总结总、直接胆红素的检测方法
检验科生化直接胆红素测定的标准操作规程
直接胆红素测定的标准操作规程【目的】体外检测血清直接胆红素（DBIL）的含量。
【职责】1.实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。
2.本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。
【标本类型及实验前准备】1.受检者的准备病人空腹12h，不饮酒24h后采集血样。
体检对象抽血前应有两周的的正常状况记录。
注意有无应用影响测试项目的药物。
此外，对于体检者，采血的季节都应做相关记录，因为样本中各项目的含量有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。
对于体检对象抽血前应有2周时间保持平时的饮食习惯，应嘱体检对象在抽血前24小时内不做剧烈运动。
2.静脉采血除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。
体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。
在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。
【仪器设备】东芝TBA-FX8全自动生化分析仪，低速离心机一、检测原理钒酸盐胆红素胆绿素PH3.0测定钒酸盐作用前后吸光度差异，可求标本中直接胆红素的浓度。
二、试剂1.试剂本科使用北京利德曼生化股份有限公司DBiL试剂盒，为液体双试剂，各组分如下：2.校准要求使用去离子水与校准品两点定标，详见说明书；正常情况下，应每两周对测定进行一次校准。
三、操作测定（试剂准备液体试剂，直接使用，无需配制。
）四、计算DBIL=校准液（△A=A2-A1）×(△A标准/△A校准)五、质控程序1.建议采用朗道水平2(正常范围质控）和水平3（病理范围质控）两个水平的血清进行室内质控。
2.可接受性判断质控物的检测值应在给定质控范围，或可以通过参加卫生部室间质评对实验室的运作情况进行系统评估。
3.质控操作每日进行样本检测之前首先应进行质控操作，以考察系统的在控情况。
如果检测结果符合质控要求则进行样本操作；如果不符合质控要求，则应重复质控操作，以排除可能发生的偶然误差；如果仍不符合质控要求，则应考虑质控品的重新准备、试剂的重新校准或更新、仪器的维护等。
生化检测项目
生化检测项目肝功能#1．总胆汁酸TBA 检测方法：速率法2．前白蛋白PA 检测方法：速率法-----在生化仪上检测结果不好，正常是用特种蛋白仪检测3．腺苷脱氨酶ADA 检测方法：速率法-----在生化仪上检测结果不好，试剂非常贵，建议不做。
4．α-L-岩藻糖苷酶AFU 检测方法：速率法-----在生化仪上检测结果不好，试剂非常贵，建议不做。
5．5′-核苷酸酶5′-NT 检测方法：速率法-----在生化仪上检测结果不好，试剂非常贵，建议不做。
#6．总胆红素TBIL-----钒酸盐法试剂试剂稳定性好，但结果稳定性不好检测方法：终点法-----重氮法试剂试剂稳定性不好，但结果稳定性好检测方法：终点法#7，直接胆红素DBIL-----钒酸盐法试剂试剂稳定性好，但结果稳定性不好检测方法：终点法-----重氮法试剂试剂稳定性不好，但结果稳定性好检测方法：终点法#8。
谷丙转氨酶ALT 检测方法：速率法#9。
谷草转氨酶AST 检测方法：速率法#10。
γ-谷氨酰基转移酶GGT 检测方法：速率法#11。
碱性磷酸酶ALP 检测方法：速率法#12。
胆碱酯酶CHE 检测方法：速率法#13。
总蛋白TP 检测方法：终点法#14。
白蛋白ALB 检测方法：终点法血糖#1。
葡萄糖GLU 检测方法：终点法2。
糖化血清蛋白/果糖胺/糖化血红蛋白要用专仪器做。
生化仪做不准。
血脂#1。
甘油三酯TG 检测方法：终点法#2。
总胆固醇CHO 检测方法：终点法#3。
高密度脂蛋白胆固醇HDL 检测方法：终点法#4。
低密度脂蛋白胆固醇LDL 检测方法：终点法#5。
载脂蛋白A1 APoA1 检测方法：终点法#6。
载脂蛋白B APoB 检测方法：终点法7．脂蛋白a LP(α）检测方法：终点法-----在生化仪上检测结果不好，正常是用特种蛋白仪检测肾功能#1。
肌酐CREA------苦味酸的试剂，检测方法：固定时间法------酶法的试剂，检测方法：终点法#2。
胆红素指标的解读
