基因功能鉴定 异源表达
酶蛋白的异源表达的意义和作用
酶蛋白的异源表达的意义和作用
摘要：
1.酶蛋白异源表达的定义和意义
2.酶蛋白异源表达的作用
3.酶蛋白异源表达的应用实例
4.酶蛋白异源表达的发展前景
正文：
一、酶蛋白异源表达的定义和意义
酶蛋白异源表达是指将外源基因插入到受体细胞的基因组中，使外源基因在受体细胞内表达，从而产生相应的酶蛋白。
酶蛋白异源表达的意义在于，它可以使受体细胞拥有原本没有的酶蛋白，从而赋予受体细胞新的功能。
二、酶蛋白异源表达的作用
酶蛋白异源表达的作用主要体现在以下几个方面：
1.提高生产效率：通过酶蛋白异源表达，可以使受体细胞产生更多的酶蛋白，从而提高生产效率。
2.改变生产过程：酶蛋白异源表达可以使受体细胞产生新的酶蛋白，从而改变生产过程，提高生产质量。
3.赋予新功能：酶蛋白异源表达可以使受体细胞拥有原本没有的酶蛋白，从而赋予受体细胞新的功能。
三、酶蛋白异源表达的应用实例
酶蛋白异源表达在实际应用中具有广泛的应用前景，例如：
1.在农业领域，通过酶蛋白异源表达，可以提高作物的抗病虫能力和抗逆能力，从而提高产量和质量。
2.在医学领域，通过酶蛋白异源表达，可以生产出更多的药物，从而提高药物的生产效率。
3.在环保领域，通过酶蛋白异源表达，可以利用微生物分解污染物，从而提高环境保护的效果。
四、酶蛋白异源表达的发展前景
随着科学技术的不断发展，酶蛋白异源表达技术也在不断完善和提高。
乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达
乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达杨芳,余占桥,张日俊(中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京 100193)摘要:为获得高产量纯品植物乳杆菌素PlnE和PlnF,研究其开发生物兽药的可能,试验通过人工合成植物乳杆菌素基因PlnE和P lnF,构建表达载体pG EX 4T E和pGEX 4T F,经IPT G诱导表达条件优化后,进行亲和层析纯化融合表达蛋白,并使用SDS PA GE进行鉴定。
试验结果表明,pGEX 4T E和pGEX 4T F构建成功,纯化后获得2种产量高达30%的纯品融合蛋白,SDS PA G E鉴定两融合蛋白表达正确。
说明PlnE和P lnF基因片段编码的多肽能在原核细胞中正确表达,为进一步研究该细菌素的生物活性奠定了基础。
关键词:植物乳酸杆菌;细菌素;原核表达;融合蛋白中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2010)12 0055 05细菌素是由某些细菌通过基因编码、核糖体途径合成的一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质及其衍生物,产生菌对其细菌素具有自身免疫性(Ander s son等,1998;Riley等,2002;T orkar等,2003;Car o lissen M ackay等,1997)。
由于细菌素与抗生素相比无抗药性和残留性,目前国内外对细菌素的研究多数集中在开发替代抗生素治疗使用的生物保健剂和兽药上。
NCBI数据库中确定基因和蛋白质序列的细菌素有数百种,然而仅有一种羊毛硫细菌素Nisin用于食品防腐,绝大多数处于试验阶段,究其原因主要是产细菌素的野生菌株产量低,分离纯化困难,距离产业化生产还有很长距离。
研究结果发现,细菌素异源表达对象多为 a类单肽链非修饰细菌素,最终获得的产物活性产量差异较大(余占桥等,2009)。
低水平异源表达的主要原因是直接表达的细菌素肽链对宿主细胞具有毒害作用,抑制其生长。
使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析
