酱油中甲醛含量的测定
论食品中甲醛残留量测定方法比较
摘要：探讨不同甲醛含量检测方法对测定结果的影响，并对实验条件进行了选择，为建立食品中甲醛检测方法提供实验依据。
关键词：甲醛；食品测定；；乙酰丙酮法；盐酸苯肼法近几年来,发现个别不法商贩在加工食品过程中,用甲醛(或者甲醛次硫酸钠)来改善食品的外观和延长保存时间。
例如在米粉(湿切粉)、腐竹等食品的加工过程中加入甲醛次硫酸钠(俗称吊白快)来漂白；水发食品中加人甲醛，可使水发食品较久保存，且色泽美观。
但甲醛进人人体，轻者导致头晕头痛腹泻，重者致畸和致癌，严重影响人们的身体健康。
所以，必须加强对食品中甲醛的检测。
甲醛测定，卫生部推荐的乙酰丙酮法，这种方法受干扰因素较多灵敏度一般不高。
经过比较,盐酸苯肼法是目前测定食品中甲醛较好的方法,可用于定性及定量分析。
1乙酰丙酮法1.1原理试样经沉淀蛋白质后，甲醛在PH5.5-7.0条件下与乙酰丙酮及铵离子反应生成黄色物质，在波长415nm处有吸收峰，与标准系列比较定量。
1.2仪器与试剂722型可见光分光光度计；冰醋酸；亚铁氰化钾(106g/L)；乙酸锌(220g/L)；乙酰丙酮溶液：在100ml蒸馏水中加人醋酸按25g、冰醋酸3ml和乙酰丙酮0.40ml，振摇促溶，储备于棕色瓶中，此液可保存1个月；甲醛标准储备液:精密称取甲醛1g放人盛有5ml水的100ml容量瓶中，加水至刻度，从该溶液中吸取10.0ml放人碘量瓶中加0.1mol/L碘溶液50ml、1mol/LKOH 溶液20ml，在室温放置20min后，加H2SO415ml，用0.1mol/LNa2S2O3滴定(以1ml新配制的淀粉溶液为指示剂)。
另取水10ml同样操作进行空白实验。
甲醛标准使用液:吸取标定后的甲醛标准储备液适量用水稀释至10μg/ml。
1.3分析步骤1.3.1样品处理称取10-20g水发鱿鱼，加50ml水后用掏碎机打成匀浆。
称取相当于原样重量5-10g的匀浆样于50ml烧杯中，用50℃纯水约100ml将试样洗人250ml容量瓶中，加10ml冰醋酸，摇匀，于85℃水浴中加热1h，取出后冷却至室温，然后一面转动，一面加人2.5ml亚铁氰化钾，摇匀，再加人2.5ml乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。
23酱油的检验
每100毫升酱油中氨基酸 态氮的含量
• 不少于0.8克的就是特 级酱油，不少于0.7克 的就是一级酱油，不少 于0.55克的就是二级酱 油
“头发酱油”被明令禁 止
目标
• 掌握：酱油中总酸和氨基态氮的测定（酸度计 法）原理 • 熟悉：酱油中总酸和氨基态氮（酸度计法）的 测定方法
• 氨基酸态氮的测定 需用碱液先滴定至 PH=8.2（总酸）
• 再加入甲醛使固定 氨基的碱性，使羧 基显示酸性，再继 续用碱液滴定至 PH=9.2。
PH值的确定
• 氨基酸的等电点：氨基酸的带电状况取决于所处环境的 PH值，改变PH值可以使氨基酸带正电荷或负电荷，也 可使它处于正负电荷数相等，即净电荷为零的两性离子 状态。使氨基酸所带正负电荷数相等即净电荷为零时的 溶液PH值称为该AA的等电点。
配制酱油、酿造酱油
• 1978年商业部标准《酱油、食醋、酱类质量标准和检验 方法》中规定：酱油和食醋必须用酿造法制造。
• 80年代末，为增加酱油的鲜味，开始采用加入酸水解植 物蛋白液的方法生产配制酱油。
• 国家对酱油中添加酸水解植物蛋白液解禁后，配制酱油 便迅速发展起来。
• 酿造酱油的口感相对单一，而配制酱油口感更加鲜美， 价格较低。
注意事项：
测定总酸和氨基态氮往往同时进行 甲醛不能放置时间过长 测氨基态氮时注意铵盐的影响
C
• 酱油中铵盐影响酱油中氨基酸态氮的测定，它使氨基酸 态氮的测定
• A、受到抑制 • B、测定不能进行 • C、测定结果偏高 • D、测定结果偏低 • E、测定结果准确
• 当氨基酸水溶液在PH值为8.2时，氨基酸所带正负电荷 数相等即净电荷为零时，而且NaOH标准溶液中和了所 有的有机和无机酸，使氨基酸中的NH3离子电离出来， 即碱性氨基与酸性羧基同时电离出来，成为氨基酸的等 电点。当加入甲醛溶液时即固定了氨基酸中的碱性氨基， 然后用NaOH标准溶液滴定氨基酸中的酸性羧基。当PH 值为9.2时又是氨基酸的另一个等电点即为终点。
