第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书

第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书2013-12-07 13:20:16

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379012001b)04896866001c************

1

红色

Transcriptor

Reverse

Transcriptase（逆转录酶）

a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)

b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)

c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)

•储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2

2

无色

Transcriptor RT

Reaction Buffer(5×)

（逆转录缓冲液）

a) 1瓶，1 ml

b) 1瓶，1 ml

c) 2瓶，各1 ml

• 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)

3

无色

Protector

RNase Inhibitor

（RNase抑制剂）

a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)

b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)

c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)

•储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)

4

黄色/

紫色

Deoxynuc-leo-tide

Mix

（dNTP）

a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)

b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)

c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)

• dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM

5

蓝色

Anchored-oligo(dT)18

Primer

（锚定oligo(dT)18引物）

a) 1瓶，100 μl(50 μM)

b) 1瓶，200 μl(50 μM)

c) 2瓶，各200 μl(50 μM)

6

Random Hexamer

a) 1瓶，100 μl(600 μM)

蓝色

Primer（随机引物）

b) 1瓶，200 μl(600 μM)

c) 2瓶，各200 μl(600 μM)

7

绿色

Control RNA

（对照RNA）

a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)

•包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液

8

绿色

Control Primer Mix PBGD

（对照基因引物）

a) 1瓶，40 μl

•5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物

9(b和c为瓶7)

无色

Water, PCR-grade

a) 1瓶，1 ml

b) 2瓶，各1 ml

c) 3瓶，各1 ml

注意：货号为***********和***********的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。

储存条件及其稳定性

请将该产品存放于-15~-25°C条件中，并于产品标签上的有效期之前使用。注意：Control RNA(货号***********的瓶7)应储存于-70°C条件。请避免将产品反复冻融！

2 产品使用方法

2.1 实验前准备

样本材料

RNA模板：分离的总RNA，mRNA，病毒RNA或体外转录的RNA。

注意：想要得到较好的RT结果，使用高质量完整的RNA(不含基因组DNA残留、RNA酶、抑制剂)是必要的。请根据以下预防措施进行操作，避免使RNA在分离过程中受到RNA酶的污染(从细胞裂解开始)：

- 使用RNA酶抑制剂(如Protector RNase Inhibitor)或在使RNA酶失活的分离条件下进行操作。- 如果有必要，用凝胶电泳分析过程中不同步骤(裂解、分离)以确保样本中不含有RNA酶。

- 请记住RNA酶也可能出现在受到污染的玻璃容器中。

为了准备总RNA或mRNA，我们建议您使用罗氏应用科学部的试剂。为了筛选出能够产生高质量的适用于RT-PCR的完整RNA模板，请参考第3部分。补充信息：想了解订货信息或查看相关核酸分离纯化指南，请访问/napure.想了解关于使用MagNA Pure LC System或MagNA Pure Compact System进行核酸自动分离的更多信息，请访问.

引物

•六聚物随机引物

在常规的RT反应中，使用5μg的总RNA模板，可采用60μM的随机引物终浓度。使用5μg总RNA并增加随机引物浓度，将增加短片段PCR产物（的产率，但是相应地，长片段PCR产物及全长转录子的产率会降低。在非特异引物的反转录方法中，随机引物法是最多使用的一种方法，其特异性的扩增产物只能通过后续的PCR反应中使用特异的PCR引物获得。

•锚定oligo(dT)18引物

锚定oligo(dT)18引物特异性地结合在带有poly(A)+的RNA片段上，这类片段通常只占总RNA 的1-2%，因此用锚定oligo(dT)18引物进行反转录所获得的cDNA产率大大低于随机引物方法。如果实验是为了获得新mRNA的RT-PCR产物，则推荐使用锚定oligo(dT)18引物。使用该方法获得的RT-PCR产物具有较强的一致性。

•特异性序列引物

使用特异性序列引物，其终浓度推荐为2μM。但是请注意，即使这些引物在以DNA作为模板的PCR反应中成功获得扩增产物，相同的引物序列却可能难以定位在cDNA片段上。如果遇到此类情况，请使用锚定oligo(dT)18引物重新进行第一链合成反应。

2.2 实验流程

标准RT-PCR流程

在此提供两种不同的操作流程：

• A：反转录使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物。在大多数情况下，只选择其中的一种引物进行cDNA合成。

• B：反转录使用oligo(dT)18引物和六聚物随机引物的混合物。这种方法可提高反应敏感度，但与使用单一oligo(dT)18引物比起来反应特异性会降低。

注意：根据您使用的引物类型，参考以下给出的流程A与B。

流程A：使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物合成cDNA。

以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。图1为单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述。

单一反应

多重反应

RNA+引物+水

可选：变性

10min 65°C

冰上配置多重RT反应混合液(除RNA模板)并分装到各反应管

添加模板RNA到每个反应管中

置于冰上，添加缓冲液，RNase Inhibitor，dNTPs，Transcriptor RT

锚定oligo(dT)18引物/特异性序列引物

30min 55°C或1h 50°C