T淋巴细胞增殖试验计划
t细胞效应检测方法
t细胞效应检测方法标题：深入了解T细胞效应检测方法T细胞是人体免疫系统的重要组成部分，负责识别并消灭感染和异常细胞。
在研究和临床实践中，准确检测T细胞的效应功能对于评估免疫状态和疾病进展至关重要。
本文将详细介绍几种常见的T细胞效应检测方法。
一、T细胞增殖实验T细胞增殖实验是检测T细胞功能的一种基础方法。
该实验通常通过以下步骤进行：1.收集待检测的T细胞样本。
2.将T细胞与特异性抗原或刺激剂共同培养。
3.通过细胞计数、放射性标记物摄取或其他检测手段评估T细胞的增殖情况。
二、细胞因子释放实验细胞因子是T细胞活化后分泌的免疫调节蛋白。
通过检测细胞因子的释放，可以评估T细胞的效应功能。
常见的细胞因子释放实验有以下两种：1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过特异性抗体捕获细胞因子，然后进行定量分析。
2.流式细胞术：利用荧光标记的抗体检测细胞因子分泌情况。
三、T细胞杀伤实验T细胞杀伤实验是评估T细胞对靶细胞杀伤能力的方法。
常见的方法有：1.51Cr释放实验：将放射性同位素标记的靶细胞与T细胞共培养，通过测定释放的放射性同位素量来评估T细胞的杀伤能力。
2.非放射性细胞毒性实验：利用荧光染料、钙离子指示剂等代替放射性同位素，评估T细胞对靶细胞的杀伤作用。
四、流式细胞术流式细胞术是一种高精度的细胞检测技术，可以评估T细胞的多种功能，如：1.表型分析：通过检测细胞表面的标记物，了解T细胞的亚群分布和活化状态。
2.细胞内细胞因子染色：检测T细胞内特定细胞因子的表达情况。
五、免疫组化技术免疫组化技术是检测组织中T细胞分布和功能的一种方法。
通过特异性抗体与T细胞表面或细胞内分子结合，然后利用染色剂显色，观察T细胞在组织中的分布和活化状态。
总结：T细胞效应检测方法多种多样，研究人员可以根据实验需求和条件选择合适的方法。
MMT
实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中 将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收 集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比 加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细 胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶 以MTT为底物，形成蓝色的甲臜 （ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细 胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液， 可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间 接反映活细胞数量。
ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转 化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲 瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测 定其OD值
预பைடு நூலகம்结果：
淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的 离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离 心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液 体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液， 主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的 漂洗、配制其他试剂等）
小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定是用来评估免疫功能和细胞毒性的常用方法。
以下是一般的小鼠淋巴细胞增殖测定的步骤：
1. 准备小鼠：选择合适的小鼠品系和年龄，并确保小鼠健康。
2. 分离淋巴细胞：采集小鼠淋巴组织（例如脾脏或淋巴结）并进行细胞分离。