胆红素指标的解读使用干化学法检测胆红素，可以提供总胆红素(TBIL)、结合胆红素(Be)、未结合胆红素(Bu)、6胆红素(DELB)、新生儿胆红素(NBIL)、直接胆红素(DBIL)等指标。
以下是对胆红素指标的解读。
TBIL：血液中总的胆红素，包含胆红素的所有组分，TBTL的升高表明黄疸的存在，但单凭TBTL不能了解黄疸的形成原因。
Bu：可认为是肝前性的胆红素，是尚未被肝细胞摄取进行葡萄糖醛酸化的胆红素，导致Bu的升高原因有肝前性(胆红素生成增多，如溶血等)和肝细胞性(肝细胞摄取Bu障碍或胆红素葡萄糖醛酸化过程受阻等)的原因。
Be：可认为是肝细胞性或肝后性胆红素，是被肝细胞摄取并完成葡萄糖醛酸化的胆红素，生理情况下，Be形成后，即通过肝胆系统排泌。
生理状态下，Be不应出现在血液中，只有在Be排泌受阻的情况下，Be才可能出现在血液中。
所以，通常情况下，Be结果为0, Be升高意味着肝细胞功能受损或胆汁排泌受阻。
6胆红素(DELB)：生理状态下，血液中不存在6胆红素，如果Be排泌受阻，导致血液中Be升高，Be浸泡在白蛋白的环境中发生酶促反应，白蛋白置换Be所结合的葡萄糖醛酸，最终生成6胆红素，其半衰期与白蛋白的半衰期相同。
5胆红素的作用在于指示梗阻的治疗效果，当梗阻排除后，Be迅速下降，TBIL也随之下降，而6胆红素浓度则在一定时间内保持不变，所以DELB与TBIL的比值表现为上升。
如果胆红素的各组分出现上述变化，则表明梗阻治疗成功。
由于DELB=TBIL-(Bu+Bc),因此，要检测DELB,必须要先检测TBIL、Bu和Be。
NBIL：其实就是总胆红素，新生儿Bu比正常人高得多，由于无法避免的光照作用的影响，利用传统的重氮试剂法检测出的总胆红素要比实际浓度低得多，而用干化学法检测，用Bu+Bc的结果代表新生儿胆红素，则可以明显纠正上述误差。
DBIL：直接胆红素，生理情况下，DBIL与Be相当；病理情况下，DBIL为Be与6胆红素之和。
直接胆红素J检测标准操作规程
14.参考文献
14.1《全国临床检验操作规程》
14.2《试剂使用说明书》
14.3《校准品使用说明书》
14.4《临床生物化学检验质量管理与操作规程》
直接胆红素
1.目的
规范直接胆红素（D-BIL)测定的操作程序，确保直接胆红素测定结果准确。
2.检验方法
化学氧化法(终点法）
3.检验原理
直接胆红素在间胆抑制剂硫脲表面活性剂曲拉通X-100存在下，被亚硝酸钠氧化，生成胆绿素，测定450nm吸光度的减小与直接胆红素的浓度成正比。
胆红素=胆绿素
4.临床意义
11.检验结果的解释
仪器加样针、比色杯、管路等未清洗干净时可能对试验结果产生影响。
反应曲线异常时需进行确认，干扰物质超出限度时需进行确认。
高度溶血可导致结果偏高。
12.检验方法的局限
12.1干扰物质：维生素C≦30mg/dl、甘油三酯≦2000mg/dl、血红蛋白<0.2g/l时对测定无影响
12.2直接胆红素测定只是临床医师对患者进行诊断的指标之一，临床医师还要根据患者的体征、病史及其他的诊断项目、诊断手段进行综合判断。
1×5ml
8.4用途
校准品与宁波美康生物科技有限公司生产的直接胆红素检测试剂盒及全自动生化分析仪配套使用，用于上述检测系统进行这些项目的校准。
8.5主要组成成分
校准品组成成分为非人源性。
校准品中的直接胆红素活性成分浓度具有批特异性，准确浓度见随附的数值表或说明书反面。
三羟甲基氨基甲烷0.1mol/L，二硫苏糖醇0.25g/L,防腐剂1g/L
6.检测仪器
日立7180全自动生化分析仪，使用具体要求和校准程序详见《仪器操作规程》。
两种胆红素测定方法在生化分析仪上的比较
胆红 素是我 们在临 床工 作中最 常测 定的 指标之 一，其 能够较好 地反映 被检 测者 的肝功 能，对 疾病的诊 治具有 重要 的意 义。目 前，多 数检验科 室都使 用改 良 J- G 法测定 胆红 素，但 是， 该种 检测 方法 容易受 到其他 一些因素 的影响 ，从 而使 得检测 结果具 有较大的 误差， 对临 床的 诊治产 生一定 的影响。 随着科 学技 术的 不断发 展，医 疗设备也 正在快 速的 进步 和发展 ，临床 中测定血 清胆红 素方 法也 越来越 多，选 择一种更 为合适 的检 测方 法变得 越来越 重要。为 此，本 研究 用 改良 J- G法 和钒 酸盐氧 化法 分别 对血 清总 胆红素(TBI)和血清 直接胆红素 (DBI) 进行测定，现报告如下。