食品中甲醛的快速测定
食品中甲醛的快速测定甲醛是一种毒性很强破坏生物细胞蛋白质的原生质物质，可引起人体过敏、肠道刺激反应、食物中毒等疾患。
在食品生产、加工与运输环节，一般不容易被甲醛污染。
某些食物本底存在微量的甲醛不足以对人体造成危害，如：大麦粉约24mg/kg，小麦粉2～14 mg/kg，绿豆粉约2 mg/kg，棉白糖4～7 mg/kg，白沙糖1～4 mg/kg，红塘1～3 mg/kg，腐竹4～6 mg/kg，粉丝约1mg/kg，鳕鱼肉13～48 mg/kg。
其它一些海产品的肉质中也常有几毫克/公斤、甚至几十毫克/公斤的甲醛存在。
由于甲醛可以改变一些食品的色感并有防腐作用，在无知或金钱利益的驱使下，一些地区的不法分子在某些食品中加入了甲醛。
本方法主要是针对水发产品的水中加入甲醛的检测。
即使水发产品的本身每公斤存在有几十毫克的甲醛，其溶解到水中的量很少，除非蒸馏，本方法不容易观察出来，当人为加入甲醛时，本方法可迅速检测出来，检出线为20ｕg/5ml，相当于4mg/L。
本方法也可用于其它食品（如面粉、竹笋等）中加入甲醛合次硫酸氢钠（俗称：吊白块、雕白块）的筛选测定，这些食品中本底存在的微量甲醛很难在10几分钟浸出。
当检测出现阳性结果时，很可能人为加入了吊白块，应进行进一步的定量实验。
方法一、试剂包法1. 指示剂配制????试剂盒中有两种试剂，大包试剂用80 ml蒸馏水或纯净水溶解后，将小试剂管中的试剂加入其中溶解，并用水稀释到100ml，放入棕色瓶或裹有黑纸的瓶中备用，有效期为3个月，指示剂放置后会分层，使用前一定要轻轻摇动20下以上。
（指示剂为强碱性，如果不慎溅入眼中，用清水冲洗）。
2. 测定方法2.1水发产品：取5～10 ml水发产品的浸泡液或水发产品的淋洗液3～5ml于比色管或试管中，另取一只试管加入同等量的纯水或自来水，各管中加入甲醛指示剂1ml，摇匀后1分钟内对比观察结果。
对于有浅颜色的样品液体，可取同等量的液体，不加指示剂作为对照观察。
食品分析实验 酱油中氨基酸态氮含量的测定
实验九酱油中氨基酸态氮含量的测定一、实验内容用电位滴定法测定酱油中氨基酸的总量。
二、实验目的与要求1、了解电位滴定法测定氨基酸总量的原理与操作要点。
2、熟练使用酸度计。
三、实验原理。
它们互相作用使氨基酸成氨基酸含有酸性的－COOH，也含有碱性的－NH2为中性的内盐。
加入甲醛溶液时，-NH与甲醛结合，其碱性消失。
这样就可以用2碱来滴定－COOH，并用间接的方法测定氨基酸的含量。
用碱完全中和－COOH时的pH值约为8.5～9.5,可以利用酸度计来指示终点。
四、试剂（1）36%中性甲醛（2）0.050 mol/L氢氧化钠标准溶液五、仪器酸度计、复合玻璃电极、磁力搅拌器、10 mL微量滴定管六、实验步骤准确吸取酱油5.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0 mL置于200mL烧杯中，加水60 mL，插入酸度计的复合玻璃电极，开动磁力搅拌器，用0.05mo1/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积。
向上述溶液加入10.0mL甲醛溶液，混匀。
再用0.05mol/L的氢氧化钠标准）。
溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积(V1同时取80mL蒸馏水置于另一200mL烧杯中，先用0.05mo1/L氢氧化钠标准溶液滴至pH8.2(此时不记碱耗量），再加入10.0mL甲醛溶液，混匀。
用0.05mo1/L 的氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，作为空白实验。
记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积( V）。
