胆红素含量的测定
HPLC法测定复方氨酚那敏颗粒中人工牛黄的胆红素的含量
取2.6项下的第3份溶液，按上述色谱条件取10ul注入液相色谱仪测定峰面积，连续进样6次，RSD＝0.8%（n＝6）
2.8重复性试验和稳定性试验
取同一样品的6份按含量测定项下方法测定，结果为99.8%，RSD为0.9%（n＝6）取上述供试品溶液1份，按以上色谱条件测定峰面积，分别在0,0.5,1,1.5,2,3,4h测定峰面积RSD为0.8%（n＝7），表明本样品溶液在实验所需的时间内稳定。
1仪器与试药
1.1仪器
岛津LC-2010A高效液相色谱仪，超声波药品处理机（济宁金百特）
1.2试药
胆红素对照品购自中国药品生物制品检定所。复方氨酚那敏颗粒，万荣三九药业有限公司（批号：090803 100309 100608 100707 100505）甲醇为色谱纯试剂，磷酸、三氯甲烷为分析纯，水为蒸馏水。
取复方氨酚那敏颗粒5批，照2.3项下的方法操作，在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10ul注入色谱仪，测定峰面积，以外标法计算含量，结果人工牛黄含量分别为10.1、10.5、10.0、9.9、10.0mg/袋。
3讨论
从含量测定的结果可以看出，用高效液相色谱法测定其含量，简便快捷、定量准确，样品中其他成分与胆红素分离较好，可通过测定人工牛黄的含量有效的控制药品质量。
2.5干扰试验的测定
取对照品溶液、供试品溶液，空白样品溶液各10ul，按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果空白无干扰。色谱图见图1.
A图对照品B图样品C空白样品
2.6线性关系
精密量取浓度为0.1614mg/ml的胆红素贮备液，精密量取适量，分别加三氯甲烷-甲醇-水（90:10:0.3）的混合液制成浓度为3.228、4.842、6.456、9.684、12.912、16.140ug/ml的胆红素对照品溶液。取上述溶液各10ul按上述色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品浓度X（ug/ml）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归r＝0.9997。结果表明，在3.229～16.14ug/ml范围内与峰面积的线性关系良好。
最新实验十八 血清胆红素测定(改良J-G法)
实验十八血清胆红素测定(改良J-G法)（改良J-G法）【目的】1.熟悉血清胆红素测定的原理和方法；２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。
【原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。
醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
【器材】试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。
【试剂】1．咖啡因试剂称取无水水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na）0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解（加2入咖啡因后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，混匀。
过滤后置棕色瓶，室温保存。
2．碱性酒石酸钠溶液称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。
置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L亚硝酸钠溶液仅供学习交流冰箱保存，稳定期不少于2周。
若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。
4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。
5．重氮试剂临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。
6．5.g/L叠氮钠溶液7．胆红素标准液（1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。
取过滤后的血清1ml，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。
三种总胆红素常规检测方法的比较
基础医学B a s i c M e d i c i n e35正常人体胆红素主要来自血中衰老的红细胞。
红细胞平均寿命为120天，衰老的红细胞所释放的血红蛋白在体内经过一系列的代谢，最后变成胆红素，分为非结合胆红素与结合胆红素，分别从大、小便中排出。
正常时血液中只含有微量的胆红素。
胆红素的研究是临床医学中古老而又重要的课题。
血清胆红素测定是肝、胆功能检查中的一项重要检测项目。
重氮盐法检测胆红素被临床实验室广泛采用，但该法易受许多因素的干扰、试剂无法长期稳定，在疾病诊断中受到一定的影响。
随着全自动生化分析仪的普及和应用，要求不断推出新的胆红素测定方法[1]。
钒酸氧化法容易污染仪器，对别的测试产生影响[2]。
总胆红素的酶法测定早有报道，其方法学较为成熟，操作简便，快速准确，试剂可以长期稳定，特异性好，干扰少，但因为酶的来源、纯度、稳定性及一个波长测定不同胆红素成分等问题，应用具有局限性，在临床实际应用中未能得到推广。
提高酶法胆红素测定特异性的关键是选择BO D 对胆红素特异性氧化的反应条件，尽可能地加快B O D 对直接胆红素和间接胆红素的氧化。
复星长征公司研究出的产品跟重氮试剂的临床相关性较好。
1材料和方法1.1材料1.1.1重氮盐法检测试剂盒（罗氏公司）；钒酸氧化法检测试剂盒（北京利德曼生化技术有限公司）；酶法检测试剂盒（复星长征公司）。
1.1.2仪器A U 400全自动生化分析仪。
1.1.3标准与质控品标准品采用试剂配套校准品定值质控液（R A N D O X ）cl i nqa 定值血清。
1.2方法1.2.1测定方法几种总胆红素测定方法按试剂说明书进行操作。
1.2.2干扰液的制备脂肪乳干扰液：临床用50%的脂肪乳剂，以生理盐水10倍稀释到5%。
血红蛋白干扰液的制备：抽取4m l 新鲜血液置于生理盐水试管中，用生理盐水反复洗涤数次后，加入蒸馏水反复摇匀，使红细胞完全溶解（镜下瑞氏染色检查），离心沉淀后吸取上清液。
直接胆红素测定(D-BIL).
