体外刺激淋巴细胞增殖作用检测
淋巴细胞转化实验原理
淋巴细胞转化实验原理
淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞实验技术，用于研究淋巴细胞的功能和活性。
该实验主要通过处理淋巴细胞，使其进行转化和增殖，从而获得更多的细胞进行后续的功能分析和研究。
实验的原理基于淋巴细胞的自然特性和生理过程。
淋巴细胞是一类免疫细胞，起着重要的免疫调节和防御功能。
在正常情况下，淋巴细胞处于休眠状态，只有在遇到外源性刺激或免疫细胞间相互作用的信号刺激下，才会转化为活化状态，开始增殖和分化。
在淋巴细胞转化实验中，常用的处理方法是给予刺激物或相关信号物质。
这些刺激物可以是抗原、细胞因子、化合物或重组蛋白等。
通过刺激淋巴细胞，在体外条件下模拟体内的免疫应答过程。
刺激物与淋巴细胞相结合后，能够激活细胞上的相应受体和信号通路，从而引发一系列的生物学反应。
在刺激的作用下，被处理的淋巴细胞开始进入细胞周期，细胞开始增殖和分化。
通过细胞分裂和子细胞的形成，最终得到更多的活化淋巴细胞。
这些活化的淋巴细胞可以进一步用于功能分析、免疫学实验、药物筛选等。
需要注意的是，在进行淋巴细胞转化实验时，应严格控制实验条件，包括温度、细胞培养基成分、刺激物浓度和时间等。
不同类型的淋巴细胞对不同刺激物的响应可能存在差异，因此实验前应先对要研究的淋巴细胞类型进行文献调查和探索性实验，以确定最适合的刺激条件。
总之，淋巴细胞转化实验通过处理和刺激淋巴细胞，使其从休眠状态转化为活化状态，以获得更多的活化细胞进行功能分析和研究。
实验的原理基于淋巴细胞的生物学特性和免疫功能，需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可重复性。
CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选
CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选目的筛选CCK-8法在淋巴细胞增殖检测中的最佳实验条件。
方法采用正交实验设计，对初始细胞浓度、培养时间、LPS浓度、显色时间这4个主要因素各水平对人外周血单个核细胞（PBMC）和小鼠脾细胞增殖的影响进行试验研究，对各实验组合测得的刺激指数进行方差分析。
结果CCK-8检测人PBMC 增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为2.5×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；检测小鼠脾细胞增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。
结论CCK-8法便捷、灵敏、重复性好，可作为检测淋巴细胞增殖的稳定方法。
本研究建立的CCK-8最佳实验条件可为免疫调节作用的药物体外筛选和免疫药理学作用的研究提供依据。
[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density，culture period，concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8）on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOV A was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows：for PBMC，cell density was 2.5×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h；and for splenocyte，cell density was 5.0×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive，convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.[Key words] CCK-8；PBMC；Lymphocyte proliferation；Orthogonal test檢测淋巴细胞增殖的方法主要有形态学检查法、放射性核素标记法和四氮唑盐比色法等。
淋巴细胞实验报告
1. 了解淋巴细胞转化实验的基本原理和方法。
2. 掌握淋巴细胞转化实验的操作步骤。
3. 分析实验结果，探讨不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响。
二、实验原理淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。
在实验过程中，淋巴细胞受到有丝分裂原或抗原刺激后，会发生增殖和转化，从而增加细胞数量。
根据转化过程的不同，可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
本实验采用体外诱导转化方法，通过加入化合物或病毒等诱导剂刺激淋巴细胞，观察细胞转化情况。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 人外周血- RPMI-1640培养液- 细胞分离液- 淋巴细胞刺激剂（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）- 台盼蓝染色剂- 流式细胞仪- 显微镜2. 实验仪器：- 移液器- 培养箱- 恒温水浴箱- 染色缸- 计数板1. 淋巴细胞分离：采集人外周血，用细胞分离液进行分层，收集淋巴细胞。
2. 细胞培养：将分离的淋巴细胞用RPMI-1640培养液稀释，接种于培养皿中，置于培养箱中培养。
3. 淋巴细胞转化：向培养皿中加入淋巴细胞刺激剂，培养一段时间后，收集细胞。
4. 细胞染色：将收集的细胞用台盼蓝染色，显微镜下观察细胞形态。
5. 流式细胞仪检测：将染色的细胞用流式细胞仪检测，分析细胞转化率。
五、实验结果与分析1. 细胞形态观察：显微镜下可见，未经刺激的淋巴细胞体积较小，呈圆形或椭圆形；经过刺激的淋巴细胞体积增大，呈多边形或不规则形。
2. 流式细胞仪检测：经过刺激的淋巴细胞转化率为60%，未经刺激的淋巴细胞转化率为20%。
3. 不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响：- 植物血凝素（PHA）刺激：淋巴细胞转化率为70%。
- 刀豆蛋白A（ConA）刺激：淋巴细胞转化率为65%。
- 无刺激：淋巴细胞转化率为20%。
六、实验结论本实验通过淋巴细胞转化实验，观察到淋巴细胞在受到刺激后发生转化，转化率随刺激剂的不同而有所差异。
结果表明，植物血凝素和刀豆蛋白A对淋巴细胞转化能力具有显著的促进作用。