常用的方法包括机械破碎和离心分离。
3. 细胞计数与稀释：用血细胞计数器或显微镜计数细胞数目，并进行适当的稀释以获得合适的细胞密度。
4. 细胞悬液制备：将分离的淋巴细胞与培养基混合，使细胞悬浮于培养基中。
5. 细胞培养：将细胞悬液移至培养皿中，并在37°C、5% CO2
的条件下培养一段时间。
一般培养24-72小时。
6. 刺激因子处理：在培养皿中添加适当的刺激因子（如细胞激动剂或抗原），以刺激细胞增殖。
7. 溶菌酶处理：在培养结束后，加入溶菌酶等溶解剂，使未被细胞内的放射性同位素取代的DNA释放到培养基中。
8. 获得DNA：收集并离心细胞上清液，将其中的DNA沉淀。
9. 放射性测定：使用放射性技术，如液体闪烁计数器，测量
DNA中的放射性同位素含量。
10. 统计分析：根据放射性同位素的计数，计算细胞增殖水平，并进行统计分析。
这些步骤可以根据具体实验目的和方法的需求进行适当的调整和修改。
淋巴细胞功能检测
根据淋巴细胞转化率，可以间接判断机体免疫状态。
三、操作：淋巴细胞转化试验
（一）原理：
T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异丝裂原（PHA、 PWM和ConA）刺激均能使细胞发生形态改变而转化为 淋巴母细胞。 T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平， 常被作为细胞免疫功能指标之一。 计算200个淋巴细胞中转化为母细胞的细胞数（包括过渡 型、母细胞和分裂相淋巴细胞。 细胞免疫缺陷时，患恶性肿瘤或
【实验材料】
一、实验动物（如balb/c小鼠）
二、注射器、针头、10ml离心管、滴管、试管、 玻片等常规实验仪器。
三、PHA、瑞氏姬姆萨染液，肝素，Hanks液等常 规实验试剂。
【作业】
请将你们小组的设计方案与技术路线在讨论完善 后记录在实验报告本，并将可行的实验内容在实 验课中实施。
一、讨论 （一）设计性方案要点
（二）淋巴细胞功能检测的主要内容
T细胞功能测定
B细胞功能测定
单核巨噬细胞、NK细胞等功能测定
细胞因子的检测
CD分子、表面受体、粘附分子的检测
1、T细胞功能测定
（1）T细胞转化、增殖试验 ① H3-TdR掺入 ②细胞能量代谢测定（ MTT检测法） ③形态学计数 （2）迟发性超敏反应的检测 （3）T细胞分泌功能的检测 （4）流式细胞仪对T细胞功能的检测 （5）T细胞介导的细胞毒试验
1-3h 绵羊红细胞 B
+ 补体 有丝分裂原
B 浆
浆
溶 血 空 斑 实 验
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
① 稳定、特异，且抗原用量少； ②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测 ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞
淋巴细胞增殖抑制标准
淋巴细胞增殖抑制检测标准操作规程
签名/日期
1 目的
建立淋巴细胞增殖抑制检测标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。
2 适用范围
适用于淋巴细胞的检查
3 术语或定义
3.1 淋巴细胞（lymphocyte）：是白细胞的一种，是体积最小的白细胞。
其由淋巴器官产生，主要存在于
淋巴管中循环的淋巴液中，是机体免疫应答功能的重要细胞成分。
3.2 CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8）：是一种基于WST-8而广泛应用于细胞活性和细胞毒性检测的
快速、高灵敏度试剂盒。
3.3 酶标仪：即酶联免疫检测仪。
是酶联免疫吸附试验的专用仪器又称微孔板检测器。
可简单地分为半自
动和全自动两大类，其核心是一个比色计,即用比色法来进行分析。
4 责任
4.1 负责淋巴细胞的检验、结果的复核、记录的填写。
4.2 合性和记录的审核。
5 环境健康安全
N/A
6 程序
7 附件
《淋巴细胞增殖抑制检测记录》8 参考或引用文件[1]
1．中华人民共和国药典20202版第三部
2. 中检院方法
3. Qiu P C, Lu Y Y, Zhang S, et al. Reduction of SCUBE3 by a new marine-derived asterosaponin leads to arrest of glioma cells in G1/S[J]. Oncogenesis, 2020, 9(8): 71.