胆红素 ＋氯化重氮苯磺酸 物
紫红色的偶氮化合
加速剂为二甲基亚砜，使游离的胆红素分子内的次级键断 裂，极性上升，与重氮试剂反应。 λ=接胆红素的测定 实验参考值： 2~18μmol/l 临床意义： 当血清胆红素浓度超过34.2μmol/L时，会 导致皮肤、巩膜黄染的现象，这称为黄疸。 根据黄疸的发病机制可分为三类：
注意事项
样品的活性超出可测线性范围上限时，需 进行生理盐水稀释，测定结果乘以稀释倍 数。 叠氮钠能破坏偶氮试剂，终止偶氮反应， 凡用叠氮钠作为防腐剂的质控血清，可引 起重氮反应不完全，甚至不呈色。
总胆红素测定（T -BIL）
实验原理
对氨基苯磺酸 ＋ 亚硝酸钠 氯化重氮苯磺酸 ＋ NaCl ＋ 2H2O
使上端胆管内压力不断升高，最后使小胆
管和毛细胆管扩张，通透性增加，甚至破
裂，使胆汁返流入血，血中结合胆红素增 加。
3. 肝细胞性黄疸（肝源性黄疸） 由于 肝细胞病变，肝功能减退，使肝脏对胆红 素的摄取、转化和排泄作用发生障碍。一 方面肝脏不能将未结合胆红素转化成结合 胆红素，使血中未结合胆红素增加；另一 方面，病变区压迫毛细胆管，使结合胆红 素返流入血，血中结合胆红素也增加。
1. 溶血性黄疸（肝前性黄疸） 由于各种
原因使红细胞大量破坏，以致未结合胆红素
明显增加，超过肝脏的转化能力，但结合胆
红素正常。新生儿血脑屏障发育不全，游离
胆红素易进入脑组织，与脑部基底核的脂类
结合，将神经核染成黄色，称为核黄疸（胆
红素脑病）。
2. 阻塞性黄疸（肝后性黄疸） 由于
胆道阻塞，胆汁不能排出而淤积在胆管内，
胆红素 ＋氯化重氮苯磺酸 偶氮化合物
结合胆红素测定实验报告
1. 了解胆红素测定的原理和方法。
2. 掌握使用分光光度计测定胆红素浓度的操作技能。
3. 学会分析实验结果，了解胆红素在人体中的作用。
二、实验原理胆红素是人体内血红蛋白分解产物，具有橙黄色。
胆红素在血液中与白蛋白结合，形成胆红素白蛋白复合物。
通过分光光度计测定胆红素在特定波长下的吸光度，可以计算出胆红素浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 血清样本- 胆红素标准溶液- 生理盐水- 酚酞指示剂- 10%三氯醋酸溶液- 10%氢氧化钠溶液2. 实验仪器：- 分光光度计- 移液器- 离心机- 试管- 烧杯- 移液管- 容量瓶1. 标准曲线绘制：（1）取10支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL胆红素标准溶液。
（2）加入生理盐水至2.0 mL。
（3）加入酚酞指示剂2滴。
（4）加入10%三氯醋酸溶液2.0 mL。
（5）混匀，静置30分钟。
（6）用分光光度计在波长510 nm处测定吸光度。
（7）以吸光度为纵坐标，胆红素浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 血清胆红素测定：（1）取血清样本2.0 mL，加入生理盐水至2.0 mL。
（2）按照步骤1中的方法，加入酚酞指示剂和10%三氯醋酸溶液。
（3）混匀，静置30分钟。
（4）用分光光度计在波长510 nm处测定吸光度。
（5）根据标准曲线，计算血清胆红素浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：标准曲线线性范围为0～1.8 mg/L，相关系数R²=0.998。
2. 血清胆红素测定：本实验测得血清胆红素浓度为 5.2 mg/L，略高于正常范围（3.4～17.1 mg/L）。