2七、结果处理100100/20m 014.0c V V %21⨯⨯⨯⨯-）（）＝氨基酸态氮（ 式中：V l — 样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点(pH9.2)所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL ；V 2 — 空白实验在加入甲醛后滴定至终点(pH9.2 )所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL ；C — 氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L ；m — 测定用样品溶液相当于样品的质量，g ； 0.014 — 氮的毫摩尔质量，mg/mol 。
酱油抽检检验项目标准及方法
4
总砷
GB 2762
GB/T 5009.11
5
黄曲霉毒素B1
GB 2761
GB/T 5009.22
GB/T 5009.23
GB/T 18979
6
苯甲酸
GB 2760
GB/T 5009.29
Gபைடு நூலகம்/T 23495
7
山梨酸
GB 2760
GB/T 5009.29
GB/T 23495
8
糖精钠
酱油抽检检验项目标准及方法
序号
检验项目
依据法律法规或标准
检测方法
1
氨基酸态氮
GB 2717
GB 18186
SB 10336
产品明示标准及质量要求
GB 18186
GB/T 5009.39
2
铵盐
GB 18186
SB 10336
产品明示标准及质量要求
GB 18186
GB/T 5009.39
3
铅
GB 2762
GB 2760
GB/T 5009.28
GB/T 23495
9
乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）
GB 2760
GB/T5009.140
10
环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）
GB 2760
GB/T 5009.97
11
菌落总数b
GB 2717
产品明示标准及质量要求
GB 4789.2
12
大肠菌群
GB 2717
产品明示标准及质量要求
GB 4789.3
GB/T 4789.3-2003
13
致病菌c
GB 2717
酱油中氨基酸态氮的检测及结果分析
酱油是人们生活中必不可少的一种营养丰富的调味食品，对促进食欲、帮助消化有重要作用，因此要求必须有一定的色、香、味，并保证营养安全卫生。
氨基酸态氮指的是以氨基酸形式存在的氨基酸形式存在的氮元素的含量。
该指标越高，说明酱油中的氨基酸含量越高，鲜味越好。
所以酿造酱油通过看其氨基酸态氮的含量可区别其等级，每100ml的氨基酸态氮所含克数越高，品质越好（氨基酸态氮含量≥0.8g/100ml为特级，≥0.4g/100ml为三级，两者之间为一级或二级）。
但酱油中氨基酸态氮最低含量不得小于0.4g/100ml。
现对2003～2005年鸡东县市售酱油进行了氨基酸态氮含量的调查，现将结果分析如下：1 材料与方法1.1 样品来源：抽取市售的酱油共计96份。
1.2 检测方法：按照GB/T5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》检测氨基酸态氮。
吸取5.0ml试样，臵于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0ml，臵于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用0.050mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示Ph8.2,记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，可计算总酸含量。
加入10.0ml甲醛溶液，混匀。
再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。
同时取80ml水，先用氢氧化钠溶液调节至pH 为8.2，再加入10ml甲醛溶液，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH9.2同时做试剂空白试验。
1.3 评价标准：依据GB2717-2003进行评价，<0.40g/100ml，即判为不合格产品。
2 结果共检测样品96份，合格样品76份，合格率为79.17％。