9 文件版本修改历史。
t淋巴母临床实验
t淋巴母临床实验淋巴母细胞临床实验淋巴母细胞（lymphoid progenitor cells）是一类在造血系统中发挥重要作用的细胞。
它们具有多能干细胞的属性，可以分化为多种免疫细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。
淋巴母细胞在免疫功能的维护和调节中起到关键作用，对于免疫相关疾病的治疗具有广阔的应用潜力。
为了进一步研究淋巴母细胞的生物学特性及其在临床应用中的潜力，进行淋巴母细胞临床实验具有重要意义。
本文将介绍淋巴母细胞临床实验的一般流程和关键步骤，并探讨其在临床应用中的前景。
一、实验步骤（1）样本采集：从人体骨髓、外周血或胎盘血中采集样本，获取淋巴母细胞。
（2）细胞分离：通过离心、负选择或正选择等方法将淋巴母细胞从其他细胞中分离出来，保证实验的准确性。
（3）细胞培养：将分离得到的淋巴母细胞进行培养，提供适当的培养基和生长因子，促进细胞的增殖和分化。
（4）细胞鉴定：通过流式细胞术、免疫组化等方法，确定培养得到的细胞具有淋巴母细胞的特征。
（5）功能实验：进一步研究培养得到的淋巴母细胞的功能，如免疫反应、细胞信号传导等。
（6）评估效果：根据实验结果对淋巴母细胞的生物学特性进行评估，并探讨其在临床应用中的潜力。
二、临床应用前景淋巴母细胞临床应用前景广阔，主要体现在以下几个方面：（1）免疫治疗：淋巴母细胞可以分化为多种免疫细胞，如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和抗感染的能力。
通过培养和扩增淋巴母细胞，可以为免疫缺陷病人提供治疗选择。
（2）器官移植：淋巴母细胞在器官移植中具有重要的免疫调节作用，能够预防和治疗移植后的免疫排斥反应。
将培养得到的淋巴母细胞应用于器官移植手术，有望提高移植成功率和术后生存率。
（3）疾病治疗：淋巴母细胞参与了多种免疫相关疾病的发生和发展过程，因此在这些疾病的治疗中具有潜在的应用价值。
例如，通过调节淋巴母细胞的功能和数量，可以有效治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。
免疫学实验：T淋巴细胞转化试验
转化率
转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
3H-TdR掺入法
然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分 别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中， 剩余3ml培养液备用。 4. 2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。
➢ 细胞计数
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混 匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul 计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
第三天
1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
常用的检测方法
➢ 形态学观察法 ➢ 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 ➢ MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）
本次实验采用 MTT法
形态学检测方法
➢ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的 3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。
Lu 淋巴细胞体外增殖功能检测
DNA合成检测法
DNA复制完成、 蛋白合成， 为有丝分裂 作准备
RNA转录、蛋 白合成为DNA 复制做准备
DNA合成期 增殖期的细胞需要大量核苷酸
DNA合成检测法
