冷榨花生粕蛋白多肽-亚铁螯合物制备工艺优化及结构分析

２０１７年４月　第３２卷第４期　中国粮油学报　

Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄ　Ｏｉｌｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｖｏ１．３２．Ｎｏ．４　

Ａｐｒ．２０１７　

冷榨花生粕蛋白多肽一亚铁螯合物　制备工艺优化及结构分析　

李玉珍　肖怀秋　赵谋明　林亲录　（湖南化工职业技术学院制药与生物工程学院。，株洲４１２００４）　（华南理工大学轻工与食品学院　，广州５１０６４０）　（中南林业科技大学食品科学与工程学院。，长沙４１０００４）　

摘　要　以酶法水解冷榨花生粕蛋白质粉制备得到的花生多肽液（＜３　０００　Ｕ）为原料，以氯４ｇ，＿Ｐ－铁为金属　螯合剂，在单因素试验基础上，利用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面优化技术对多肽一亚铁螯合条件进行优化分析并获　得最优螯合工艺参数，即多肽一亚铁质量比为４．３１：１（　ｇ），螯合温度为２５．４℃，螯合时间２８．５　ｍｉｎ和螯合　ｐＨ　７．５，在此优化条件下，多肽～亚铁螯合率为（８５．６８±１．２７）％（ｎ＝３），与模型预测值８９．６５３　ｌ％接近，偏差　为４．６４％。花生粕蛋白多肽一亚铁螯合物经紫外光谱和红外光谱分析发现，Ｆｅ　与多肽中的ＮＨ，　以及　ＣＯＯ一形成共价配位键并形成稳定的共轭结构，是一种新型有机金属螯合物。　关键词冷榨花生粕　多肽多肽一亚铁螯合物响应面优化　中图分类号：ＴＳ２０２．３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３—０１７４（２０１７）０４—００６４—０６　

食物来源中的铁元素大部分以高价铁（Ｆｅ¨）形　式存在，吸收效率低，当以亚铁（Ｆｅ　）形式存在时，　生物利用率更高且结构更稳定，易被人体胃肠道消　化、吸收和转运。铁元素在蛋白质和酶的合成、物质　与能量代谢以及生理免疫等生理过程中发挥重要作　用。缺铁严重时会导致缺铁性贫血（ＩＤＡ）、细胞色素　和含铁酶活性降低、供氧不足、电子传递和能量代谢　过程紊乱、机体免疫功能下降和生长发育迟缓等生　理疾病¨　。２０世纪８０年代就开始了铁补充剂的研　究，但主要以无机铁盐或有机铁盐作为铁补充剂，存　在稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生　物利用率低、价格高和存在一定毒副作用等不足　Ｊ。　蛋白质经酶法水解获得的多肽片段其一级结构上存　在大量键合金属离子的配位基团，与亚铁螯合后，消　化吸收率可得到明显改善，且金属螯合肽可利用小　肽配位体转运系统进行转运（非金属转运系统吸　

基金项目：湖南省高校科研项目（１２Ｃ１０４９），湖南化工职业技术　学院院级项目（ＨＮＨＹ２０１５００２），２０１６年湖南教育厅　科学研究项目（１６Ｃ０５５０）　收稿日期：２０１５—０９—１９　作者简介：李玉珍，女，１９８１年出生，硕士，植物蛋白质资源精深　加：Ｉ　技术　通讯作者：肖怀秋，男，１９８１年出生，副教授，植物蛋白多肽及多　肽金属营养补充剂　

收），具有转运耗能低、转运速度快和不易被饱和等　优点，有利于促进亚铁元素的吸收利用¨’　。同时，　当金属离子和多肽螯合后能抑制小肠刷状缘细胞　上肽酶的水解活性，抑制多肽水解，有助于完整多　肽作为金属元素的载体通过小肽转运系统进入肠　黏膜细胞，提高金属营养补充剂的稳定性¨Ｊ。此　外，在胃肠道中金属与多肽配位体结合形成脂溶性　的络合物有机表面，借此形式吸收并通过肠黏膜细　胞的类脂屏障转运入细胞，可减少金属元素问的拈　抗作用　Ｊ。凶此，以蛋白多肽为载体螯合金属离子　作为金属营养补充剂（或强化剂）成为了当前多肽　营养研究的重点和热点，且具有广阔的市场前景和　应用潜力。　当前，亚铁蛋白多肽载体主要集中在猪血多肽、乌　鸡肽、酪蛋白磷酸肽、米蛋白肽、鱼类蛋白肽等方面，对　冷榨花生粕蛋白多肽与亚铁螯合的研究较少…。　本试验以酶法水解冷榨花生粕蛋白质粉制备得　到的花生粕蛋白多肽液（＜３　０００　Ｕ）为原料，以氯化　亚铁为金属螯合剂，在单因素试验基础上，利用Ｂｏｘ　

—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面优化技术对多肽一亚铁螯合条件　进行优化分析，并利用ｕＶ和ＦＴ—ＩＲ对螯合物结构　进行分析，研究结果为花生多肽一亚铁螫合营养补　充剂的制备提供理论与技术支持。　第３２卷第４期　李玉珍等冷榨花生粕蛋白多肽一亚铁螯合物制备工艺优化及结构分析　６５　１　材料与方法　１．１材料与试剂　冷榨花生粕蛋白多肽液：自制　；碱性蛋白酶：　Ｒｕｉｔａｉｂｉｏ公司；其它试剂均为国产分析纯。　１．２仪器与设备　ＬＡＢＣＯＮＣＯ冷冻干燥仪：美国ｌａｂｃｏｎｃｏ公司；　ＨＥＲＭＬＥ　Ｚ３２３Ｋ冷冻离心机：德国Ｈｅｒｍｌｅ公司；　Ｒ５０８Ｂ旋转蒸发仪：国京上海实验室设备有限公司；　可见分光度计：上海舜宇恒平仪器有限公司；ＵＶ一　２５００紫外可见分光光度计：日本岛津公司；ＩＲＰｒｅｓｔｉｇｅ　

一２１岛津傅里叶变换红外光谱仪：日本岛津公司。　１．３试验方法　１．３．１　＜３　０００　Ｕ花生粕蛋白多肽液的制备　将制备得到的花生粕蛋白多肽液　在０．２５　ＭＰａ　压力条件下依次透过分子质量为５　０００　Ｕ和３　０００　ｕ　的超滤膜，收集分子质量＜３　０００　Ｕ的超滤液经旋转　蒸发浓缩、冷冻干燥后备用。　１．３．２花生粕蛋白多肽一亚铁螯合工艺　配制一系列不同蛋白多肽一亚铁质量比的混合　液，用０．１　ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ或ＨＣ１调节溶液至合适　ｐＨ，在一定温度下混合反应一定时间，反应完成后用　无水乙醇沉淀，离心（２　０００　ｒ／ｍｉｎ，１５　ｍｉｎ），收集滤　渣，备用。　１．３．３花生粕蛋白多肽一亚铁螯合条件的优化　１．３．３．１单因素试验　１）蛋白多肽一亚铁质量比对螯合率的影响：将　花生粕蛋白多肽与氯化亚铁按预定质量比（０．５：１—　５：１，ｓ／ｇ）混合，调节ｐＨ至７．０，３０℃反应３０　ｒａｉｎ，无　水乙醇沉淀，离心，收集滤渣，测定并计算螯合率。　２）螯合温度对螯合率的影响：将花生粕蛋白多　肽与氯化亚铁按质量比４：１混合，调节ｐＨ至７．０，在　２０—４５℃下反应３０　ｒａｉｎ，无水乙醇沉淀、离心、收集　滤渣，测定并计算螯合率。　３）螯合ｐＨ对螯合率的影响：将花生粕蛋白多肽　与氯化亚铁按质量比４：１混合，在ｐＨ　３．０～１Ｉ．０条　件下２５℃反应３０　ｍｉｎ，无水乙醇沉淀、离心、收集滤　渣，测定并计算螯合率。　４）螯合时间对螯合率的影响：按花生粕蛋白多　肽与亚铁配比４：１进行混合，在２５℃，ｐＨ为７．０，反　应１０—５０　ｍｉｎ，无水乙醇沉淀、离心、收集滤渣，测定　并计算螯合率。　１．３．３．２响应面优化　在单因素试验基础上，利用Ｄｅｓｉｇｎ—Ｅｘｐｅｒｔ　８．０．６　的Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面优化模块进行多肽一亚铁螯　合条件优化。试验因素及编码如表１所示。　表１试验因素水平和编码　注：　。＝（ｘｉ—Ｘｏ）／Ａｘ（　为自变量编码值，　。为自变量真实值，　为中心点处自变量真实值，　为自变量变化步长。　１．３．４花生肽一亚铁螯合率的计算　铁含量测定采用邻菲罗琳比色法　Ｊ。　亚铁螯合率＝ｍ１／ｍ０×１００％。　式中：ｍ　为螯合物中铁的质量／ｍｇ；ｍ。为加入反　应体系中的铁质量／ｍｇ。　１．３．５水解度的测定　采取ｐＨ—ｓｔａｔ［　法，水解度计算公式为：　ＤＨ：　×１００％：　×　×土×１００％　ｈｔ。ｔ　ｍＤ　ｈｔ。ｔ　ｌＯｐ“一ｐ　ｌ＋１０　“Ｉｐ　式中：Ｂ为消耗ＮａＯＨ的体积／ｍＬ；Ｎ　为碱当量；　ｍ。为水解使用的冷榨花生粕蛋白粉的质量／ｇ；　为　蛋白质底物中的总肽键数，对于花生蛋白，　为７．１３　ｍｅｑ／ｇ　；１／仅为ｐＨ—ｓｔａｔ法的校正因子，即仅一氨　基解离度的倒数。ｐＫ为仅一氨基的平均解离度，可　由Ｇｉｂｂｓ—Ｈｅｌｍｈｏｌｚ方程计算，在５０℃时，１／ｏｒ为　１．１３。　１．３．６多肽一亚铁螯合物结构分析　利用紫外光谱对氯化亚铁、蛋白多肽及蛋白多　肽一亚铁螯合物进行紫外扫描并进行结构解析。此　外，将蛋白多肽液和蛋白多肽一亚铁螯合物提纯后，　除去样品结晶水和游离水，准确称取２　ｍｇ放人玛瑙　研钵中与干燥光谱纯ＫＢｒ　２００　ｍｇ混合研磨均匀（红　外灯下进行）、压片并进行红外光谱扫描和结构　解析　