其中瓶装68份，合格份数61，合格率89.71％，袋装28份，合格份数15份，合格率53.57％。
不同包装形式的合格率有显著性差异（p<0.01）。
3 讨论酱油用的原料是植物性蛋白质和淀粉质。
植物性蛋白质遍取自大豆榨油后的豆饼，或溶剂浸出油脂后的豆柏，也有以花生饼、蚕豆代用，传统生产中以大豆为主;淀粉质原料普遍采用小麦及皮，麸皮，也有以碎米和玉米代用，传统生产中以面粉为主。
酱油中氨基酸态氮含量的测定
5 V3 100
式中 —样品中氨基酸态氮的含量，g/100 ml; V 1 —测定用的样品稀释液加入甲 醛后消耗氢 氧化钠 液的体积，ml； 标 准溶
V 2 -试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml；
V 3 —样品稀释液取用量，ml； c—NaOH 标准溶液的浓度，mol/L； 0.0141—1.000 mol/L 氢氧化钠标准溶液相当氮的质量(g). 酱油类型 加甲醛前 NaOH 量/mL 加甲醛后 NaOH 标准溶 NaOH 量/mL 液浓度/ （mol/L） 氨基酸态 氮含量 /(g/100 ml) 普通酱油 生抽 2.32 2．10 6.70 8.61 0.04515 0.4017 0.5233 4.6-4.8 大于等于 4.5 老抽 3.19 7.69
容量瓶中。 氢氧化钠溶液的标定： 称取邻苯二甲酸氢钾 2.5530g， 溶解， 稀释后定容于 250ml 容量瓶中。首先用 25ml 移液管移取氢氧化钠溶液放入锥形瓶中，加入三滴酚酞 指示剂，用邻苯二甲酸氢钾溶液滴定氢氧化钠溶液，溶液由红变为无色为滴定终 点，计录用去邻苯二甲酸氢钾的体积，重复三次。
5
PH 值
0.4647
4.1-4.4
空白测定 ？？？？
0.20
0.39
【工作任务阶段小结】
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酱油中甲醛含量的测定王艺华;张南南;张书文;王丽霞【摘要】The content of formaldehyde in soy sauce produced in Yantai area of Shandong Province is introduced in this paper.According to SN/T 1547-2011 Determination of Formaldehyde in Import and Export Food-Liquid Chromatography,determine the content of formaldehyde in soy sauce using high performance liquid chromatography (HPLC) via 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) derivatization.The results show that the detection limit is 0.1 mg/L in samples by HPLC.The calibration curve is linear over the concentration range of 0~30 mg/L,correlation coefficient R2=0.9991.Precision experiment shows that RSD is 1.69%,3.65%,1.62% respectively.The addition recovery experiment is carried out,the average recovery rate is 91.0%~108.0%,It shows that the method has high sensitivity,good reproducibility and strong specificity.The formaldehyde content of 10 kinds of soy sauce produced in Yantai area is detected in the range of 6.2~10.0 mg/L.The formaldehyde in soy sauce is produced naturally in production process (fermentation process) at low concentration,and it has no harm to human health.