亚油酸异构酶在原核生物中的异源表达
异戊二烯生物合成研究进展
异戊二烯生物合成研究进展张雯雯;曾日中;杨礼富;顾金刚【摘要】异戊二烯（ isoprene ），又名2-甲基-1、3-丁二烯，是最简单的类异戊二烯化合物，是橡胶的重要前体物质，在精细化工如香料、新型农药等方面应用广泛。
异戊二烯主要依赖化石燃料合成，但生产成本较高、易污染环境，生物法合成异戊二烯具有巨大的潜在应用价值，本文综述了生物法合成异戊二烯的主要途径与研究进展。
%Isoprene (2-methyl-1, 3-butadiene) being the simplest member of the isoprenoids , is an important precur-sor in the synthetic rubber and widely used for perfume or spices and new pesticides .Isoprene is relied mainly on fos-sil fuel, yet high cost production and environment pollutivesome .Biosynthesis of isoprene possesses huge potential ap-plication value .This paper reviewed the main biosynthesis pathway and advances in isoprene .【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2016(036)006【总页数】6页(P98-103)【关键词】异戊二烯;生物合成;MVA途径;MEP途径【作者】张雯雯;曾日中;杨礼富;顾金刚【作者单位】中国农业科学院农业资源与农业区划研究所中国农业微生物菌种保藏管理中心，北京 100081; 中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南儋州 571737; 海南大学环境与植物保护学院，海南海口 570100;中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南儋州 571737;中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南儋州 571737;中国农业科学院农业资源与农业区划研究所中国农业微生物菌种保藏管理中心，北京 100081【正文语种】中文【中图分类】Q939.9类异戊二烯化合物广泛存在于自然界中，其中异戊二烯(2-甲基-1、3-丁二烯)是最简单的类异戊二烯化合物[1] ，在常温下是一种无色、易挥发、有刺激性气味的油状液体，沸点较低(34 ℃)，能与乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂混溶。
园艺植物中类胡萝卜素合成与调控的研究进展
园艺植物中类胡萝卜素合成与调控的研究进展一、综述类胡萝卜素作为一类重要的天然色素，在园艺植物中发挥着不可或缺的作用。
随着生物技术的飞速发展和研究手段的不断创新，园艺植物中类胡萝卜素的合成与调控机制逐渐明晰，为园艺植物的遗传育种和生产实践提供了坚实的理论依据。
园艺植物如胡萝卜、番茄、菠菜等富含类胡萝卜素，这使得它们在营养价值和观赏价值方面都具有独特的地位。
类胡萝卜素不仅赋予植物丰富多彩的颜色，更在植物的光合作用、抗氧化、抗逆境等生理过程中发挥着关键作用。
深入研究园艺植物中类胡萝卜素的合成与调控机制，对于提高园艺植物的品质、产量和抗逆性具有重要意义。
在类胡萝卜素的合成方面，研究揭示了其生物合成途径中的关键酶和基因。
类胡萝卜素的合成是一个复杂的生物过程，主要在叶绿体和有色体中进行。
植物通过光合作用将二氧化碳和水转化为有机物质，并释放氧气。
这一过程中，光合色素吸收光能，通过光化学反应生成初级光产物，进而参与类胡萝卜素的合成。
这些初级光产物在一系列酶的作用下，经过多步反应，最终合成各种类胡萝卜素。
在类胡萝卜素的调控方面，研究发现了多种调控因素，包括基因表达、激素和信号通路等。
基因表达调控是其中最重要的机制之一，植物体内存在一系列与类胡萝卜素合成相关的基因，这些基因的表达水平受到光照、温度、激素等多种因素的影响。
激素和信号通路也对类胡萝卜素的合成进行精细调控，以确保其在植物体内的平衡和稳定。
园艺植物中类胡萝卜素的合成与调控是一个复杂而精细的过程，涉及多个层面和因素。
未来研究将进一步揭示其合成与调控的分子机制，为园艺植物的遗传育种和生产实践提供更有效的理论指导和技术支持。
1. 类胡萝卜素在园艺植物中的重要性类胡萝卜素在园艺植物中的重要性不容忽视。
作为一类重要的天然色素，类胡萝卜素不仅赋予园艺植物丰富多彩的颜色，从鲜艳的黄色到深邃的红色，使得植物在视觉上更具吸引力，而且还在植物的生长、发育以及抵抗逆境过程中发挥着至关重要的作用。
乙肝表面抗原在酿酒酵母中的异源表达
乙肝表面抗原在酿酒酵母中的异源表达 邱玲;钱俊佳;康振;陈坚 【期刊名称】《食品与生物技术学报》 【年(卷),期】2015(034)009 【摘 要】乙肝表面抗原HBsAg是乙肝疫苗的主要组分.从转录水平、翻译水平以及翻译后水平对其进行优化,实现了HBsAg在重组酿酒酵母中的高效异源表达.与组成型启动子TEF1、TDH3、HXT7、ADH1相比,诱导型启动子GAL1可大幅度提高HBsAg的表达;与GCCACC和AAAAAA相比kozak序列IACACA最有利于HBsAg的翻译表达;而共表达二硫键异构酶pdi对HBsAg的活性表达具有显著的促进作用.通过3种水平的优化,HBsAg活性从最初的8.87 IU/g提高至151.08 IU/g;最终,利用Ni柱亲和层析成功获得纯化的HBsAg,活性为3.32 IU/mL.