正 常 、 直接 胆 红 素 ＞7.0 mmol/L 50 例 ； 其中脂 血标 本在 50 例，总 胆固 醇(TC)＞ 7.76 mmol/L， 甘 油 三 酯 (TG) 正 常 者 20 例 ， TC 正 常 ， TG＞4.5 mmol/L 10 例 ， TC＞7.76 mmol/L， TG＞4.5 mmol/L 10 例，溶血标本 20例，轻度溶血标本 10 例。
方法：在日立- 7600 全自动生化分析 仪上 根 据各 试剂 要示 设 置通 道和 参数 。 用钒 酸盐法 和改 良 J- G法 进行测 定。 并 进行统计学分析。
结果 对结果 进行统 计学处 理， 回归方 程
Y=0.993χ- 0.363， 相 关系 数 γ =0.9989， 配对 t 检 验 ，t=0.602，P＞0.05，两 法 结 果差异无统计学意义，见表 1。
资料与方法 材料：①仪器：日立- 7600全自动生
化 分 析仪 。 ②试 剂 ： 改良 J- G 法 试 剂， 潍坊 3V生产。钒酸盐氧 化法试剂，上海 科华 生产。 ③标准 ：朗道校 准液， 朗道 质 控 液 ， 各 试 剂 盒 配套 标 准 液 。 ④ 对 象： 我院门 诊患者 以钒酸盐 法测定 结果 为 标 准 ， 分 为 5 组 ： 总 胆 红 素 (2.5～ 366.2 mmol/L)50 例； 总胆 红 素正 常、 直 接 胆红 素＜7.0 mmol/L 50 例 ；总 胆红 素
胆红素分类、检测办法及直接胆红素与结合胆红素区别和应用
胆红素分类、检测办法及直接胆红素与结合
胆红素区别和应用
胆红素包括直接胆红素、间接胆红素、结合胆红素、非结合胆红素、δ胆红素等等。
检测胆红素方法包括湿化学法，干化学法、其他。
比较常用是重氮反应法和干化学法。
直接胆红素：在检测中可以与重氮磺胺酸直接反应的胆红素。
间接胆红素：需要加入加速剂（苯丙酸钠、甲醇、安息香酸钠）等破坏其氢键再与重氮磺胺酸反应的胆红素。
结合胆红素：是指胆红素经肝脏极性转化后与葡萄糖醛酸结合的水溶性胆红素（Bc）。
Bc又分为单葡萄糖醛酸结合胆红素（mBc）和双葡萄糖醛酸结合胆红素（dBc）。
非结合胆红素（Bu）：是以白蛋白为载体的脂溶性游离胆红素。
δ胆红素（DELB）：δ胆红素是一种与白蛋白以酰胺键共价结合不可分解的胆红素，具有良好稳定性，半衰期在17-23天。
直接胆红素可以溶于水的胆红素，但少量游离胆红素也可以参加直接反应，少量游离胆红素的氢键被破坏也会参加重氮反应。
重氮反应中：直接胆红素=结合胆红素（Bc）+大部分δ胆红素（DELB）+少量非结合胆红素（Bu）
结合胆红素（Bc）=mBc+dBc
间接胆红素=非结合胆红素。
检测胆红素的方法
检测胆红素的方法
检测胆红素的方法有多种，常见的方法包括：
1. 血清总胆红素测定：通过检测血液中的总胆红素含量来评估胆红素水平。
此方法常用于评估黄疸的严重程度。
2. 血清直接胆红素测定：血液中的直接胆红素主要来自于肝脏的代谢作用，直接胆红素测定可以评估肝脏功能。
3. 尿液胆红素测定：尿液中的胆红素通常与黄疸有关，通过检测尿液中胆红素的浓度可以评估肝脏或胆道系统的功能。
4. 新生儿血清胆红素测定：用于评估新生儿黄疸的程度，通常通过脚底或掌心的皮肤颜色变化来评估。
5. 胆红素结合能力测定：通过检测血液中胆红素的结合能力来评估肝脏功能和胆红素代谢能力。
以上方法常用于临床胆红素的检测，具体使用哪种方法需要根据患者情况和医生的判断来决定。
胆红素测定
胆红素的分类
（2）结合胆红素(Bc) ：与葡萄糖醛酸基结合， 具亲水性，与重氮试剂直接反应，又称直接 胆红素。占总胆红素的1/5。
黄疸分类
根据总胆红素的浓度 隐性黄疸:总胆红素17.1~34.2µmol/L。 显性黄疸:总胆红素大于34.2µmol/L。
注：TB 17.1µmol/L(2mg/dL)
解。 （2）约10%~20%来自于组织中非Hb的血红素，如肝中
释放的的血红素等。 （3）极少部分是由于骨髓造血过程中，生成的Hb或血红
素，以及少量未成熟RBC的分解（无效造血）产生的 血红素。
胆红素的分类
（1）未结合胆红素(Bu)：未与葡萄糖醛酸基结 合，具亲脂性，须加入加速剂破坏分子内部的 氢键后才能与重氮试剂反应，又称间接胆红素。 占总胆红素的4/5。
实验八
胆红素测定 ( 改 良 J – G 法)
实验目的
掌握总胆红素和直接胆红素 (改良J-G法)的测定原理，参考值范 围，注意事项。
胆红素测定作用
反 映 肝 脏 的 分 泌 与 排 泄 功 能。
胆红素的来源
Hb分解释放的血红素为胆红素的直接来源。 （1）约70%~80%是由衰老的RBC破坏、释放出的Hb分
DBil测定原理(改良J-G法)