%文章介绍了山东烟台地区生产的酱油中甲醛的含量.参考SN/T 1547-2011《进出口食品中甲醛的测定液相色谱法》中规定的方法,采用2,4-二硝基苯肼衍生-高效液相色谱法测定酱油中的甲醛含量,确定了相关实验参数.结果表明:以高效液相色谱法测定酱油中的甲醛方法检出限为0.1 mg/L,在浓度范围0~30 mg/L内呈良好的线性相关,相关系数R2=0.9991;方法精密度实验中得到不同浓度甲醛溶液相对标准偏差(RSD)分别为1.69%,3.65%和1.62%;对样品进行添加回收实验,回收率为91.0%~108.0%,表明该方法的灵敏度高、重复性好、专一性强.实验检测山东烟台地区生产的10种酱油中甲醛含量在6.2~10.0 mg/L之间.酱油中甲醛是酱油生产过程(发酵过程)中自然产生的,含量较低,对人体不会造成危害.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2017(042)006【总页数】3页(P139-141)【关键词】酱油;甲醛;高效液相色谱【作者】王艺华;张南南;张书文;王丽霞【作者单位】山东省烟台市产品质量监督检验所,山东烟台 264003;山东省烟台市产品质量监督检验所,山东烟台 264003;山东省烟台市产品质量监督检验所,山东烟台 264003;中国农业大学烟台研究院,山东烟台 264670【正文语种】中文【中图分类】TS264.21酿造酱油是以大豆和/或脱脂大豆、小麦和/或麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液体调味品[1]，因其含有丰富的氨基酸、可溶性蛋白质、糖类、有机酸等营养成分，深受人们的喜爱[2]。
天然食品中大多含有甲醛，荷兰的一项调查表明162种各类食品中，不同程度地都含有甲醛[3]。
甲醛是细胞代谢的中间产物，主要来源于动植物生长过程中的细胞生理代谢，微量的甲醛很快在体内代谢成甲酸，从呼吸系统和尿液中排出，不会损害人体健康。
张文德介绍：发酵性食品中的甲醛除了与酵母等微生物的作用有重要关系外，有些是通过发酵熟化或在加热过程中，糖和氨基酸发生的美拉德反应或某些成分的自动氧化等产生的，并伴有乙醛、丙醛、丁醛、酮等多种羰基化合物，形成了发酵食品各自的风味[4，5]。
酱油在发酵过程中会产生内源性甲醛。
我国是酱油的生产和消费大国，但目前对酱油中甲醛含量的研究鲜有报道。
本文以高效液相色谱法检测酱油中甲醛，对酱油中内源性甲醛的含量做了简要介绍。
1.1 实验材料10种产于烟台地区的酱油，样品来源于烟台市食品安全监督抽检；乙腈(液相色谱级)；正己烷(液相色谱级)；硫酸铵；乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH为5)；2，4-二硝基苯肼/乙腈溶液(0.6 g/L)；甲醛标准溶液(100 μg/mL)。
衍生液：100 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液和100 mL 2,4-二硝基苯肼/乙腈溶液(0.6 g/L)的混合液。
1.2 仪器Waters 2695高效液相色谱仪(配有紫外检测器)；BS210S电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司。
1.3 甲醛衍生物标准系列溶液衍生化步骤[6，7]移取100 μg/mL的甲醛标准溶液0,0.10,0.20,0.50,1.00,2.00,3.00 mL(相当于0,10,20,50,100,200,300 μg甲醛)，置于10 mL具塞比色管中，补加缓冲溶液至5.00 mL，再用衍生液定容至10.00 mL，盖上塞后混匀，60 ℃水浴加热1 h，取出冷却至室温，过0.45 μm微孔滤膜，滤液供HPLC测定。
1.4 样品和空白衍生化步骤分别移取试样和空白1.00 mL，置于10 mL具塞比色管中，补加缓冲溶液至5.00 mL，再用衍生液定容至10.00 mL，盖上塞后混匀，60 ℃水浴加热1 h，取出冷却至室温，过0.45 μm微孔滤膜，滤液供HPLC测定。