【总页数】8页(P906-913) 【作 者】邱玲;钱俊佳;康振;陈坚 【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;希森美康生物科技无锡有限公司,江苏无锡214028;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡214122
【正文语种】中 文 【中图分类】Q753 【相关文献】 1.果糖基转移酶在酿酒酵母中异源表达及酶学性质分析 [J], 王一恬;张玲;沈微;杨海麟 2.依地福新诱导异源表达人凋亡基因的酿酒酵母细胞的凋亡 [J], 张辉;喻莉萍;方芳;罗桐秀;李强国;王彬;李明;李林珍;方云祥 3.异源表达海苏特氏菌Argonaute蛋白基因提高酿酒酵母脂肪酸含量研究 [J], 张晓伟;郭敏瑞;郭慧静;陈国刚 4.酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶的异源表达及催化生成糠硫醇 [J], 扎木苏;杨华青;王鑫;孙宝国;王成涛;卢松 5.酿酒酵母环核苷酸磷酸二酯酶1的异源表达、 分离纯化与活性检测 [J], 陈滢;李赤霞;陈玉娟;田元元;张萌;韩潆仪;王友升
倍半萜合成酶基因 麦角固醇 生物合成
此文酶序DDX 动力基序甚至AFU 中得将极文指导教师在搜列搜寻到其它XXD/E 基序和，进行了大量和DXX(S,T)X ，还预测超氧UA_3G14710在得到cover 了40极大颠覆人们对搜寻某些生物合物质中存在同DXX(S,T)XXX 量实验，以期推XXX(E,D)结构氧化物麦角固醇在体外试验中证0%区域，同源对blast的使用和合成酶的过程中源的基因，虽X(E,D)结构域（推翻现在所存在域。
醇合成必须的超证实是双加氧酶源性30%左右的和科学认知，进中创造性的使用虽然这些搜寻到（NSE/DTE 模在的巨量SCI 所超氧化物酶，利酶（2013年体内的两个基因（下进一步证实武汉用blast 搜寻技术到的这些基因缺模体），但利用所总结的共识---利用某个2007年内实验不能证实下图），然后进汉大学所引进院术，如根据某些缺乏倍半萜环化用其所在实验室-倍半萜环化酶年文献报道的霉实），运用bla 进行敲除及体外院士团队的副教仅供参考，些已知的倍半萜化酶所必需的室公共试剂及免酶不需要DDXX 霉菌中ast 方法，在该外实验，若能成教授科研水平。
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摘要萜类化合物是植物界广泛存在的一种次生代谢物质，其种类繁多，不仅在植物的生命活动中扮演着重要的作用，而且还广泛应用于工业，食品，医疗卫生，化妆品等方面；近年来，人们对萜类化合物及萜类生物合成途径的研究不断深入，并已经从传统的化学合成转入了分子生物合成的领域;萜类合成酶是萜类次生代谢产物合成的关键酶，萜类合成酶基因的克隆、分离、表达和调控成为了人们研究萜类生物合成的重点；以基因工程手段克隆关键酶基因，研究基因的功能及相关特性，在此基础上选择性地调控其生物合成路径，可望实现更多有用的倍半萜类化合物分离和鉴定，为萜类化合物这一数量最多的天然产物的开发利用展现诱人的前景。
本课题通过链霉菌Streptomyces davawensis JCM 4913 和S. venezuelae ATCC 10712基因组进行分析，发现BN159_1440基因和SVEN_0552基因同已报导的倍半萜类合酶pentalenene synthase的基因有一定的同源性，将其分别进行基因的克隆，在链霉菌中异源表达，通过不同于野生型菌株的异源宿主，使其功能得到表达，探索其可能的生物功能，一方面将其进行体内的基因敲除，同野生型的菌株同批发酵，对比基因敲除后产物的变化；体外进行蛋白的超量表达及分离纯化，加入底物及相关辅酶及辅离子进行体外的反应，探究BN159_1440基因和SVEN_0552基因的萜类合酶的相关功能，检测分离更多的萜类化合物。
查阅考试酷 _ 生物学类生物化1
1.1. 组成人体蛋白质的氨基酸（除甘氨酸外）均为（）A. L-α-氨基酸 B. D-α-氨基酸C. L-β-氨基酸D. D-β-氨基酸E. D或L-α-氨基酸2. 氨基酸在等电点时，应具有的特点是（）A. 带正电 B.不带负电 C. 不带正电D.净电荷为零，在电场中不泳动 E. 既不带正电也不带负电3. 蛋白质一级结构中的主要化学键是：( )A. 氢键 B. 盐键 C. 肽键D. 疏水键E. 范德华引力4. 蛋白质溶液的稳定因素是（）A. 蛋白质溶液的粘度大 B.蛋白质分子在溶液中有布朗运动 C. 蛋白质分子表面带有水化膜和同种电荷 D. 蛋白质溶液有分子扩散现象 E. 蛋白质分子带有正电荷5．蛋白质紫外吸收的最大波长是（）A.250nm B. 260nm C. 270nm D. 280nm E. 290nm6. 核酸中核苷酸之间的连接方式是：（）A. 2′，3′-磷酸二酯键 B. 3′，5′-磷酸二酯键 C. 2′，5′-磷酸二酯键 D. 糖苷键 E. 氢键7. 关于Waston-Crick对DNA结构的论述正确的是：（）A. 是一个三链螺旋结构B. 双股链的走向是反向平行的C. 嘌呤和嘌呤配对，嘧啶和嘧啶配对D. 碱基之间共价结合E. 磷酸戊糖主链位于螺旋内侧8. 有关DNA变性的论述何者是正确的？（）A. Tm是DNA开始变性的温度 B. Tm是DNA完全变性的温度C. Tm是DNA变性达到1/2（50%）时的温度D. DAN碱基组成是G+C所占的克分子比越低，Tm越高E. DAN碱基组成是G+C所占的克分子比越高，Tm越低9. 关于酶的最适温度下列哪项是正确的？（）A. 是酶的特征性常数 B. 是指反应速度等于50%Vmax 时的温度C. 是酶促反应速度最快时的温度 D. 是一个固定值与其他因素无关E. 与反应时间无关10．DNA复制之初，参与从超螺旋结构解开双股链的酶或因子是：（）A．解链酶B．拓扑异构酶I C．DNA结合蛋白D．引发前体E．拓扑异构酶Ⅱ11．关于真核生物DNA复制与原核生物相比，下列说法错误的是：（）A．引物长度较短B．冈崎片段长度较短C．复制速度较慢D．复制起始点只有一个E．由DNA聚合α及δ催化核内DNA的合成12．关于真核生物DNA聚合酶的说法错误的是：（）A．DNA polα与引发酶共同参与引发作用B．DNA polδ催化链的生成C．DNA polβ催化线粒体DNA的生成D．PCNA参与DNA polδ的催化作用E．真核生物DNApol有α、β、γ、δ和ε5种13．在紫外线照射对DNA分子的损伤中最常见形成的二聚体是：（）A．G-C B．C-T C．T-T D．T-U E．U-C14．关于反转录酶的叙述错误的是：（）A．作用物为四种dNTP B．催化RNA 的水解反应C．合成方向3′→5′ D．催化以RNA为模板进行DNA合成E．可形成DNA—RNA杂交体中间产物15．辨认DNA复制起始点主要依靠的酶是：（）A．DNA聚合酶B．DNA连接酶C．引物酶D．拓扑异构酶E．解链酶16.对于RNA聚合酶的叙述，不正确的是：（）A.由核心酶和σ因子构成 B.核心酶由α2ββ′组成C.全酶与核心酶的差别在于β亚单位的存在D.全酶包括σ因子 E.σ因子仅与转录起动有关17. 以下对mRNA的转录后加工的描述错误的是：（）A.mRNA前体需在5′端加m7GpppNmp的帽子 B.mRNA前体需进行剪接作用C.mRNA前体需在3′端加多聚U的尾D.mRNA前体需进行甲基化修饰E.某些mRNA前体需要进行编辑加工18. 成熟的真核生物mRNA5′末端具有：（）A.聚A帽子 B.m7UpppNmPC.m7CpppNmPD.m7ApppNmPE.m7GpppNmP19. 外显子是指：（） A.DNA链中的间隔区 B.被翻译的编码序列 C.不被翻译的序列 D.不被转录的序列 E.以上都不是20. 在蛋白质生物合成中催化氨基酸之间形成肽键的酶是：（） A. 氨基酸合成酶B. 转肽酶C.羧基肽酶D. 氨基肽酶E. 氨基酸连接酶21．下列关于肽链延伸的叙述哪项不正确？（）A．核糖体向mRNA3′端每移动一个密码子距离肽链便延伸一个氨基酸残基B．受大亚基上的转肽酶催化C．活化的氨基酸进入A位 D. 在进位、移位步骤中需GTP供能E．肽链合成从C 端→N端延伸22. 属于必需脂肪酸的是：（）A．软脂酸（棕榈酸）B．硬脂酸C．油酸D．亚油酸E．月桂酸23. 脂肪动员的关键酶是：（） A. 甘油三酯酶 B. 甘油二酯酶C. 甘油一酯酶D. 激素敏感性三酰甘油脂肪酶E. 脂蛋白脂肪酶24. 16碳软脂酸彻底氧化生成H2O和CO2时净产生ATP数为：（）A. 106 B. 108C. 129D. 131E. 12025. 脂酰CoA β-氧化反应的正确顺序是：（）A．脱氢、再脱氢、加水、硫解B．硫解、脱氢、加水、再脱氢C．脱氢、加水、再脱氢、硫解D．脱氢、脱水、再脱氢、硫解E．加水、脱氢、再硫解、再脱氢26. 糖类的生理功能有：（） A. 提供能量 B. 构成蛋白聚糖和糖蛋白的组成成分C. 构成细胞膜组成成分D. 构成体内多种重要的生物活性物质，如血型物质E. 以上都对27. 下列不属于糖酵解关键酶的是： A. 已糖激酶 B. 葡萄糖激酶 C. 磷酸甘油酸激酶 D. 6-磷酸果糖激酶-1 E. 丙酮酸激酶28. 食物蛋白质的互补作用是指：（）A．糖和蛋白质混合食用，以提高食物的生理价值作用B．脂肪和蛋白质混合食用，以提高食物的生理价值作用C．几种生理价值较低的蛋白质混合食用，以提高食物的营养作用D．糖、蛋白质、脂肪及维生素混合食用，以提高食物的营养作用E．糖和脂肪替代蛋白质的作用29. 下列哪组氨基酸，是成人必需氨基酸? （）A．蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、缬氨酸B．苯丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸C．苏氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、色氨酸D．亮氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸E．缬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、异亮氨酸30. 体内合成非必需氨基酸的主要途径是：（）A. 转氨基 B. 联合脱氨基作用 C. 非氧化脱氨 D. 嘌呤核苷酸循环 E. 脱水脱氨31.人体内嘌呤核苷酸分解的终产物是：（）A．尿素B．肌酸C．肌酸酐D．尿酸Ｅ．丙氨酸32. 下列氨基酸中，哪个既是嘌呤环又是嘧啶环生物合成的直接前体（原料）？（）A．一碳单位B．PRPP C．甘氨酸D．天冬氨酸E．谷氨酸33. 酶化学修饰调节的最主要方式是：（）A．甲基化与去甲基化B．乙酰化与去乙酰化Ｃ．磷酸化与去磷酸化D．聚合与解聚E．酶蛋白的合成与降解34. 糖类、脂类、氨基酸氧化分解时，进入三羧酸循环的主要物质是：（）A．异柠檬酸B．丙酮酸C．α-酮酸D．α-酮戊二酸E．乙酰CoA35. 在胞浆中进行的和能量代谢有关的代谢是：( ) A. 三羧酸循环 B. 脂肪酸氧化 C. 电子传递 D. 糖酵解 E. 氧化磷酸化36．苯丙酮尿症（PKU）是因为细胞缺乏下列哪种酶？：（） A. 苯丙氨酸羟化酶 B. 酪氨酸转氨酶 C.酪氨酸羟化酶 D. 苯丙氨酸转氨酶 E. 酪氨酸酶37. 1分子乙酰辅酶A经三羧酸循环和氧化磷酸化共可生成几分子ATP？：（） A.2B.4C.8D.10E.1638. 在磷酸戊糖途径中具有重要生理意义的两个代谢产物是：（）A. 5-磷酸核酮糖，CO2 B. 5-磷酸核糖，NADPH+H+ C. 3-磷酸甘油醛，6-磷酸果糖 D. 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖酸内酯 E. 6-磷酸葡萄糖酸，5-磷酸核酮糖39. 在氨基酸代谢库中，游离氨基酸含量最高的是：（）A. 肝脏 B. 肾脏 C. 脑 D. 肌肉 E. 血液40 关于管家基因的叙述，不正确的是（）A．这些基因产物对生命全过程都是必需的B．在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达C．在个体各个生长阶段几乎全部组织中持续表达D．在生物个体的某一生长阶段持续表达E．只受启动序列与RNA聚合酶相互作用的影响41. 大多数基因表达调控基本环节是发生在：（） A. 转录水平Ｂ. 复制水平 C. 翻译水平Ｄ. 翻译后水平 E. 转录起始42. 真核基因结构并不具备的典型特征是：（）A．断裂基因B．多顺反子转录产物C．单顺反子转录产物D．重复序列E．转录产物的剪接加工43. 关于病毒癌基因的叙述错误的是：( )A．又称为原癌细胞B．主要存在于RNA病毒基因中C．在体外能引起细胞转化D．感染宿主细胞能随机整合于宿主细胞基因组E．感染宿主细胞能引起恶性转化44. 下列可以导致原癌基因激活的机制是（）A.转录因子与RNA结合 B.p53蛋白诱导细胞凋亡 C.获得启动子和增强子 D.抑癌基因的过表达 E.基因同源重组45. 下列关于生长因子的叙述，错误的是（）A.其化学本质属于多肽 B.主要以旁分泌和自分泌方式起作用 C.其受体定位于胞核中 D.具有调节细胞生长与增殖功能 E.广泛存在于机体内各种组织46. 基因工程的基本过程不包括：（）A.限制酶的切割 B.重组体的筛选C.重组体的序列分析D.载体与目的基因的连接E. DNA重组体导入受菌体47. 下列关于限制性内切酶的叙述哪一项是错误的（）A.它能识别DNA特定的碱基顺序，并在特定的位点切断DNAB.切割点附近的碱基顺序一般呈回文结构C.是重组DNA的重要工具酶D.它能专一降解经甲基化修饰的DNAE.主要从细菌中获得48. 关于重组DNA技术的叙述，正确的是：（）A. 质粒、大肠杆菌DNA常作为克隆载体 B. DNA解链酶是主要工具酶之一C. DNA重组体是指目的片段与载体的连接物D. 利用逆转录酶完成外源基因与载体的并接E. 进入细胞内的重组DNA均可表达目标蛋白49. 用来鉴定DNA的技术是：（）A. Southern blot B. Northern blotC. Western blotD. 免疫印迹E. 离子交换层析50. 下列关于维生素D的叙述，正确的有（）A.属于水溶性维生素B.与巨幼红细胞性贫血发生有关C.作为辅酶参与糖有氧氧化D.调节体内钙、磷代谢E.构成视觉细胞内的感光物质51. 脂溶性维生素叙述正确的是：（）A．可以供给机体能量B．与辅酶或辅基有关C．容易被消化道吸收D．过多或过少都可能引起疾病E．包括维生素A、C、D、E、K52. 在NAD+和NADP+分子中含有的维生素是：（）A．VitB12 B．VitB6C．VitB2 D．VitB1 E．VitPP53. 能与胞内受体结合的信息物质是：（）A. 蛋白质类激素 B.类固醇激素 C.胰岛素 D. 肽类激素 E. 干扰素54. 哪一项不是细胞内传递信息的第二信使（）A. cAMP B. 甘油一酯 C. IP3 D. DG E. cGMP55. 与七个跨膜受体偶联的蛋白质是（）A.蛋白激酶A B. 蛋白激酶CC. 腺苷酸环化酶D. 酪氨酸蛋白激酶E. 异源三聚体结构的G蛋白56. 血浆清蛋白的功能应除外：（）A. 运输 B.免疫功能 C. 缓冲作用 D. 营养作用 E. 维持血浆胶体渗透压57. 成熟红细胞中不能进行的代谢途径是：（）A. 糖酵解 B. 三羧酸循环C. 磷酸戊糖途径D. 2,3-二磷酸甘油支路E. 以上都是58. 合成血红素的基本原料是：（）A．珠蛋白、Fe2+ B．琥珀酰CoA、Fe2+ C．琥珀酰CoA、甘氨酸、Fe2+D．乙酰CoA、Fe2+ E．乙酰CoA、甘氨酸、Fe2+59.下列哪一项不属于肝脏的功能？（）A．贮存糖原和维生素B．合成血清白蛋白Ｃ．合成消化酶D．合成尿素E．进行生物转化60. 生物转化的第二相反应，最常结合反应是：（）A．葡萄糖醛酸结合B．乙酰基结合C．硫酸结合D．谷胱甘肽结合E．甲基结合[60分]A1-10ADCCDBBCCE 11-20 DCCCCCCEBB 21-30 EDDACECCAB 31-40DDCEDADBDD 41-50EBACCCDCAD 51-60DCBBEBBCCA2.二、问答题每题5分，共30分1. 何谓酶原激活？酶原激活的生理意义是什么？2. 简述遗传密码的特点。
△3-△2-烯酰—辅酶A异构酶(ECI)对不饱和脂肪酸代谢的作用及其途径
△3-△2-烯酰—辅酶A异构酶(ECI)对不饱和脂肪酸代谢的作用及其途径鲁云风;石建州;庞振凌;吴克亮;张浩【摘要】△3-△2-烯酰辅酶A异构酶(△3-△2-enoyl-CoA isomerase,ECI)是生物体内核编码的酶,是参与β氧化过程中奇数和偶数位双键新陈代谢所必需的辅酶,它通过将不同位置和长度的反式或顺式-3烯酯酰辅酶A转化为反式-2烯酯酰辅酶A来催化β氧化反应,是该途径的关键辅酶.研究结果表明,该基因编码的酶对鼠和人等多种生物中不饱和脂肪酸β氧化有调控作用.综述ECI基因在细胞中的定位及分类、ECI基因表达对不饱和脂肪酸代谢的影响及其作用途径,并展望ECI基因今后的研究重点和方向.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)008【总页数】4页(P123-126)【关键词】△3-△2-烯酰—辅酶A异构酶;不饱和脂肪酸;基因表达【作者】鲁云风;石建州;庞振凌;吴克亮;张浩【作者单位】南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳473061;中国农业大学动物科学技术学院,北京100193;南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳473061;南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳473061;中国农业大学动物科学技术学院,北京100193;中国农业大学动物科学技术学院,北京100193【正文语种】中文【中图分类】Q552不饱和脂肪酸不仅是维持正常生命活动所必需的，而且对人类很多疾病具有明显预防和治疗作用（Casellas等，2010）。
Maedler等（2003）研究发现不饱和脂肪酸可以预防糖尿病及高脂的危害；Keys等（1965）认为血中胆固醇与膳食中饱和脂肪酸成正比，与膳食中不饱和脂肪酸成反比；欧洲卫生机构（1994）建议人类膳食肉类的多不饱和脂肪酸（PUFA）与饱和脂肪酸（SFA）之比应高于0.4，而PUFA中ω-6与ω-3之比应小于4.0；van Weeghel等（2014）研究则发现多不饱和脂肪酸对胚胎的发育至关重要。
葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的异源表达及其酶学性质表征
第 35 卷第 3 期
王涛等：葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的异源表达及其酶学性质表征
501
同功能的结构域组成：转氨酶结构域和异构酶结构域[4-5]。通过抑制葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的活性，能够 导致相关糖蛋白及几丁质的生物合成受阻，致使致病菌无法合成细胞壁而死亡[6]。但在哺乳动物中，该 酶被抑制短时间内不会对个体造成严重的伤害，其所造成的结果因组织不同而异。因此， GFA 也被认 为将成为抗细菌和抗真菌新药研发中极具前景的潜在靶点[7-8]。
WANG Tao1, FENG Jun-rui1, LI Shu-xuan1, DU Xiang1, LIU Xiao-huan1, WU Mian-bin2 (1. School of Biological Science, Jining Medical University, Rizhao 276826, China; 2. Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education,
的应用提供基础。
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
(1) 本实验使用的菌种主要有：实验室保藏的大肠杆菌 BL21(DE3) Codon plus，大肠杆菌 DH5α 白色 念珠菌(Candida albicans ATCC 64548)。
(2) 主要试剂有：1 mmolL1 的 GLUPA(γ-谷氨酰对硝基苯胺)；pH 7.2 的磷酸盐(PBS)缓冲液； LB(Luria-Bertani)培养基(pH 7.2，胰化蛋白胨 10 gL1、酵母提取物 5 gL1 和 NaCl 10 gL1)；对硝基苯胺 (天津大茂化学试剂厂)；Bacilysin(实验室保存)。质粒提取试剂盒(Solarbio，D1100)，琼脂糖凝胶回收试 剂盒(Omega，D2500-01)。 2.2 实验过程 2.2.1 对硝基苯胺标准曲线的绘制
生物化学习题答案
1. 在体内参与脂酸合成的葡萄糖代谢的直接中间产物是（C）A. 3-磷酸甘油醛B. 丙酮酸C. 乙酰CoAD. 磷酸二羟丙酮E. 草酰乙酸满分：2 分2. 关于“基因表达”的概念叙述错误的是（A）A. 其过程总是经历基因转录及翻译的过程B. 经历基因转录及翻译等过程C. 某些基因表达产物是蛋白质分子D. 某些基因表达产物不是蛋白质分子E. 某些基因表达产物是RNA分子满分：2 分3. 测定酶活性时，在反应体系中，叙述正确的是(E)A. 作用物的浓度越高越好B. 温育时间越长越好C. 反应温度以37℃为佳D. pH必须中性E. 有的酶需要加入激活剂满分：2 分4. 关于糖、脂代谢的叙述，错误的是(C)A. 糖分解产生的乙酰CoA可作为脂酸合成的原料B. 脂酸合成所需的NADPH主要来自磷酸戊糖途径C. 脂酸分解产生的乙酰CoA可经三羧酸循环异生成糖D. 甘油可异生成糖E. 脂肪分解代谢的顺利进行有赖于糖代谢的正常进行满分：2 分5. 激活的G蛋白直接影响下列哪种酶？(E)A. 蛋白激酶AB. 蛋白激酶CC. 蛋白激酶GD. 磷脂酶AE. 磷脂酶C满分：2 分6. 关于草酰乙酸的叙述，不正确的是哪项？(B)A. 草酰乙酸在TCA循环中无量的改变B. 草酰乙酸能自由通过线粒体内膜C. 草酰乙酸与脂酸合成有关D. 草酰乙酸可转变为磷酸烯醇式丙酮酸E. 草酰乙酸可由丙酮酸羧化而生成满分：2 分7. 梗阻性黄疸尿中主要的胆红素可能是：(B)A. 游离胆红素B. 葡萄糖醛酸胆红素C. 结合胆红素－清蛋白复合物D. 胆红素－Y蛋白E. 胆红素－Z蛋白满分：2 分8. 在糖酵解中，催化底物水平磷酸化反应的酶是(B)A. 己糖激酶B. 磷酸甘油酸激酶C. 磷酸果糖激酶-1D. 葡萄糖激酶E. 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶满分：2 分9. 下列哪一种情况下尿中胆素原排泄减少？(D)A. 肠梗阻B. 溶血C. 肝细胞炎症D. 胆道梗阻E. 贫血满分：2 分10. 1分子软脂酸在体内彻底氧化分解净生成多少分子A TP？(B)A. 108B. 106C. 32D. 30E. 10满分：2 分11. 真核生物在蛋白质生物合成中的起始tRNA是(E)A. 亮氨酰tRNAB. 丙氨酸tRNAC. 赖氨酸tRNAD. 甲酰蛋氨酸tRNAE. 蛋氨酸tRNA满分：2 分12. 下列关于DNA复制的叙述哪一项是正确的?(D)A. 需RNA指导的DNA聚合酶参加B. 以NTP为原料C. 不需要引物D. 属半保留复制E. 只有一条链作为模板满分：2 分13. 测得某一蛋白质样品的氮含量为0．60g，此样品约含蛋白质多少？(B)A. 16．0gB. 3．75gC. 6．40gD. 9．60gE. 6．25g满分：2 分14. 在真核细胞中，经RNA聚合酶Ⅱ催化的转录产物是(D)A. 18SrRNAB. tRNAC. 全部RNAD. mRNAE. 28SrRNA满分：2 分15. 氨基酸是通过下列哪种化学键与tRNA结合的?(C)A. 糖苷键B. 磷酸酯键C. 酯键D. 氢键E. 酰胺键满分：2 分16. 摆动配对是指下列哪个碱基之间配对不严格：(A)A. 反密码子第一个碱基与密码子第三个碱基B. 反密码子第三个碱基与密码子第一个碱基C. 反密码子和密码子第一个碱基D. 反密码子和密码子第三个碱基E. 以上都不是满分：2 分17. 延伸进程中肽链形成叙述中哪项不恰当(D)A. 肽酰基从P位点的转移到A位点，同时形成一个新的肽键，P位点上的tRNA无负载，而A位点的tRNA上肽键延长了一个氨基酸残基B. 肽键形成是由肽酰转移酶作用下完成的，此种酶属于核糖体的组成成分C. 嘌呤霉素对蛋白质合成的抑制作用，发生在转肽过程这一步D. 肽酰基是从A位点转移到P位点，同时形成一个新肽键，此时A位点tRNA空载，而P 位点的tRNA上肽链延长了一个氨基酸残基E. 多肽链合成都是从N端向C端方向延伸的满分：2 分18. DNA复制的体系不包括(A)A. CTPB. A TPC. dNTPD. DNA聚合酶E. DNA模板满分：2 分19. 糖酵解时，提供~P能使ADP生成A TP的一对代谢物是(B)A. 3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖B. 1,3-二磷酸甘油酸及磷酸烯醇式丙酮酸C. 3-磷酸甘油酸及6-磷酸葡萄糖D. 1-磷酸葡萄糖及磷酸烯醇式丙酮酸E. 1,6-双磷酸果糖及1,3-二磷酸甘油酸满分：2 分20. 不对称转录是指(D)A. 同一mRNA分别来自两条DNA链B. 两相邻的基因正好位于两条不同的DNA链C. DNA分子中有一条链不含任何结构基因D. 两条DNA链均可作为模板链，不同基因的模板链不一定在同一条DNA链上E. RNA聚合酶使DNA的两条链同时转录满分：2 分21. 关于原核生物切除修复的叙述，错误的是（A)A. 需要DNA-polⅢ参与B. 需要DNA连接酶参与C. 是细胞内最重要和有效的修复方式D. 可修复紫外线照射造成的DNA损伤E. 需要UnrA，UvrB，UvrC蛋白参与满分：2 分22. 酶的活性中心是指酶分子（E)A. 其中的必需基因B. 其中的辅基C. 与底物结合部位D. 催化底物变成产物的部位E. 结合底物并发挥催化作用的关键性三维结构区满分：2 分23. 快速调节是指酶的（A）A. 活性调节B. 含量调节C. 酶的变性D. 酶降解E. 酶区域性分布满分：2 分24. 蚕豆病患者的红细胞内缺乏（E）A. 