六、实验结论本实验通过分光光度法测定了血清胆红素浓度，结果显示受试者血清胆红素浓度略高于正常范围，可能存在轻微的黄疸症状。
建议受试者进一步检查肝功能，以排除其他疾病。
七、实验讨论1. 实验过程中，注意保持操作环境的清洁，避免污染。
三种黄疸实验室检查鉴别要点
三种黄疸实验室检查鉴别要点一、血清胆红素测定血清胆红素是一种重要的生化指标，可以帮助医生鉴别黄疸的病因。
血液中的胆红素主要是由红细胞在脾脏和肝脏内分解产生的，正常情况下，血清胆红素的含量很低。
当肝脏出现问题，导致胆红素无法正常排泄时，血清胆红素的含量就会升高，从而导致黄疸的出现。
对于血清胆红素测定的鉴别要点包括：1. 总胆红素和直接胆红素的含量：总胆红素是指血液中的胆红素总量，包括游离的（非结合的）和结合的，而直接胆红素仅指结合的胆红素。
通过测定总胆红素和直接胆红素的含量，可以帮助医生判断黄疸是由肝脏疾病还是胆道疾病导致的。
如果直接胆红素升高，则提示胆道疾病可能性大；而如果总胆红素和直接胆红素均升高，则更可能是肝脏疾病引起的黄疸。
2. 非结合胆红素的含量：非结合胆红素是指血液中的游离胆红素，通常由于溶血性贫血或肝脏疾病引起。
如果非结合胆红素升高，则提示可能是由溶血性贫血导致的黄疸。
3. 肝脏功能检查：在进行血清胆红素测定时，医生通常还会检查肝功能相关指标，如丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）等。
通过分析这些指标的含量，可以帮助医生判断黄疸是否是由于肝脏疾病引起的。
二、尿胆红素测定尿胆红素是一种常用的黄疸鉴别检查指标，通过检测尿液中的胆红素含量，可以帮助医生鉴别黄疸的病因。
尿液中的胆红素通常是由于血液中的胆红素无法被肝脏正常排泄而导致的。
对于尿胆红素测定的鉴别要点包括：1. 尿胆红素的含量：正常情况下，尿液中是不应该含有胆红素的，因此如果尿液中检测到胆红素，则提示有肝脏疾病或胆道疾病导致的黄疸可能性大。
2. 尿胆红素/尿胆原比值：尿胆红素/尿胆原比值的测定可以帮助医生鉴别肝内和肝外黄疸。
肝脏疾病所致的黄疸通常引起尿胆红素/尿胆原比值的升高，而胆道梗阻引起的黄疸则通常不会引起这个比值升高。
3. 尿液颜色：通过观察患者的尿液颜色，也可以初步判断黄疸的病因。
如果患者的尿液呈现深色，可能由于尿液中含有大量的胆红素，提示可能是肝脏疾病所致的黄疸。
HPLC法测定古日冲水丸中胆红素的含量
Ａｉ ： ｂｅｔ ｅＯ ｓ ｂｉ ａＨ Ｌ ｔｏ ｒ ｈ ｅｅｍ ｎ ｔ ｎＯ ｉｒｂｎｉ ｕｉ ｏ ｇＤ ｗ ｎ Ｍ ｅｈ ｄ ｓ ｇ ｍ Ｏ ｊｃ ｖ ｅｔ ｌ ｈ Ｐ Ｃ ｍｅ ｄｆ ｅｄ ｔ ｉａｉ ｆ ｌｕ ｉ ｎＧ ｒ ｈ ｎ ｉ ａ． ｔｏ ｓ ｉ ｉ ａ ｓ ｈ ｏｔ ｒ ｏ Ｂｉ ｃ Ｕ ｎ Ｃ ８ｃｌｍ （ ． １ ｏｕ ｎ ４６ ｍｍ ×１０ ｍ， ）Ｔ ｅ ｂｌ ｐ ａｅ ｏ ｓ ｔｄＯ ｅ ａ ｏ ａ ｅ ｍｉｉ 一 ％Ａ ｅｉ ａｉ Ｇａ ｉ ５ ｒ ５ ． ｈ ｉ ｈ ｓ ｎ ｉｅ ｆ ｔ ｎ ｌ ｃｔ ｔｌ １ ｃｔ ｃ ｌ ａ ａ ｍｏ ｅ ｃ ｓ Ｍ ｈ — ｏ ｒｅ ｃ ｄ ｃｌ
指标 。采用 高 效液相 色谱 法对 本 品 中的胆 红素建 立 氯 甲烷 ５ ｍ ， 热 （０Ｃ） 溶 解 ， 冷 ， 甲 醇 ０ｌ微 ５￣ 使 放 加 含量测 定方法 。 通过 试验 ， 确定 了 比较 理想 的色谱 条
１ｍ ， 匀 ， 二 氯 甲烷 一甲醇 （ ：） 合 溶 液 至刻 ０ ｌ摇 加 ５ １混