利用在细胞培养过程中掺入放射性（如 3H-Tdr 掺入法）或
非放射性的核苷类似物（如 Brdu 掺入实验），直接检测 DNA合成水平变化
刺激淋巴细胞增殖
Day 3:
CCk8检测细胞增殖
将细胞浓度分别调节为 2x106 /mL和4x106 /mL，加入96 孔板，每孔90μL，加入25μg/mL或50μ g/mL ConA溶液10 μL ，细胞培养箱（37℃，5%CO2)中孵育72h。培养期间可 观察细胞增殖情况。
美洲商陆 激活人和小鼠T和B细胞 G-菌 测定小鼠B细胞 检测人B细胞
葡萄球菌蛋白A（SPA）G+菌
高浓度时，经丝裂原受体与B细胞结合，多克隆诱导B细胞 增殖和分化； 低浓度时， BCR特异性识别TI-1抗原的B细胞能竞争结合到 足够抗原量被激活； 感染初期（在TD-Ag免疫应答启动前）快速产生特异性抗体
的BrdU水平
LPS 2D 3D 12.05
0.65 Medium
5.77
BrdU 7AAD Flow cytometric analysis of DNA content (propidium iodide) and DNA synthesis (BrdU) after two or three days of stimulation
细胞染色法
利用荧光染色可穿透细胞膜的特性染色细胞，当细胞分裂
时，荧光标记物被平均分配到两个子代细胞中，其荧光强 度是亲代细胞的一半，如CFSE染色细胞
C3He anti-u 10
γδT细胞 体外培养实验方案
γδT细胞体外培养实验方案一、前言γδT细胞是一群兼有固有免疫和特异性免疫双重特征T细胞，具有杀伤与调节的双重功能，在维持局部免疫稳态中发挥不可替代的作用[1]。
主要分布于黏膜（肠粘膜、蜕膜）和上皮组织（人宫颈上皮），在外周血中占CD3＋T细胞的1％～5％，在抗微生物感染、调节免疫应答和抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用[2]。
按T细胞受体（T cell receptor ，TCR）类型不同，可将T细胞分为αβT细胞和γδT 细胞。
γδT细胞培养时，易混杂较多αβT细胞，为分离γδT细胞带来困难。
文献报道妊娠期，γδT细胞是母一胎界面重要的T淋巴细胞。
人类妊娠早期蜕膜富含活化的完全分化的和促炎性的γδ细胞[3]。
正常妊娠的人类和小鼠的外周血与蜕膜局部γδT 细胞数量均明显增多，且蜕膜γδT细胞比例较外周血明显上升[4]。
蜕膜γδT细胞有利于维持母-胎免疫耐受状态，正常妊娠妇女的蜕膜γδT细胞数量明显高于未妊娠或妊娠失败的妇女；而且蜕膜γδT 细胞有利于蜕膜局部IL-10及TGF-β等细胞因子的合成[5]。
人的胎盘由羊膜、叶状绒毛膜（又称丛密绒毛膜）和底蜕膜（又称基蜕膜）组成[6]。
二、γδT细胞特点1.量少，与αβT细胞共存。
2.γδT细胞呈悬浮生长。
3.黏膜组织（肠粘膜、蜕膜）、上皮组织（人宫颈上皮）、支气管肺泡、外周血含量较丰富。
三、实验组织来源1.蜕膜组织取自医院流产术的正常妊娠妇女，来源多且不涉及伦理问题。
2.底蜕膜来源于胎盘组织，不涉及伦理问题。
四、培养方法1.单个核细胞加入诱导因子（IL-2、IL-7、唑来膦酸）分化14-21天。
（诱导因子浓度1µmol/L唑来膦酸，400 IU/mL IL-2）2.直接分选γδT细胞，进行增殖培养。
五、从组织提取细胞方法1.组织切碎，胶原蛋白酶消化，过筛。
缺点：步骤较多易导致细胞死亡，活性细胞数量下降，细胞表面蛋白选择性丢失。
2.机械分解优点：可避免选择性细胞死亡或表面蛋白的选择性丢失。
T淋巴细胞体外培养
T淋巴细胞体外培养1 试验目的主要检测苜蓿多糖对T淋巴细胞细胞因子的检测，以及对T淋巴细胞增殖活性的检测。
2 试验内容试验一使用不同梯度WSAP培养T淋巴细胞，并检测IL-2含量，以确定APS确实对T淋巴细胞起到免疫增强作用，并确定最佳WSAP浓度，并确定IL-2分泌量的时间，为后续检测IL-2提供参考。
