(整理)医学遗传学实验技术.

Dna 甲基化 DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP。

xMAP 液态芯片（又称流式荧光技术、液相芯片、悬浮阵列等）是在后基因组时代发展起来的新一代标准化开放式高通量技术平台，它有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、重复性好、线性范围广等优点，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，也是是目前唯一得到权威机构和医学界共同认可用于临床诊断的生物芯片平台。

xMAP 液态芯片技术与传统意义上的固相生物芯片技术有所不同,该技术以流式细胞仪作为检测平台,创新性地将微球体作为反应的载体,并将反应置于液相环境中进行。首先,通过红色和橙色两种不同的荧光染料(每种荧光有10 种不同的浓度) 按照不同比例混合将直径为516μm 的聚苯乙烯乳胶微球(microspheres) 染成100 种颜色,即得到100 种不同地址标记的微球。每一种微球表面都带有活性羧基化基团,氨基标记的寡核酸探针就可通过化学反应共价结合到微球表面,蛋白也可以通过氨基与微球进行耦联。每种编码的微球可共价结合并携带一种可以捕获相应目标分子的生物探针,如抗原、抗体、核苷酸片段、受体、酶等。应用时,把针对不同检测物的寡核苷酸探针或蛋白质探针与羧基化的微球进行共价耦联,然后,使载有多种不同探针的微球混合物与待测标本在悬液中相互作用,特异性地结合待测样本中的目标分子(附图) ,并加上荧光标记。由于不同编码的乳胶微球可以放在同一个反应体系内,所以一小份样本可以被用来检测上百个指标[3 ] 。311 灵敏度高312 重复性好,线性范围宽313 快速省时314 高通量由于xMAP 液态芯片技术具有高通量、特异性强、快速、灵敏等一系列优点,国外已经将该技术用于高通量核酸检测[5 ] 、单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析、过敏原筛查、自身免疫病、基因突变和基因表达的检测、抗癌药物筛选、激素水平的测定[6 ] 、核受体与配体相互作用的分析[7 ] 、单克隆抗体的筛选[8 ] 、肿瘤标志物以及关键生物分子如抗原、抗体、细胞因子[9 ] 等的表达或活动水平的变化等研究,并逐步用于临床诊断。

Chip 它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

Identification of ESC ES 细胞具有早期胚胎细胞相似的结构特征, 有较高的核质比和正常的整倍体核型。胚胎细胞在发育的不同阶段, 其细胞表面出现不同的抗原。未分化的人ES 细胞表面SSEA- 3、SSEA- 4、TRA- 1- 60、TRA- 1- 81等呈阳性, 而未分化的小鼠ES 细胞表面仅SSEA- 1 抗原阳性[1- 2]。未分化的ES 细胞表达高水平的端粒酶活性和转录因子Oct- 4, 碱性磷酸酶染色呈阳性。胚胎干细胞的表面抗原是

指在胚胎干细胞未分化状态下高度表达, 一旦分化, 基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期

细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达, 可成为鉴定胚胎干细胞的依据。 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外

培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。

细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。小鼠ES细胞的直径7 μm～18 μm，猪、牛、羊ES细胞的颜色

较深，直径12 μm～18 μm。

Southern RFLP 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段 DNA 的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP 的产生。

不同个体DNA的提取--酶切（PCR扩增目的片断）--凝胶电泳分开DNA片段--转膜--Southern杂交--数据分析--PCR扩增目的片断缺点：RFLP 分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP 多态信息含量低，多态

性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之 RFLP 分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所

以其应用受到了一定的限制Pyrosequencing焦磷酸测序是一种基于聚合原理的DNA测序（确定DNA中核苷

酸的顺序）方法。它与桑格法不同，依赖于核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放，而非双脱氧核苷三磷酸参与的链终止反应。第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测

序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi 可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。

LNA锁核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一种经过修饰的RNA，LNA中一部分核糖上的2'与4'碳连结

在一起。一般可见于A-DNA或RNA。这类核酸可以增加引子或探针（probe）的融解温度（Tm值），加强这些实验用物质的稳定性，可应用在即时聚合酶连锁反应（real-time PCR）等技术中。锁核酸(lockednucleicacid ,LNA)是一种新型的寡核酸衍生物 ,结构中β D 呋喃核糖的2’ O ,4’ C位通过