1.5 空白实验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。
1.6 液相色谱条件色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm(内径)；流动相：甲醇-水(70∶30，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：365 nm；进样量：5 μL。
1.7 色谱测定以峰面积为纵坐标，甲醛衍生物标准溶液对应的甲醛浓度为横坐标，保留时间定性，外标法定量，绘制标准工作曲线。
取样品和空白处理液进行HPLC检测分析。
2.1 甲醛衍生物标准品色谱图和光谱图在1.6所述色谱条件下，甲醛衍生物的保留时间为22.756 min，色谱图见图1，光谱图见图2。
2.2 标准曲线及相关系数将衍生后的甲醛标准系列溶液按实验步骤进行，在最佳实验条件下，做峰面积(X)与甲醛含量(Y)的关系曲线，见图3，其线性方程为：Y=5×10-6X+0.0124。
由图3可知，在0～30 μg/mL范围内呈良好的线性相关，R2=0.9991。
2.3 精密度精密度实验采用3个浓度的标准溶液5,10,20 μg/mL，每个浓度测定6次，计算其精密度，得到不同浓度甲醛溶液相对标准偏差，结果见表1，分别为1.69%,3.65%和1.62%，都小于4.0%。
2.4 回收率高效液相色谱法的回收率是通过加标实验进行分析，向样品中添加甲醛标准溶液5，10，20 mg/L进液相色谱检测，计算得到回收率为91.0%～108.0%，结果见表2。
2.5 检出限以一定浓度下信噪比(S/N)的3倍为检出限，计算得到该方法的检出限为7.2 μg/L，相当于样品甲醛的检出限为0.1 mg/L。
2.6 样品测定10种样品中甲醛的检测结果见表3。
由表3可知，烟台地区10种酱油均有微量的甲醛检出，含量在6.2～10.0 mg/L范围内，平均值为8.0 mg/L。
其中，酱油中甲醛的平均值为8.0 mg/L，味极鲜中甲醛的平均值为8.0 mg/L，二者之间无差异。
美国环境保护局建议，甲醛每日允许摄入量(ADI)为0.2 mg/kg(体重)[8]，以此计算体重60 kg的成年人日摄入甲醛含量为12 mg以下。
按照每人日摄入酱油量5 mL计算，每日从酱油中摄入的甲醛含量在0.03～0.05 mg，处于安全范围之内。
由于条件所限，获得的样本较少，对不同地域、不同品种、不同发酵方式、不同发酵时间的酱油中甲醛含量差异研究甚少，这也需要我们从这几方面做进一步研究，了解酱油中甲醛的生成因素和存在方式。
采用高效液相色谱法可以检测酱油中的甲醛，方法具有良好的线性关系，重复性好，专一性强；烟台地区的酱油中甲醛含量在6～10 mg/L，酱油中的微量甲醛是酱油生产过程(发酵过程)中自然产生的，含量较低，对人体不会造成危害。
王丽霞(1979-)，女，山东烟台人，讲师，硕士，研究方向：食品化学。
【相关文献】[1]GB 18186-2000，酿造酱油[S].[2]吴玉銮,冼艳萍,郭新东.分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定酱油中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[J].食品安全质量检测学报,2014(5):1357-1364.[3]王书倾,苏雷.食品中甲醛含量与控制[J].食品工业科技，2004(11):137-138.[4]张文德.食品中甲醛的来源及检测意义[J].中国食品卫生杂志,2006,18(5):455-459.[5]藤卷正生，服部達彦，林和夫,等.香料の事典[M].东京：朝仓书店，1982：156-228.[6]SN/T 1547-2011，进出口食品中甲醛的测定液相色谱法[S].[7]马敬军，周德庆，柳淑芳，等.二硝基苯肼衍生-高效液相色谱法测定水产品中甲醛含量的研究[J].海洋水产研究,2005(26):28-31.[8]劳民均,诸葛庆,孟燕青,等.黄酒中甲醛含量的研究[J].分析与检测，2008(12)：152-154.。