试验二用MTT法检测T淋巴细胞的增殖活性，3 材料与方法3.1 试验动物昆明小白鼠3.2 实验试剂苜蓿多糖、RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗（青霉素、链霉素）、细胞培养瓶、四甲基偶氮唑盐（MTT）、4 T、B淋巴细胞制备4.1 脾脏分离与细胞悬液制备颈椎脱臼法将小鼠处死，用75%酒精消毒，浸泡1-2 min，在超净工作台中取出脾脏，用灭菌生理盐水（或D-Hanks液或PBS缓冲液）冲洗3次，用镊子与剪刀剔除脾脏表面的脂肪和结缔组织，置于含D-Hanks无菌培养皿里，用灭菌的剪刀、镊子把器官剪碎，在200目的细胞筛网上用一次性注射器的内芯挤压研磨，研磨的同时并用巴斯德吸管吸取D-Hanks 液进行冲洗，最后收集细胞悬液。
收集的细胞悬液在1000 r/min下离心5 min，弃去上清液，加入D-Hanks液2 mL用巴斯德吸管或移液枪将细胞悬液轻轻吹打均匀，并剔除混在细胞中的脂肪组织和结缔组织。
然后将细胞悬液在1000 r/min下离心5 min。
离心后弃去上清液，加入3-5倍细胞沉淀体积的红细胞裂解液，轻轻吹打均匀，1000 r/min下离心5 min，弃去上清液，再加入D-Hanks液洗涤细胞沉淀两次。
配制5 mL 含10%胎牛血清和1% 双抗的RPMI-1640培养基。
先往离心完的细胞沉淀中加入1mL培养基吹打均匀，然后将剩余的培养基加入，混合均匀。
提前准备好细胞培养瓶，用酒精灯消毒瓶口，将配制好的细胞液加入细胞培养瓶中，用酒精灯消毒瓶口。
然后放置含5%的培养箱中培养4.2 T淋巴细胞的分离(1)将装有尼龙毛柱的注射器固定在支架上，倒入37℃的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，以清洗几次尼龙毛，关上阀门。
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淋巴细胞增殖计划
一、主要溶液的配制：
1.Tris-NH4CL破红液：
称取4.12克Tris溶于160ml DDW中，1M盐酸(8.62ml/100ml)调节PH至7.65(大约需2ml)，为A液；称取8.3克 NH4CL溶于1升DDW中，为B液。
使用前B与A以9：1混合，盐酸调PH至7.2。
2.RPMI 1640液（谷氨酰胺2mol/l）：
带酚红试剂的1640液（用酒精擦瓶口，并在酒精灯上过一下，遇空气变碱），将其分装成50ml离心管内（每次大约需3管），加10％的灭活胎牛血清，Hepes 10mM ,青霉素105U/L，链霉素105U/L。
注：虽1640液中含有Gln，但开瓶后极易挥发，故一定加入Gln
储存液浓度应用浓度每10ml培养基中应加量
胎牛血清100％10％9＋1ml
青、链霉素1万U/ml 100U/ml 100μl
Hepes 1M 10mM 100μl
以上混匀后用7.5% NaHCO3调PH至7.0—7.2,（无需调节，PH 7.18）现用现配。
二、实验步骤：
1．动物准备BALB/c小鼠，20g左右，四只。
实验组：2只（d0天，d3天，d5天上午腹腔注射氢化可的松10mg/kg，下午腹腔注射环磷酰胺30mg/kg）
对照组：2只（与实验组相同时间点腹腔注射生理盐水）
2.RPMI 1640液分装后，配制完全1640液（每次10ml），调节PH。
Tris-NH4CL(每次10ml)调节pH后0.22μm滤器过滤。
3.BALB/c小鼠断颈处死后，75％酒精浸泡3－5分钟。
4.在超净工作台内，垫一酒精纱布，剪刀、镊子无菌取脾，（每组小鼠两个脾合在一起）在一个培养皿内用培养液冲洗后，转移至另一个含10ml RPMI 1640液的培养皿中，200目金属网中央浸没于液体中，用玻璃注射器芯研磨组织碎片，使分散的细胞滤过金属网进入平皿的液体中。
5.用1ml Tip头将细胞悬液转移到15ml试管中，待结缔组织自然下沉后，将上清移入到另
一个15ml离心管中，用吸管轻轻吹打，水平离心，1200rpm,10分钟。
弃上清。
6.破红：将细胞沉淀按1：10加入Tris-NH4CL破红液,轻轻吹打混匀，室温放置5分钟。
水平离心1200rpm,10分钟。
弃上清,留取细胞沉淀。
7.洗涤：将沉淀的细胞液重悬于14ml的RPMI 1640液中，吹打混匀，1200rpm,离心10min 。
8.弃掉上清，将残留的RPMI1640用尖吸管吸干，将细胞重悬于2mlRPMI1640中。