件。 并经 过方法 学考 察及 阴性对 照实验 ， 明该方法 度 ， 匀 ， 密 量取 ５ ｌ 置 ２简 单 ， 重现 性 好 ， 属性 强 ， 中其 它 组分 对 胆 烷 一 甲 醇 （：） 混 合 溶 液 至 刻 度 ， 摇 匀 ， 专 方 ５１ 在
Ｄｉ ｎ ｗａ ．
胆红素
胆红素的检测方法及其临床应用刘军摘要:胆红素是人体内血红蛋白等化合物分解代谢形成的一种色素，传统观念认为它是对机体有害的一种物质。
近一个世纪来，临床上一直把血中高胆红素含量作为肝胆系统疾病的一个诊断指标。
随着近年来对胆红素的深入研究，胆红素在人体内的生理功能重新得到了认识，并随着对胆红素检测方法的不断探索，胆红素的检测也越来越准确。
本文拟在阐明胆红素检测方法的基础上，综述血清胆红素水平与临床疾病关系的最新研究进展。
关键词：胆红素人体血清（浆）中的胆红素（Bilirubin，简称BR）是体内血红素的的一种代谢产物，分子量为584.65D.L，其中80%～90%来自于血红蛋白，10%～20%来自于肌红蛋白、环氧化酶等其他蛋白。
经过大量研究证实，胆红素具有4种异构体，动物体内的胆红素是IXα异构体（BR IXα），分子式为C33H36N4O6，属四吡咯胆红素，在溶液中不稳定，易被氧化成胆绿素（BV IX α）或氧化降解为无色产物，在碱性溶液中，加热、光照或有金属离子存在时，其稳定性更差，但低温、避光等会增强其稳定性。
对胆红素的这些分子结构、理化性质等特性的深入研究以及准确的定量测定将有助于其在临床上的应用。
胆红素的生理作用近来的研究表明，胆红素在人体内具有抗氧化作用，能清除自由基，抑制脂类和脂蛋白过氧化，改变某些酶的活性，阻断DNA分子，减轻氧化损伤，它与人体内其它抗氧化防御系统（GSH、SOD、VITE）具有协同作用。
大量研究发现胆红素具有明显抑制低密度脂蛋白的氧化修饰作用，减缓对血管内皮的损伤，抑制血栓和泡沫细胞的生成，从而防止和降低动脉粥样硬化的发生，胆红素除本身的抗氧化作用外，胆红素还能通过抑制蛋白激酶C 发挥细胞保护作用。
在一定条件下，胆红素会生成一种被称为肝脏生长因子（LGF）的白蛋白-胆红素复合物，其对肝细胞有再生作用，Ossloa等通过实验证明，胆红素能明显抑制肝脏内脂质过氧化物的增高，阻止抗氧化酶的降低。
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胆红素含量的测定
胆红素含量的测定
胆红素含量的测定分为四个阶段:标准溶液和供试液的配制，标准曲线的绘制和试品的测定及含量的计算。
第一步:胆红素标准溶液和供试液配制。
在天平上精确称取胆红素0。
01克，试品(就是欲测含量的胆红素)001克，分别再以95%浓度的乙醇稀释至50毫升刻度，此时标排溶液每毫升相当于0。
00002克胆红素。
第二步:胆红素标准曲线的绘制。
精确吸取胆红素标批溶液0、1、2、345毫升到带色试管中，分别加入95%浓度乙醇9、87、8、5、4毫升，使各带色试管为9毫升，再加入重氮化试剂1毫升，混合均匀，在20℃度处化静放1小时，再在波长520纳米处测定光密度，并以光密度为纵坐标，各量所含胆红素浓度为横坐标，作出标准曲线。
重氮化试剂的配制，溶液A:对氮基苯磺酸1克，加浓盐酸15毫升，加水985毫升溶液B;0.5%浓度亚硫酸钠溶液。
临用重氮化试剂时，可取10毫升 A溶液，加0。
3毫升B溶液混匀即得。
第三步:胆红素试品的测定。
取供试液3毫升，加入5%浓度乙醇6毫升，重舞化试剂1毫升，混匀。
在暗处测定光密度，从标准曲线查得胆红素的毫克数。
第四步:含量计量公式。
样品胆红素含量测定计算公式:样品胆红素含量%=(标准曲线上查得的胆红素x100x5)+(样品毫克数x30x100%。