血清中的DBi在强酸环境中，与重氮对氨基苯磺 酸反应,生成有色偶氮胆红素, 通过测定550nm处吸 光度值的变化，即可计算出样本中DBi的浓度。
TB测定原理(改良J-G法)
血清中的结合胆红素在强酸环境中与重氮 对氨基苯磺酸反应,生成有色偶氮胆红素,非 结合胆红素在表面活性剂的作用下,也能进行 这样的反应,通过550nm比色,计算其含量。
试剂组成 试剂A
试剂B
试剂
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血清总胆红素和直接（结合）胆红素测定
目前测定血清胆红素的方法主要有重氮试剂法（包括改良J-G法、二甲亚砜法、二氯苯重氮盐法和2，5二氯苯重氮四氟硼酸盐法等）、胆红素氧化酶法、钒酸盐氧化法、高效液相色谱法、导数分光光度法、经皮胆红素测定法以及直接分光光度法等。
改良咖啡因（J-G）法：
一、实验原理
血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成紫色的偶氮胆红素；在同样条件下，未结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应。
咖啡因、苯甲酸钠作为加速剂，醋酸钠缓冲液可维持反应的PH值同时兼有加速作用。
叠氮钠破坏剩余重氮试剂，终止结合胆红素测定管的偶氮反应。
最后加入碱性酒石酸钠，在碱性条件下，紫色偶氮胆红素转变为蓝色偶氮胆红素，使最大吸光度由530nm转移到598nm，此时，非胆红素的黄色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计，使测定的灵敏度和特异性增加。
最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。
二、实验方法
（一）器材
试管，刻度吸管，分光光度计，37℃水浴箱。
（二）试剂
1．咖啡因-苯甲酸钠试剂无水醋酸钠41g，苯甲酸钠37.5g，乙二胺四乙酸二钠EDTANa2 0.5g，溶于约500mL 的蒸馏水中，再加入咖啡因25g，搅拌至完全溶解(不可加热)，然后加蒸馏水稀释至1000mL，混匀，过滤后放置棕色试剂瓶中，室温保存可稳定6个月。
2. 5g/L 亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至100mL，若发现溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。
3. 5g/L 对氨基苯磺酸溶液：对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H20）5.0g，加于约800mL 蒸馏水中，加浓盐酸15mL，待完全溶解后，加蒸馏水至1000mL。
4. 重氮试剂临用前，取5g/L 亚硝酸钠溶液（试剂2）0.5mL 与5g/L 对氨基苯磺酸溶液（试剂3）20mL 混合。
5. 5g/L 叠氮钠溶液：叠氮钠0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100mL。
6. 碱性酒石酸钠溶液：氢氧化钠75g，酒石酸钠(Na2C4H4O6·2H2O)263g，加蒸馏水溶解并稀释至1000mL，混匀，置塑料瓶中，室温保存可稳定6个月。
7.胆红素标准液可购买，也可按以下方法配制：
（1）稀释血清：收集不溶血、无黄疽、清晰的血清过滤作为混合血清稀释剂。
取过滤血清1.0ml，加生理盐水24ml，混匀。
在分光光度计中，以比色杯光径1cm，波长414nm，用生理盐水调零，读取的吸光度应小于0.100，波长460nm 处读取的吸光度应小于0.040。
（2）171umol/L胆红素标准液：称取符合标准的胆红素（MW:584.68）10mg，加入二甲基亚砜1ml，玻棒搅匀，加入0.05mol/LNa2CO3溶液2ml，使胆红素完全溶解。
移入100ml 容量瓶，用稀释血清洗涤数次并移入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/LHCl溶液2ml（边加边缓慢摇动，切勿产生气泡），最后用稀释血清稀释至100ml。
避光，4℃保存，三天内有效，最好当天绘制标准曲线。
（三）步骤
1. 取试管3支，标明总胆红素管、结合胆红素管和空白管，然后按下表操作：
试剂(ml) 总胆红素管结合胆红素管空白管
血清0.2 0.2 0.2
咖啡因-苯甲酸钠试剂 1.6 - 1.6
氨基苯磺酸溶液- - 0.4
重氮试剂0.4 0.4 -