计数板计数：用酒精擦计数板和盖玻片，然后用绸布轻轻擦拭。
取少量细胞悬液用RPMI 1640液将其稀释100倍，用吸管轻轻吹打混匀后，取15μl滴入计数板内，置于显微镜下计数。
细胞压中线时，只左不右，只上不下。
细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数(100)
9. 将上述液体水平离心，1200rpm, 10分钟。
用完全培养液调整细胞浓度为5×106/ml与1.5×106/ml。
分组如下：ConA终浓度5μg/ml
A.ConA组：100μl细胞/孔+ConA 5μl（即5ul浓度为100ug/ml的ConA） ,使其终浓度达
B.对照组：100ul细胞/孔+10ulRPMI1640培养液。
每组均做3孔
10. 于96孔一次性培养板中37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。
每孔加入5mg/ml的MTT 15μl，继续孵育4个小时后，水平离心1000rpm,10分钟，弃上清，使每孔残留20μl液体，加DMSO 150μl，充分溶解甲瓒，分光光度计570nm测分光光度值。
注意事项：
1）HEPES为氢离子缓冲剂，通常使用浓度为10-50mM。
2）不完全RPMI 1640液加入胎牛血清（10%）后,PH值平均会偏低0.2左右。
因此将血清加入培养液中混匀后，应先调整PH值在7.0-7.2之间，然后再过滤。
3）一切操作如配液、调节PH值、打开或封闭管口等，都应在洁净台内火焰近处操作，经过烧灼进行。
4)10ml完全培养基的配制：9mlRPMI1640+1ml胎牛血清+100ul青/链霉素+100ulHepes+100
μl谷氨酰胺（终浓度2mmol/L）
5)细胞稀释:若计数后细胞为5*107/ml,则取细胞悬液400ul于Sigma离心机1000rpm,离心10min ,弃上清，将细胞沉淀重悬于4ml完全培养基中，浓度为5*106/ml。
取600ul的5*106/ml 液体，加入1400ul完全培养基中，终浓度为1.5*106/ml。
注：ConA稀释：
贮存液配制：10mgConA溶于10ml蒸馏水中，0.2um滤器过滤除菌，分装于1.5ml管中，1ml/管，浓度为1mg/ml。
注：细胞培养40小时左右显微镜下观察呈现细胞团，加入MTT后2小时，可见增殖的细胞内有紫色颗粒样物质。
用CaCl2制备和转化感受态大肠杆菌
细菌转化
实验准备：50ml管2个，1mlTip 6个，200ul Tip 6个，10ul Tip 6个，1.5ml管6个，LB液体培养基30ml,含Amp的固体培养基6块。
实验步骤：增菌
1.用接种环从-20度DH5a菌种保存液中蘸取菌液，划线接种于普通LB培养板上，温箱37
度孵育16-20小时。
次日，挑取一个DH5a单菌落，接种于LB液体培养基中，37度，300rpm至菌增殖至OD600
约为0.4-0.6时取出。
2.制备感受态细菌
将取出的新鲜菌液移入无菌的预先预冷的50ml离心管中。
同时把25ml0.1mol/L的预先预冷的CaCl2中。
将50ml中离心管内的菌液离心4度，4000rpm，10min。
用预冷的氯化钙（0.1M）10ml重悬菌液沉淀，并继续离心（此步骤可以重复两次）4℃、4000rpm、10分钟。
弃上清后，加入1ml的0.1mol/L的氯化钙混匀菌液，从而制成感受态菌（感受态菌很脆弱、混匀时要注意动作轻柔。
）
3.转化
取感受态菌液100微升及2 微升质粒，放入1.5ml管中。
（取用的枪尖要预冷）
二者在冰浴中静置30分钟
冰浴后的混合物与42℃水浴休克90秒（准确、手勿动）
再冰浴1-2分钟
4. 复苏
加入相当于菌液4倍体积的培养基，摇床37℃、225rpm、45分钟复苏。
5. 筛选
取100微升转化后的菌液（可以取100微升和50微升或4000rpm 4分钟浓缩后再取100微升和50微升）尽量将菌液涂于含氨苄的培养皿上37℃过夜。
（如果菌液较稀，可离心后，吸出部分上清后将沉淀重悬以浓缩菌液）
（注：过夜不超过20h）
6. 结果：观察是否有菌落长出。
所需组件：Amp培养皿（一星期内有效）、氯化钙（1M/L），用时稀释至0.1M/L、50ml离心管、1.5mlEp管、水浴、冰浴。