蛋白酶的发酵及其活力的测定
酶活力测定方法
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法：
紫外-可见分光光度法 旋光法
荧光分光光度法
电化学测定法
酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个 峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别 为0. 4%,0 .6%和0. 8%,峰面积的ＲＳＤ分别为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品37℃ 酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次, 结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生 21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均 分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差 小,重复性好,可用于 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是 稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品 比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
蛋白酶活力测定方法-大肠杆菌生长曲线的测定
实验材料
• 1.实验器材 电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管； 721分光光度计
• 2.实验试剂 (1) 缓冲液：pH 7.5-8.0的 50 mM Tris-Cl缓冲液。 (2) 2%酪蛋白溶液 (3) 三氯醋酸溶液（ TCA ）：10％ TCA (4) 酪氨酸标准溶液：1000μg/mL；100μg/mL (5) 碱性蛋白酶溶液：发酵液上清夜
➢将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样 品的吸光值。
在600 nm波长下，用未接种的LB液体培养 基作空白对照，分别对培养了0、4、8、12、 16和20 h的大肠杆菌培养液，进行光电比浊 测定。对于高浓度的大肠杆菌培养液,要用未 接种的LB培养基进行稀释，使其吸光值不超 过1。
比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润 洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面只 能用吸水纸吸干，以免光面被划破。
➢取出档光体，按100%T/OA键调100%透射 比。
2.样品测定
➢将参比溶液以及被测溶液倒入比色皿中。
➢打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第 一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。
➢将参比溶液推入光路，按100%T/OA键调满 度。
➢按 MODE ， 将 测 试 方 式 调 至 吸 光 度 方 式 （A）。此时,显示器显示“0.000”。
• 福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定， 容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的 混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
• 利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白 酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表 示酶活力。
2. 紫外分光光度计法
• 蛋白质、酪氨酸等氨基酸在200～320nm范围内 有光吸收，最大吸收波长在280nm处，故选此波 长作为测定波长。
胃蛋白酶
一：苏玉永,徐楚鸿,吕永宁.多酶微片胶囊中胃蛋白酶的活力测定[J].2004.24(4):214-1252.1.1对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量,加盐酸溶液(取1 moL·L-1盐酸溶液65 mL,加水至1000 mL,摇匀,即得)制成每1 mL中含0.5 mg的溶液,摇匀,备用。
2.1.2供试品溶液的制备取本品5粒,将内容物中的5片粉红色的胃蛋白酶糖衣片置研钵中,研细。
加上述盐酸溶液少许,研磨均匀,移至100 mL量瓶中。
加上述盐酸溶液至刻度,摇匀。
精密量取适量,用上述盐酸溶液制成每1 mL中约含0.2～0.4单位的溶液。
2.1.3测定法取试管6支,其中3支各精密加入对照品溶液1 mL,另3支各精密加入供试品溶液 1 mL,置(37±0.5)℃水浴中,保温 5 min。
精密加入预热至(37±0.5)℃的血红蛋白试液5 mL,摇匀,并准确计时,在(37±0.5)℃水浴中反应10 min。
立即精密加入5%三氯醋酸溶液5 mL,摇匀,滤过。
取续滤液备用。
另取试管2支,各精密加入血红蛋白试液5 mL。
置(37±0.5)℃水浴中保温10 min,再精密加入5%三氯醋酸溶液5 mL。
其中1支加供试品溶液1 mL,另1支加盐酸溶液1 mL,摇匀,滤过。
取续滤液,分别作为供试品和对照品的空白对照,照分光光度法,在275 nm波长处测定吸收度,见图1,图2。
算出平均值A s和A,按下式计算:式中,As为对照品的平均吸收度;A为供试品的平均吸收度;Ws为对照品溶液每1 mL中含酪氨酸对照品的量μg;n为供试品稀释倍数。
在上述条件下,每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmoL酪氨酸的酶量,为一个蛋白酶活力单位。
