　＂　Ｌａｎｄ　ｉｔｓ　ｈａｌｆ－ｔｉｍｅ　ｉ・ａ　ｃｏｎｓｔａｎｔ，ｓｏ　ｔｈｅ　ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ一