烟草基因相互作用实验步骤
实验十七(2)烟草原生质体融合
弃上 清液
弃上清 液,重新 悬浮在
0.5ml CPW溶 液中
800rpm离 心3min
加入3ml CPW 培养基，用滴 管重新悬浮原 生质体
5
4、原生质体融合
（1）调整密度：用血球板计数后，将原生质体 的密度调整为106个原生质体/ml。 （2）配置PEG融合液（无菌下） PEG溶液：甘氨酸缓冲液：DMSO=8：1：1 （3）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体 积混合。
6
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml 混合原 生质体 悬浮液
加入0.2ml 高钙高pH PEG融合液
静置 10min
5min内缓慢
加入5ml W5 稀释液，轻
轻吸打混匀
重新悬浮 在0.5ml W5，静置 >10min
800rpm离 心3min， 弃上清夜
静置 >30min
7
（5）融合原生质体的观察
吸1滴融合的原生质体悬浮液于血球计数 板上，在显微镜下融合的原生质体，统计融 合率。 融合原生质体的特征： A：异源融合；B：同源融合 融合率=融合的原生质体数/观察的原生质体数
8
准备下次实验的试剂（各100ml）：
（1）2×CTAB提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0）， 2％（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巯基乙醇， 20mM EDTA
实验十七
（2）烟草原生质体融合
一、原理
PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳 水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近 原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透 吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。
在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分 子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电 荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中， 发生原生质体融合。
分子与基因工程实验
植物基因转化受体系统
指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再 生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。
具备条件：
1. 高效稳定的再生能力 2. 较高的遗传稳定性 3. 具有稳定的外植体来源 4. 对选择性抗生素敏感 5. 对农杆菌侵染有敏感性
农杆菌与外植体共培养
01
接种菌体后的外植体 02
是整个转化过程中培养基上，在
农杆菌吸附，T-DNA
外植体细胞分裂、生
的转移及整合都在这
长的同时，农杆菌在
共培养时期内完成。
外植体切口面也增殖
生长，该两者共同培
养过程称之为共培养。
Conceptions
Events An 'event' is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosome.
Transformation frequency
Independent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus.
Line
The seedlings from one transgenic cell, namely, one independent successfully transformation event, belong to one line, also are called clones.
烟草重要基因篇：10.烟草转录因子基因
2015-08，36（4）中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 117 烟草重要基因篇：10. 烟草转录因子基因闫宁，张洪博（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）转录因子（transcription factor, TF），又称反式作用因子，可特异识别并结合顺式元件的核心序列，从而调控靶基因的转录效率[1-3]。
在植物中，转录因子广泛参与生物胁迫（病害、虫害等）和非生物胁迫（低温、干旱、高温等）应答以及生长发育调控。
作为植物信号传导途径的关键环节，转录因子的调控机理一直是植物学研究的重要领域[4-5]。
1 植物转录因子概述典型的植物转录因子具有DNA结合域（DNA-binding domain）、转录调控域（transcription-regulation domain）、核定位信号（nuclear location signal）和寡聚化位点（oligomerization site）等特征结构域，一些转录因子可能缺少个别结构域[6-8]。
DNA结合域是转录因子识别并结合顺式元件的区段，在同一转录因子家族成员间具有较高保守性[6,9]。
转录调控区域是转录因子调节靶基因表达的区段，依据其生物活性有转录激活域和转录抑制域之分[10]。
核定位信号作为转录因子定位于细胞核的信号肽，是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸的区段[11]。
寡聚化位点主要影响转录因子间的相互作用及聚合体形成，对转录因子的生物活性具有重要调节作用[12-13]。
植物中存在大量转录因子，根据DNA结合域的特征可将这些转录因子分为若干家族，如MYB、WRKY、bZIP、AP2/ERF、NAC、bHLH等[14]。
转录因子在植物的生长发育及胁迫应答过程中发挥重要调控作用，MYB转录因子参与细胞周期调节及激素和环境应答反应[15]；WRKY转录因子参与植物对冻害、干旱、盐害等非生物胁迫及病原菌和虫害等生物胁迫的应答调控[16]；bZIP转录因子参与植物生长发育、种子成熟以及环境胁迫的响应过程[17]；AP2/ERF转录因子参与植物生长发育、机械损伤、病害防御以及高温干旱等环境胁迫应答[18]；NAC转录因子在植物防御寄生真菌、腐生真菌、非亲和性病原菌等生物胁迫以及干旱高盐等非生物胁迫反应中发挥调控作用[19]；bHLH转录因子参与植物形态建成、次生代谢调控以及对盐害、冷害等非生物胁迫的应答[20]。
荧光素酶基因在转化烟草中的表达
荧光素酶基因在转化烟草中的表达利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。
然后转化烟草，测定荧光素酶活性。
通过荧光素酶活性的高低判断性刺前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转化，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
技术背景1荧光素酶生物检测技术诞生于1990年，已有30年的发展史。
单荧光素酶检测系统到双荧光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。
双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引入了海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。
什么是双荧光素酶？2双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。
其中荧火虫荧光素是从萤火虫中分离得到，分子量为61 kDa；而海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36 kDa。
两种荧光素酶的区别是什么？3①底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。
②发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。
正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双荧光素酶报告实验中得到广泛应用，它们的发光原理如下所示：实验原理4Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
05
CATALOGUE
实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
02
01
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学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