2.2干扰试验按照处方配制无胃蛋白酶的空白样品,取适量,按2.1项下方法操作,结果在275 nm波长处几乎无吸收,说明处方中其他组分对胃蛋白酶活力的测定无干扰。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
酶测定、方法
总蛋白酶活性测定用氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物测定。
偶氮酪蛋白以20 mg/L的浓度溶于0.15molL /NaCI溶液。
取该液0.3mL加人含中肠酶液的0.3mL PH7.2磷酸盐反应缓冲液中反应。
在30℃反应2h,加人0.6mL的2 0%(重量/体积)三氯乙酸终止反应。
反应混合物在11200 x g、4℃下离心15min后,取上清液,在366nm测光吸收值。
反应混合物1个吸收单位的变化定义为1个偶氮酪蛋白单位。
类胰蛋白酶活力测定采用两种专性底物:BAPN A和TAME。
BA PNA以2 0mgm /L溶于二甲基亚矾,取40ul 加入含中肠酶液的1.5mL PH7.2的磷酸盐L反应缓冲液中,反应20min后,加人0.5mL30%(体积/体积)乙酸终止反应,在405nm测光吸收值。
TAME以2mmol/L 溶于0.15mol/L NaCI溶液中。
反应缓冲液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液，其余反应步骤同强碱性类胰蛋白酶活性测定，最后在248 nm测定吸光值.淀粉酶活性的测定: 主要按照3，5- 二硝基水杨酸法(张桂芬等，2008)进行，具体的操作步骤为: 1) 标准曲线的制作: 配制浓度为1．0 mg/mL的麦芽糖标准溶液10 mL，测定时分别稀释至0.2，0.4,0.5,0.6, 0.7，0.8 和1.0 mg/mL。
依次取上述溶液10 μL 分别移入0．2 mL PCR 管，每管加入10 μL 显色剂(3，5- 二硝基水杨酸试剂)，置沸水浴中煮沸5 min，冰浴冷却后加入蒸馏水80 μL。
以微量移液器取混合溶液90 μL 移入酶标板(美国Costor)，立即于490 nm 处读取OD 值，并确定OD值与麦芽糖含量之间的对应关系; 2) 样品酶液的测定: 取5 μL 浓度为1 % 的淀粉溶液移入0．2 mLPCR 管中，加入5 μL 待测样本酶液，混合均匀，于25℃温浴3 min 后加10 μL 显色剂(3，5- 二硝基水杨酸试剂)终止反应。
蛋白酶产生菌的分离、鉴定及发酵条件研究
实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。
溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。
调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。
反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。
分装、包扎、灭菌。
霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。
分装、包扎、灭菌。
产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。
pH7．0。
配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。
选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。
固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。
筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。
1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。
固态发酵-米曲霉的培养及蛋白酶
1.在扎瓶口时，我们组并不使用棉绳，而是橡皮 筋
2.过滤时，滤液的体积不一
3.比色皿表面的光滑程度影响了 结果
Thanks
2.编号试管1,2为空白试管，3,4试 管为样品试管 3.空白试管中加入2ml三氯乙酸， 40℃保温20min，然后加入1ml酪蛋 白在40℃中保温10min，样品试管加 入顺序相反
溶液分别过滤到新的试管中
样品
加入淀粉 加入葡萄糖 加入蔗糖 加入面粉 空白对照
粗酶液体积 （mL） 84.7 85.0 75.3 83.1 84.0
三、实验步骤
1. 实验室保藏的米曲
霉菌种接种PDA斜面， 30 ℃恒温培养3d。
• 此处为培养3天的米曲
霉
2. 新鲜斜面加6ml无菌 水制成孢子悬液，吸取 1ml的孢子悬液分别接 种到5种固态培养基中 （250 mL三角瓶装）
• 图示为未接种孢子的培养基
图示为接种孢子的培养 基
30 ℃恒温培养3 d成曲（每培养 8~12 h摇瓶1次）， 米曲霉培养物提 取制得粗酶液
左图为8小时摇瓶后，右图 为72小时
准确称取5 g充分研细的 成曲，按加水比1：20加 入蒸馏水，40℃水浴内间 断搅拌30分钟，滤纸过滤， 滤液即为粗酶液，用量筒 准确测量粗酶液的体积V （mL）。取1ml粗酶液用 0.1 mol/L pH7.2的磷酸 缓冲液稀释10倍后测酶活 力。
图示为过滤的粗酶液
活力来说，在葡萄糖培养基中的酶活力最高， 淀粉培养基的酶活与其相近；而蔗糖培养基， 面粉培养基，只有麦麸和豆粕的培养基酶活力 比其它的极显著降低。
• 我们可以得出：额外添加营养物质可以提高酶
活产率，而单糖和二糖比多糖对米曲霉产酶更 为有利。
• 问题讨论
7 胰蛋白酶活力的测定
中国海洋大学实验报告姓名庞裕智专业年级生命基地班2011 题目胰蛋白酶活力的测定学号040312011025 科目生物化学实验时间周一90节同组者田特一、实验目的学习和掌握胰蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