内酯酶B. 磷酸戊糖异构酶C. 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶D. 转酮醇酶E. 6-磷酸葡萄糖脱氢酶满分：2 分25. 下列嘌呤核苷酸之间的转变中，哪一个是不能直接进行的？（E）A. GMP→IMPB. IMP→XMPC. AMP→IMPD. XMP→GMPE. AMP→GMP满分：2 分26. 原核细胞在DNA模板上接近转录终止区域往往有（A）A. 较密集的GC配对区和连续的AB. 多聚A尾巴C. 很多稀有碱基D. σ因子的辨认区E. TA TA TA序列满分：2 分27. 正常生理状况下大脑与肌肉细胞中的能量来源主要是（A）A. 血糖B. 脂肪酸C. 酮体D. 氨基酸E. 核苷酸A满分：2 分28. 与三羧酸循环中的草酰乙酸相似，在尿素循环中既是起点又是终点的物质是（A）A. 鸟氨酸B. 瓜氨酸C. 氨甲酰磷酸D. 精氨酸E. 精氨酸代琥珀酸满分：2 分29. 在重组DNA技术领域所说的分子克隆是指（B）A. 建立单克隆技术B. 无性繁殖DNAC. 建立多克隆抗体D. 有性繁殖DNAE. ．构建重组DNA分子满分：2 分30. 嘌呤核苷酸从头合成的原料不包括（E）A. R-5-PB. 一碳单位，CO2C. 天冬氨酸，甘氨酸D. PRPPE. S-腺苷蛋氨酸满分：2 分31. 基因组代表一个细胞或生物体的（B）A. 部分遗传信息B. 整套遗传信息C. 可转录基因D. 非转录基因E. 可表达基因满分：2 分32. 复制产物为5′-GCTAGA T-3′ 它的模板是（C）A. 5′-GCTAGA T-3′B. 5′-CGA TCTA-3′C. 3′-CGA TCTA-5′D. 3′-GCTAGA T-5′E. 5′-CGAUCUA-3′满分：2 分33. 生物体内氨基酸脱氨基的主要方式是（C）A. 转氨基作用B. 还原性脱氨基作用C. 联合脱氨基作用D. 直接脱氨基作用E. 氧化脱氨基作用满分：2 分34. 最常出现在β-转角的氨基酸是（A）A. 脯氨酸B. 谷氨酸C. 甘氨酸D. 丝氨酸E. 天冬氨酸满分：2 分35. 与CAP位点结合的物质是（C）A. RNA聚合酶B. 操纵子C. 分解（代谢）物基因激活蛋白D. 阻遏蛋白E. cGMP满分：2 分36. 能合成前列腺素的脂酸是（D）A. 油酸B. 亚油酸C. 亚麻酸D. 花生四烯酸E. 硬脂酸满分：2 分37. 嘌呤霉素抑制蛋白质生物合成的机制是（E）A. 抑制氨基酰-tRNA合成酶的活性,阻止氨基酰-tRNA的合成B. 其结构与酪氨酰-tRNA相似,可和酪氨酸竞争与mRNA结合C. 抑制转肽酶活性D. 可与核糖体大亚基受位上的氨基酰-tRNA形成肽酰嘌呤霉素E. 可与给位上的肽酰-tRNA形成肽酰嘌呤霉素满分：2 分38. 参与内源性甘油三酯转运的血浆脂蛋白是（D）A. HDLB. IDLD. VLDLE. CM满分：2 分39. 下列关于初级胆汁酸的叙述哪一项是正确的?（D）A. 是只存在于肠道的胆汁酸B. 是只从肠道重吸收的胆汁酸C. 是在肠道内由细菌合成的D. 是在肝细胞内直接从胆固醇合成的E. 是通过与甘氨酸或牛磺酸结合转变为次级胆汁酸满分：2 分40. 催化可逆反应的酶是（C）A. 己糖激酶B. 葡萄糖激酶C. 磷酸甘油酸激酶D. 6-磷酸果糖激酶-1E. 丙酮酸激酶满分：2 分41. 下列何者是抑癌基因？（C）A. ras基因B. sis基因C. P53基因D. src基因E. myc基因满分：2 分42. tRNA的叙述中，哪一项不恰当（D）A. tRNA在蛋白质合成中转运活化了的氨基酸B. 起始tRNA在真核原核生物中仅用于蛋白质合成的起始作用C. 除起始tRNA外，其余tRNA是蛋白质合成延伸中起作用，统称为延伸tRNAD. 原核与真核生物中的起始tRNA均为fMet-tRNAE. tRNA对其转运的氨基酸具有选择性满分：2 分43. 可与谷丙转氨酶共同催化丙氨酸和α-酮戊二酸反应产生游离氨的酶是（A）A. 谷氨酸脱氢酶B. 谷草转氨酶C. 谷氨酰胺酶D. 谷氨酰胺合成酶E. α-酮戊二酸脱氢酶满分：2 分44. DNA分子的腺嘌呤含量为20%，则胞嘧啶的含量应为（B）A. 20%B. 30%C. 40%D. 60%满分：2 分45. 蛋白质的等电点是（C）A. 蛋白质带正电荷或负电荷时的溶液pH值B. 蛋白质溶液的pH值等于7时溶液的pH值C. 蛋白质分子呈兼性离子，净电荷为零时溶液的pH值D. 蛋白质分子呈正离子状态时溶液的pH值E. 蛋白质分子呈负离子状态时溶液的pH值满分：2 分46. 在体内能分解为β-氨基异丁酸的核苷酸是（C）A. CMPB. AMPC. TMPD. UMPE. IMP满分：2 分47. Km是指（B）A. 当速度为最大反应速度一半时的酶浓度B. 当速度为最大反应速度一半时的底物浓度C. 当速度为最大反应速度一半时的抑制剂浓度D. 当速度为最大反应速度一半时的pH值E. 当速度为最大反应速度一半时的温度满分：2 分48. 提供嘌呤环N-3和N-9的化合物是（E）A. 天冬氨酸B. 甘氨酸C. 丙氨酸D. 丝氨酸E. 谷氨酰胺满分：2 分49. 关于糖、脂、氨基酸代谢的叙述，错误的是（D）A. 乙酰CoA是糖、脂、氨基酸分解代谢共同的中间代谢物B. 三羧酸循环是糖、脂、氨基酸分解代谢的最终途径C. 当摄入糖量超过体内消耗时，多余的糖可转变为脂肪D. 当摄入大量脂类物质时，脂类可大量异生为糖E. 糖、脂不能替代蛋白质满分：2 分50. 属于外肽酶的蛋白水解酶是（B）A. 弹性蛋白酶B. 羧基肽酶C. 胃蛋白酶D. 糜蛋白酶E. 胰蛋白酶满分：2 分。