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等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
01
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将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
基因相互作用的研究——基因相互作用的筛选和研究方法
基因相互作用的研究——基因相互作用的筛选和研究方法基因相互作用是指不同基因之间在发挥生物学功能的过程中发生的相互影响。
对于基因相互作用的研究可以帮助我们更好地理解复杂的生物学系统，并有望为研究一些疾病的发生机制提供新的视角。
本文将介绍基因相互作用的筛选和研究方法。
1. 基因相互作用的筛选方法1.1 组合分析法组合分析法是一种常用的筛选基因相互作用的方法，它可以通过对大量基因的组合进行筛选，找出与某种生物学特征相关的基因相互作用。
组合分析法包括两种方式：一种是简单的线性组合方法，另一种是基于机器学习的非线性组合方法。
1.2 网络和系统生物学方法网络和系统生物学方法可以使用基因调控网络和蛋白质相互作用网络来进行基因相互作用的筛选。
与使用组合分析法不同，这种方法可以考虑到基因表达和调控网络的整体特征。
2. 基因相互作用的研究方法2.1 双杂交法双杂交法是一种常用的研究基因相互作用的方法，它可以通过检测两个蛋白质是否能够与另一个中介蛋白质形成复合物来筛选出具有基因相互作用的蛋白质。
该方法应用广泛，但是需要注意的是其结果需要进一步验证和分析。
2.2 共表达分析共表达分析也是一种常用的研究基因相互作用的方法。
该方法可以通过分析不同基因在不同组织或不同条件下的表达模式，来推断基因之间的相互作用。
其优点在于可以从多个维度搜索基因相互作用，但需要注意数据质量和解释的复杂性。
2.3 CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR-Cas9基因编辑技术开辟了一种新的研究基因相互作用的方法。
通过该技术，可以精确地修改基因序列，模拟或者干预基因相互作用的过程。
尽管该技术在分析基因相互作用方面有重要应用前景，但同样需要注意其对生物体整体性的影响。
3. 结语基因相互作用的研究是一个复杂而有意义的领域，它可以加深我们对生物学系统的理解，也有望为研究某些疾病的发生机制提供新的思路。
本文介绍了基因相互作用的筛选和研究方法，希望对读者有所帮助。
《利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究》范文
《利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究》篇一利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究一、引言基因编辑技术作为现代生物学领域的一项重要突破，为研究生物体的基因组成和功能提供了全新的工具。
其中，CRISPR/Cas9系统因其高效、精确的基因编辑能力，在植物学、医学和农业等多个领域得到了广泛应用。
本氏烟草作为一种常见的植物模型，其基因编辑研究对于理解植物基因功能、改良作物品质和抗性具有重要意义。
本文旨在探讨利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草进行基因编辑的基础研究。
二、CRISPR/Cas9系统概述CRISPR/Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，通过将特定的RNA引导的Cas9蛋白切割DNA，实现精确的基因编辑。
该系统具有操作简便、效率高、成本低等优点，为植物基因编辑研究提供了强大的工具。
三、本氏烟草基因编辑的实验设计本实验以本氏烟草为研究对象，针对特定基因进行编辑。
首先，通过生物信息学分析，确定目标基因的序列和功能。
然后，设计并合成针对目标基因的CRISPR/Cas9系统组件，包括sgRNA和Cas9蛋白。
将sgRNA和Cas9蛋白共同导入本氏烟草细胞中，实现精确的基因切割和编辑。
四、实验过程与结果1. 实验材料与方法：本实验所使用的本氏烟草为常见品种，实验室自行培育。
CRISPR/Cas9系统组件通过体外合成和转基因技术导入本氏烟草细胞中。
2. 实验步骤：首先对目标基因进行生物信息学分析，确定其序列和功能。
然后设计并合成sgRNA和Cas9蛋白。
将sgRNA和Cas9蛋白共同导入本氏烟草细胞中，通过显微镜观察细胞内基因编辑过程。
最后，通过PCR、测序等分子生物学技术验证基因编辑效果。
3. 实验结果：成功将CRISPR/Cas9系统导入本氏烟草细胞中，实现了目标基因的精确切割和编辑。
通过PCR、测序等分子生物学技术验证，发现编辑后的基因序列与预期相符，证明了CRISPR/Cas9系统在本氏烟草基因编辑中的有效性。
烟草转化方案
利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。
同时，还可以检测蛋白的表达量。
这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。
通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。
2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。
3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。
4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。
5. 室温放置2-3h后注射烟草。
6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。
注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。
8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。
同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。
配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。
2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。
3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。
5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。
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瞬时表达
本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。
1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。
注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。
需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。
2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。
挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。
3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：
0.5M MES 1ml
20mM Na3PO4 1ml
D-葡萄糖50mg
1M 乙酰丁香酮1ul
水（一般情况下最先加入）补齐至10ml
注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。
乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。
注射缓冲液需要现配现用。
4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。
注射缓冲液重悬。
5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。
利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。
注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。
若叶片内残留的菌液过多，会导致叶片完全萎蔫，所以吸去多余菌液是非常必要的。
6.两天后取小叶烟草叶片，撕下注射部位的表皮，观察荧光的亚细胞定位；或者撕去注射部位的表皮，进行GUS染色或者其他蛋白水平分析。
注意：表皮容易观察，所以荧光观察时选取表皮最为合适；而表皮较为致密，导致GUS染色步骤中的固定液与染色液难以渗透，所以一般情况下撕去表皮，留下叶肉细胞进行检测。