２　结果与分析　２．１单因素试验　考察了多肽一亚铁质量比（０．５：１～５：１，ｇ／ｇ）、　螯合温度（２Ｏ～４５℃）、螯合ｐＨ（３．０～１１．０）和螯合　时间（１０～５０　ｍｉｎ）对螯合率的影响，结果如图１　所示　中国粮油学报　２０１７年第４期　料　Ⅱ　濑　

螯合时问／ｒａｉｎ　５　１０　ｌ５　２０　２５　３Ｏ　３５　４０　４５　５０　

螯合温度，℃　

２　３　４　５　６　７　８　９　ｌ０　ｌｌ　ｌ２　螯合ｐＨ　

图１多肽一亚铁质量比、螯合温度、螯合ｐＨ和　螯合时间对螯合率的影响　多肽一亚铁质量比是影响螯合率的重要因素。　

质量比太小，无法形成稳定环状多肽一亚铁螯合结　构且稳定性较差，而质量比太大，则反应不完全，易　造成多肽浪费。螯合率随多肽一亚铁质量比的增大　呈先升后降趋势，当质量比为４：１时，螯合率达到最　大；金属离子配位反应通常为快速反应，反应温度对　其影响不大　Ｊ。当螯合温度为２５℃时螯合率达到　最大，温度进一步提高对螯合率影响不大，螯合温　度以２５　ｃＣ较好，试验结果与蔡冰娜等　一致；ｐＨ　是影响多肽一金属螯合的重要因素，在酸性和碱性　条件下均不利于多肽与金属的螯合，主要原因是由　于在较低ｐＨ条件下，Ｈ　与金属离子竞争性争夺供　电子基团，降低了多肽一亚铁螯合率，而在碱性环　境中，ＯＨ一将与供电子基团竞争性的抢夺亚铁离　子，易形成氢氧化物沉淀，降低螫合率。ｐＨ　７．０左　右螯合率相对较高。研究结果与孙莉洁等　研究　

一致；一般金属离子螯合反应为快速反应，反应时　间的影响较小　］。螯合时间达到２５　ｍｉｎ时，螯合率　趋于平缓，继续延长螯合时间，螫合率无明显增加，　因此，选择２５　ｍｉｎ为较优的螯合时问。　２．２　蛋白多肽与亚铁螯合条件的响应面优化　对多肽一亚铁质量比（　。）、螯合温度（Ｘ　）、螯合　时间（Ｘ　）和螯合ｐＨ（Ｘ４）进行响应面优化分析。试　

验设计与结果见表２。为减少试验误差，试验次序随　机安排。　表２响应面优化设计与试验结果（含模型预测值）　

～　螯合率／％　螯合率／％　霉　２　怒　笃　ｌ　

１一ｌ一１　０　０　４２．７６　４３．９７　ｌ５　０—１　ｌ　Ｏ　７８．９１　７８．６２　２　１一ｌ　０　０　６８．９１　７０．８１　１６　０　１　１　０　６８．９ｌ　６８．６５　３—１　ｌ　０　Ｏ　５５．３ｌ　５４．５６　１７一ｌ　０一ｌ　０　４１．７９　４１．５７　４　ｌ　ｌ　Ｏ　０　７２．０７　７２．０ｌ　ｌ８　ｌ　０一ｌ　０　６１．２ｌ　６１．６８　５　０　０一ｌ一１　５８．８２　５８．５０　１９一ｌ　０　ｌ　Ｏ　５２．８２　５１．４５　６　０　０　ｌ—ｌ　６１．２６　６２．３９　２Ｏ　ｌ　０　ｌ　０　７６．３ｌ　７５．６３　７　０　０一ｌ　ｌ　６１．７３　６１．７５　２ｌ　０—１　Ｏ—ｌ　６５．１７　６４．６４　８　Ｏ　０　ｌ　１　８Ｏ．２２　８１．６９　２２　Ｏ　ｌ　０—１　６０．３６　６１．７６　９一ｌ　０　０—１　４１．３４　４１．１８　２３　Ｏ一１　Ｏ　Ｉ　６９．４４　６７．１４　１０　１　０　０—１　６６．５６　６５．０３　２４　０　ｌ　０　ｌ　８２．１８　８１．８】　ｌ】一１　０　０　ｌ　５２．８８　５４．１６　２５　０　０　０　０　８５．９２　８５．７２　１２　１　Ｏ　Ｏ　１　７４．６９　７４．６０　２６　０　０　０　０　８５．９８　８５．７２　１３　０一ｌ—ｌ　０　５Ｏ．８２　５０．８３　２７　Ｏ　０　０　０　８５．２７　８５．７２　１４　０　ｌ—ｌ　０　７２．５７　７２．６ｌ