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亚油酸异构酶在原核生物中的异源表达
反10,顺12-共轭亚油酸（t10,c12-CLA）具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、减少细胞内脂质积累、调节免疫等生物学功能,作为一种新型食品功能因子在食品和药品行业表现出巨大的市场潜力。
来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶（PAI）能够高效专一地催化亚油酸（LA）异构化为t10,c12-CLA,PAI已在多种宿主中表达,但是异源表达的PAI存在表达量低,酶活力不高的问题,尤其在大肠杆菌
中,PAI形成了大量无生理活性的包涵体,严重影响了PAI的应用。
因此,为了解决PAI异源表达的问题,本文采用基因工程手段在大肠杆菌宿主中构建了PAI的促溶表达菌株,研究了载体关键原件启动子和融合标签对PAI 可溶性表达的影响,得到了一株高产可溶性PAI的重组大肠杆菌,并对融合蛋白MBP-PAI进行了分离纯化和酶学性质研究,为解决PAI在大肠杆菌异源表达过程中可溶性蛋白量低的问题提供了新的解决思路。
同时,本文还首次尝试通过枯草芽孢杆菌分泌表达异源蛋白PAI。
研究结果如下:（1）利用同源重组的方法在大肠杆菌中成功构建了含有不同启动子T7、CspA、trc和不同融合标签（His）<sub>6</sub>、Fh8、MBP的重组菌株:E.coli BL21（DE3）（pET24a-Fpai）、E.coli BL21（DE3）（pET24a-Mpai）、E.coli BL21（pCold-Hpai）、E.coli BL21（pCold-Fpai）、E.coli BL21（pCold-Mpai）、E.coli JM109（pTrc-Hpai）、E.coli JM109（pTrc-Fpai）、E.coli JM109（pTrc-Mpai）。
（2）对比研究了融合标签和启动子对目的蛋白PAI表达总量、PAI可溶性表达水平和粗酶液相对酶活的影响。
在PAI表达总量方面:与（His）<sub>6</sub>标签相比,融合标签MBP提高了目的蛋白的表达总量,而由于Fh8基因的密码子偏好性与宿主差异较大,Fh8标
签严重影响了目的蛋白的表达,因此无法分析其规律;启动子同样影响了PAI的表达总量,启动子越强,PAI表达总量越高,即T7控制下的PAI表达总量最高,其次是CspA,最次是trc。
在目的蛋白的可溶性表达水平方面:PAI的可溶性表达水平主要受融合标签的影响,在三种标签中,MBP的促溶效果最好。
在相对酶活方面:标签和启动子的影响与可溶性表达水平的影响一致。
因此,MBP标签和T7启动子是最优组合,E.coli BL21（DE3）（pET24a-Mpai）是表达可溶性PAI最高的重组菌株。
（3）将PAI可溶性表达量最高的菌株E.coli BL21（DE3）（pET24a-Mpai）进行诱导条件优化,优化后的条件为:诱导温度20<sup>o</sup>C、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导培养18 h。
利用亲和层析手段,成功从重组菌株中分离得到电泳纯的MBP-PAI,纯化后MBP-PAI的比酶活为1083.61 nmol/min/mg,蛋白收率约为54.52%,纯化倍数约为41.2倍。
（4）对纯化后的MBP-PAI进行酶学性质研究:最适温度37<sup>o</sup>C,最适pH 7.5,在不同温度下稳定性差异较大;金属离子K<sup>+</sup>能够提高3%的酶活,Na<sup>+</sup>对MBP-PAI的酶活基本无影响,其余金属离子都对MBP-PAI的催化作用产生了抑制;在本研究选用的四种表面活性剂中,只有吐温
-20在低浓度下能够提高MBP-PAI的酶活,吐温-20添加浓度为0.1 mmol/L
时,MBP-PAI酶活提高了5.86%,吐温-20添加浓度为1 mmol/L时,MBP-PAI酶活提高了53.57%;底物LA对MBP-PAI没有抑制作用;MBP-PAI的动力学参数
（5）K<sub>m</sub>为253.89μmol/L,V<sub>max</sub>为2252.76 nmol/min/mg。
枯草芽孢杆菌重组菌株的构建及表达分析。
利用基因工程手段成功构建带有Tat分泌途径信号肽phoD、YwbN和非经典
分泌途径分泌蛋白Eno、gapA的枯草芽孢杆菌重组菌株B.subtilis WB800（pMA5-phoD-pai）、B.subtilis WB800（pMA5-YwbN-pai）、B.subtilis WB800（pMA5-Eno-pai）和B.subtilis WB800（pMA5-gapA-pai）。
但是,采用多种方法均未能使以上四株重组枯草芽孢杆菌表达PAI,这与pai基因含有较多稀有密码子有关,还可能与载体的启动子是非诱导型启动子有关。