混匀，总胆红素管置室温10min，结合胆红素管置37℃水浴准确放置1min，按下表继续操作：
叠氮钠溶液- 0.05 -
咖啡因-苯甲酸钠试剂- 1.55 -
碱性酒石酸钠溶液 1.2 1.2 1.2
充分混匀后，用空白管调零，于波长600nm，读取总胆红素管和结合胆红素管吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。
胆红素氧化酶法
一、实验原理
胆红素呈黄色，在450nm附近有最大吸收峰。
胆红素氧化酶(BOD)催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，A450nm下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。
在pH8.0条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测450nm吸光度的下降值可反映总胆红素含量；加入SDS及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。
在pH3.7～4.5缓冲液中，BOD催化单葡萄糖醛酸胆红素(mBc)、双葡萄糖醛酸胆红素(dBc)及大部分δ胆红素氧化，非结合胆红素(Bu)在此pH条件下不被氧化。
用配制于人血清中的二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin，DTB)作标准品，检测此条件下450nm吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。
二、实验方法
1．0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2) 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.211g，胆酸钠172.3mg,十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg，溶于去离子水90ml中，在室温(25～30℃)用1mol/L盐酸调节pH至8.2(约用6ml)，再加蒸馏水至100ml，置冰箱保存，此液含4mmol/L胆酸钠、15mmol/L SDS。
2．0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)。
3．BOD溶液如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长(约可保存1周)，如系液体(可能含有甘油)，置4℃冰箱可保存较长时间，BOD贮存溶液的酶活性一般在数千至1万～2万U/L，BOD工作液酶活性可按反应液中BOD终浓度达0.3～1.0U/ml计算。
4．总胆红素标准液(342μmol/L) 按胆红素测定J-G法中方法配制，或市售合乎要求的标准液。
5．结合胆红素标准液将DTB配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说明书要求重建。
配制后分装于聚丙烯管内，－70℃保存，可稳定6个月。
冻干品未重建前置低温中，至少稳定1年。
加入BOD工作液后立即混匀，置37C水浴5min，用分光光度计，在450nm波长，去离子水调零，读取各管吸光度(A)。
用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。
钒酸盐氧化法(试剂盒)
一、原理
在PH=3左右，有表面活性剂和间接反应胆红素抑制剂的条件下，样品中的直接胆红素被氧化剂钒酸钠氧化为胆绿素。
胆红素的黄色特异性吸光度下降，通过测定钒酸盐氧化前后吸光度的变化，计算样品中直接胆红素的含量。
二、实验方法
试剂：柠檬酸缓冲液100mM
表面活性剂2mmol/L
磷酸缓冲液10mM
偏钒酸钠4mmol/L
适用于半/全自动生化分析仪，两周内用完。
样本/标准/水sample volume μ114
试剂1（R1）Reagent 1 μl280
样本+R1 在37℃保温60秒，记录吸光度值A1
试剂2（R2）Reagent 2 μl70
在加入R2 保温300 秒后，记录吸光度值A2。
主波长main wavelength nm 450
副波长sub wavelength nm 546
反应类型reaction type 两点终点法反应方向reaction direction 降反应(-)。