三、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅四、实验试剂、1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)五、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂：滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂六、实验结果酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数由标准曲线知，当OD680=0.244时，样品中酪氨酸的微克数为A=181ug ∴样品中胰蛋白酶活力单位为181/15×13=156.87七、实验分析1.注意事项（1）胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；（2）要在酶的最适温度40℃下反应；（3）要在酶的最适PH为7.5调节下反应；（4）催化反应的时间控制精确；（5）向样品测定的1号试管加入三氯醋酸时要快；（6）加入各种药品的量要精确，特别是酶。
中性蛋白酶的测定方法
中性蛋白酶的测定方法中华人民共和国行业标准（QB1805.3-93）1 主题内容与适用范围本标准规定了工业用蛋白酶制剂的技术要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存要求。
本标准适用于采用表1中的菌种，以发酵法生产经提纯制取的蛋白酶制剂。
表1类别代号生产菌酸性蛋白酶 537 宇佐美曲霉(asperigillus usamii No.537)3350 黑曲霉（asperigillus niger No.3350）中性蛋白酶 1.398 1.398为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis N0.1.398)3942 39423为栖土曲霉(aspergillus terricola No.3942)166 166放线菌(actinomyces No.166)碱性蛋白酶 2709 为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis N0.2709)CW301 为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis N0.CW301)209 为短小芽孢杆菌(bacillus pumilus N0.209)SMJ 为嗜碱短小芽孢杆菌(alkaliphilic bacillus No.SMJ)CW302 为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis N0.CW302)2 引用标准QB/T1803 工业酶制剂通用试验方法QB/T1803 工业酶制剂通用检验规测和标志包装、运输、贮存3 产品分类3.1 产品按形态分为固体酶和液体酶两种剂型3．2 产品按作用的pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶三种，其代号与生产菌分别见附表14 技术要求4.1 外观要求固体剂型：黄褐色粉末，无结块，无潮解现象。
液体剂型：棕褐色液体，允许有少量凝聚物中性蛋白酶活力测定方法（国家标准）1 定义1 g固体酶粉（或１ｍl液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min 水解酪素产生1 ug 酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
蛋白酶产生菌的分离
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。
也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。
本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。
2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。
2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 15-20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
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蛋白酶的发酵及其活力的测定
实验设计方案
1、实验目的：
1.1、了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；
1.2、了解蛋 白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发
酵及其活力测定的方法
2、实验内容：
2.1蛋白酶的发酵
2.2 绘制试验菌的生长曲线
2.3蛋白酶活力的测定
3、实验原理：
将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养
基，直接进行发 酵，30-32 ℃震荡培养48 h，将发酵液过滤或离心，
取清夜检测蛋白酶活力。采 用福林-酚试剂法。 福林-酚试剂在碱性
条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和 钨蓝混合物)，由于蛋白
质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使 蛋白质及
其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以
酪 蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段
时间后终止酶促 反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清
液，用Na2CO3碱化，再加入 福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤
液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用 分光光度计在680nm
波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
4、实验材料和用具：
菌种，产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种；酶源，蛋白酶发酵液；培
养基及试剂， 产蛋白酶发酵培养基；蛋白酶活力检测试剂；722S 分
光光度计、恒温水浴锅、 量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪等。
5、 实验步骤：
5.1 发酵 将产蛋白酶芽孢杆菌接入含 150 ml 液体发酵培养
基的 250 ml 三角瓶中， 30-32 ℃ 摇瓶发酵，18 h 后进行酶活力
测定。将以上发酵液按 1：50 的比例加入新鲜培养 基中继续发酵。
按时间取出菌液 3000r /min 离心 3min 取上清液测酶活，沉淀物
测生长曲线
5.2 绘制试验菌的生长曲线 取4支试管编号(1号为空白对照)，
空白加入10ml生理盐水，其余的按比例加入生 理盐水溶解后测定
600nm吸光值
5.3 蛋白酶活力测定将酪素溶液放入40℃的水浴中预热5min
按下列程序操作
试管A （空白）
↓
加酶液1.00ml
↓40±0.2℃ 2min
加 三 氯 乙酸2.0ml(摇匀)
↓ 40±0.2℃ 10min
加 酪素1.00ml(摇匀)
↓
3000r离心3min
↓
取1.00ml上清液
↓
加碳酸钠溶液5.0m L
↓
加福林试剂使用液l.00 mL
↓ 40±0.2℃显色20min
于 680 nm波长用 l0m m比色
皿测其吸吸光度
试管B
↓
加酶液1.00ml
↓
40±0.2℃ 2min
加 三 氯 乙酸2.0ml(摇匀)
↓ 40±0.2℃ 10min
加 酪素1.00ml(摇匀)
↓
3000r离心3min
↓
取1.00ml上清液
↓
加碳酸钠溶液5.0m L
↓
加福林试剂使用液l.00 mL
↓0±0.2℃显色
20min于 680 nm波长用 l0m m比色
皿测其吸吸光度
6、相关培养基与试剂：
6.1产蛋白酶发酵培养基： 胰化蛋白胨10g 酵母提取物
5g NaCl 10g 调PH至7.0左右 1000ml蒸馏水
6.2蛋白酶活力检测试剂：
6.21 、福林-酚试剂 向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸
钠 (Na2WO4.2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入
50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以
文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子
水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈
黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至
1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存
备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。
6.22 、0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液 精确称取TCA65.4g，加去
离子水定容至1000mL。
6.23 、 0.4mo1/L碳酸钠溶液 精确称取无水碳酸钠42.4g，加去
离于水溶解后，定容至1000mL。
6.3、氢氧化钠溶液c(NaOH)=0. 5mol/L
6.4、 盐酸溶液c(HCI)=lmol/L及0. lmol/L
6.5、磷酸缓冲液(pH=7.5 )，适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠
(Na,HP0,·12H,0)6. 02 g和磷酸二氢钠(NaH,PO,·2H,0)0. 5g ，加水溶
解并定容至I000mL
6.6、l0g/L酪素11溶液 称取酪素 1.000g，精确至0.00 lg，用少量
0.5m ol/L氢氧化钠溶液湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液
约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人
100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱
内贮存，有效期为三天。
6.7、100μg/mL酪氨酸溶液精确称取100mg酪氨酸，逐步加入
0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存，临
用时用去离子水稀释10倍。
7、计划时间表：
时间 9：00
11:00 13:00 15:00 17:00 !9:00 21:00
第一天 配制培养基及各种试剂 对将用到的器材灭菌 接种0号样
第二天 接种1号样测样1中0小时酶活及生长OD 测样1中2小时生长OD 测样1中4小时酶活及生长OD 测样1中6小时生长OD 测样1中8小时酶活及生长OD 测样1中10小时生长OD 测样1中
12小时
酶活及生
长OD 接
种2号样
第三天 测1中24小时酶活 测2中14小时OD 测2中16小时OD及1中28小时酶活 测2中18小时OD 测2中20小时OD及1中32小时酶活 测2中22小时OD 测2中24
小时OD
及1中36
小时酶活
第四天 1中48小时酶活 测2中40小时酶活及1中52小时酶活 测2中44小时酶活及1中56小时酶活 测2中48
小时酶活
及1中60
小时酶活
第五天 测2中60小时酶活 测2中64小时酶活 测2中68小时酶活 测2中72
小时酶活
蛋白酶的发酵及其活力的测定
实
验
设
计
方
案
组员：
海向林 谢峰
钟博龙 陶文东 王金涛