医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
细胞转化实验实验报告
一、实验目的1. 了解淋巴细胞转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握淋巴细胞转化实验的观察指标和结果分析方法。
3. 通过实验，观察不同刺激条件下淋巴细胞转化率的变化，了解细胞免疫功能。
二、实验原理淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞生物学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。
在实验中，将外周血中的淋巴细胞与特异性抗原或刺激物共同培养，观察淋巴细胞在培养过程中的增殖情况。
淋巴细胞转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
自发转化是指在无外界刺激条件下，淋巴细胞自身发生的增殖；体外诱导转化是指在体外加入抗原或刺激物，刺激淋巴细胞增殖。
三、实验材料1. 实验动物：健康小鼠，体重20-25g。
2. 试剂：淋巴细胞分离液、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、小鼠抗人CD3单克隆抗体、PHA（植物血凝素）、Hoechst 33342染料、胰蛋白酶等。
3. 仪器：离心机、显微镜、培养箱、酶标仪等。
四、实验步骤1. 分离淋巴细胞：取小鼠外周血，加入Ficoll分层液，离心分离出单个核细胞层。
再用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。
2. 细胞培养：将分离出的淋巴细胞加入RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/ml。
将细胞悬液分装到24孔培养板中，每孔100μl。
3. 诱导转化：向部分孔中加入PHA，作为诱导剂；另部分孔不加诱导剂，作为对照。
将培养板放入培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养48小时。
4. 染色：向培养板中滴加Hoechst 33342染料，室温染色30分钟。
5. 观察与计数：在显微镜下观察细胞形态，计数每孔细胞总数和转化细胞数。
五、实验结果与分析1. 对照组细胞呈圆形，细胞核染色质均匀，细胞转化率低。
2. 诱导组细胞呈多边形，细胞核染色质致密，细胞转化率高。
结果表明，PHA能够有效诱导淋巴细胞转化，提高细胞免疫功能。
六、实验结论1. 本实验成功实现了淋巴细胞转化实验，掌握了实验操作步骤和观察指标。
医学免疫实验(T细胞增殖实验、核素法、MTT法)
3H胸腺嘧啶核 苷掺入检查法
3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法
原理：当淋巴细胞受分裂原(PHA等)或特异性抗原刺激发生转化时， 必然伴有DNA的大量合成，若将具有放射性的3H-TdR加到培养液内， 则可被作为合成DNA的原料而摄入转化中的细胞内，测定细胞内放 射性物质的相对数量(以脉冲数cpm表示)，就能客观地反映淋巴细 胞对刺激物的应答水平。
MTT法
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活 性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞 毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它 的特点是灵敏度高、经济。
淋巴细胞的功能测定技术
T细胞+PHA
培养，淋巴母细胞转化
染色 +3H-TdR
计数转化细胞百分率 测定cpm值
测定OD值
谢谢！
医学免疫实验
作业
市场上有一广告产品，据说有免疫 增强作用，请设计一个方案证实之 （从影响淋巴细胞功能、T淋巴细 胞增殖的角度考虑）。
T细胞增殖实验 3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法（核素法） MTT法
T细胞增殖实验
原理：又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺 激，细胞代谢和形态相继变化，在24~48h细胞内蛋白质 和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变 化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松 等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细 胞增殖又叫淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有 关刺激的反应性与功能状态。 (1) 非抗原性刺激物:如植物血凝素(PHA)、刀豆素 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、脂多糖(LPS)，通称促有丝分 裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞，PHA和 ConA刺激T细胞增殖。 (2) 抗原性刺激物:如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风 类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。
MMT
实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中 将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收 集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比 加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细 胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶 以MTT为底物，形成蓝色的甲臜 （ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细 胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液， 可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间 接反映活细胞数量。
ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转 化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲 瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测 定其OD值
预பைடு நூலகம்结果：
淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的 离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离 心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液 体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液， 主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的 漂洗、配制其他试剂等）
淋巴细胞增殖实验报告
淋巴细胞增殖实验报告一、实验目的本实验旨在通过体外培养淋巴细胞，观察不同刺激条件下淋巴细胞增殖的情况，探讨淋巴细胞增殖与免疫应答的关系，为进一步研究免疫调节机制提供实验依据。
二、实验材料1. 实验动物：昆明种小鼠，体重20-25g，雌雄不限。
2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液、植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、ELISA试剂盒等。
3. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。
三、实验方法1. 淋巴细胞分离：取小鼠颈椎脱臼处死，无菌操作下取出脾脏，加入胰蛋白酶消化，离心洗涤，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
2. 淋巴细胞培养：将分离得到的淋巴细胞用RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10^6个/mL，加入PHA或ConA作为刺激剂，分别设置无刺激组、PHA刺激组、ConA刺激组等。
3. 细胞增殖观察：将培养的淋巴细胞置于CO2培养箱中培养，分别在24h、48h、72h、96h和120h取样，用倒置显微镜观察细胞形态变化，并计算细胞数量。
4. ELISA检测：取培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子（如IL-2、IFN-γ等）含量。
5. 流式细胞术检测：取培养的淋巴细胞，用荧光标记的抗体检测T细胞亚群（如CD4+、CD8+等）和细胞周期分布。
四、实验结果1. 细胞形态观察：随着培养时间的延长，淋巴细胞在PHA或ConA刺激下逐渐转变为淋巴母细胞，细胞体积增大，核仁明显，细胞浆内出现空泡。
2. 细胞增殖：在PHA或ConA刺激下，淋巴细胞数量显著增加，且呈时间依赖性。
3. 细胞因子检测：ELISA结果显示，在PHA或ConA刺激下，培养上清液中IL-2、IFN-γ等细胞因子含量显著升高。
4. 流式细胞术检测：流式细胞术结果显示，在PHA或ConA刺激下，T细胞亚群CD4+和CD8+的比例发生改变，且细胞周期分布发生变化。
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体外刺激淋巴细胞增殖试验
1 样品配制
精确称取样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL 的样品液。
充分溶解然后以15000g离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成所需浓度待用。
2 小鼠淋巴细胞的制备
选取8-10周龄，体重22±1g的Balb c或C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。
将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400g/min 离心6min。
吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵红细胞裂解液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基（含双抗及10％胎牛血清）混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106个/mL细胞液备用。
3 细胞培养
将2×106个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μL PBS和20μL 60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。
于37℃、含5%的CO
条件下培养3d，加入相应试剂测定
2
4 淋巴细胞增殖率的测定
4.1 Alamarblue试剂测定法
在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。
计算公式为：
增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]
/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%
4.2 MTT法测定
4.2.1 MTT 溶液的配制方法
称取MTT 0.5g溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤分装，－20℃避光保存。
在配制和保存的过程中容器最好用铝箔纸包住。
在用酶标仪检测结果的时候为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7 范围
内。
4.2.2 操作步骤
在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μlMTT溶液（5mg/ml的MTT）继续培养4h（若药物与MTT能够反应可先离心后弃去培养液小心用PBS冲2-3遍后再加入含MTT的培养液），终止培养，将96孔板2000r/min离心6min，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10min 使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。
同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
计算：
增殖率（％）＝(OD570
sample /OD570
control
)×100%。