使用蛋白质表达技术进行异源蛋白质表达群的分析蛋白质表达技术是一种重要的实验手段，可以用于研究和生产异源蛋白质。
异源蛋白质表达群是指一组表达相同外源基因产物的细胞或生物体群体。
通过对异源蛋白质表达群的分析，可以揭示蛋白质的结构、功能及其在生物学过程中的作用，对于药物研发和基因工程等领域具有重要意义。
一、异源蛋白质表达群的构建在进行异源蛋白质表达群的分析之前，首先需要构建目标蛋白质的表达载体。
表达载体是一种带有目标基因的DNA分子，可以使该基因在细胞内得以表达。
常用的表达载体包括质粒、病毒和细胞系等。
1. 质粒表达系统质粒表达系统通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
将目标基因插入含有启动子、终止子和选择性标记等功能元素的质粒中，经过转化、筛选和培养等步骤，使目标基因在大肠杆菌中表达。
2. 病毒表达系统病毒表达系统常用于哺乳动物细胞。
将目标基因插入病毒载体中，经过转染和感染等步骤，使目标基因在宿主细胞中得到高效表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和军团菌病毒等。
3. 细胞系表达系统细胞系表达系统是直接使用细胞系作为表达载体。
将目标基因通过基因操纵技术导入细胞系中，使其在细胞系中表达。
常用的细胞系包括CHO细胞和HEK293细胞等。
二、异源蛋白质表达群的分析方法异源蛋白质表达群的分析主要通过鉴定和定量目标蛋白质的表达水平、结构特征和活性等方面。
1. 蛋白质鉴定蛋白质鉴定是对异源蛋白质表达群中的目标蛋白质进行鉴定和定位。
常用的方法包括质谱法、免疫印迹和糖基化分析等。
质谱法可以通过检测蛋白质分子质量和氨基酸序列来鉴定目标蛋白质；免疫印迹可以通过特异性抗体与目标蛋白质结合来检测目标蛋白质的存在；糖基化分析可以揭示蛋白质的修饰情况及其对结构和功能的影响。
2. 表达水平定量表达水平定量是对异源蛋白质表达群中目标蛋白质的表达量进行定量分析。
常用的方法包括荧光素酶报告基因法、荧光染料标记法和放射性同位素标记法等。
荧光素酶报告基因法通过检测报告基因与目标基因的转录水平关系来估计目标蛋白质的表达水平；荧光染料标记法可以通过检测荧光信号强度来定量目标蛋白质；放射性同位素标记法可以通过检测放射性同位素的衰减来估计目标蛋白质的表达水平。
异源基因表达系统
（3）分泌表达载体
由于蛋白在表达过程中常形成包涵体， 克服此类问题的主要方式是以分泌表达形式， 将蛋白运送到外周质、外膜甚至进入培养介 质中，这需要在信号肽的帮助下完成。
正因为伴侣蛋白具有促进蛋白质正确折叠的 能力，因此，人们试图通过与伴侣蛋白的共表达 来避免包涵体的产生．
（6）表面呈现表达载体
表面呈现表达分两种情况：一种是噬菌体表面呈 现技术．另一种是细菌表面呈现。
此处仅讨论后一种。细菌表面呈现表达优越性在 于：可以提供活疫苗及有利于寻找药物；有助于研
•虽然该方法改进了生产哺乳动物基因产物的能力，但并不是 万能的。产物溶解性和二硫桥正确的排列仍然是使用大肠杆菌 进行异种基因表达最大的障碍。
通过改变细胞的折叠机制提高产品质量
1. 如果我们设计生产的蛋白在一种热力学不稳定的状 态，我们则无法获得这种可溶性蛋白。
2. 细胞会使用分子伴侣（阻止聚集作用的路径）和可 折叠的催化剂（促进可折叠过程的特殊阶段）来制 造一个合适的折叠蛋白分子。
原核生物中表达真核基因产物
•大肠杆菌仍然是异源基因产物表达的热门宿主。 尽管有多年的大量实验室经验，当在原核生物中
表达真核基因产物时，与产物质量相关的争论依然存 在。 •大肠杆菌的密码子偏爱性与哺乳动物系统有很大不同， 当在这种细菌中尝试表达哺乳动物基因产物时会出现 问题。
密码子的遗传背景
基因表达中的主要影响因素现在已经非常清楚。 稀有密码子聚类能够导致核糖体的暂停和移码，
减低目的基因产物的产量导致不可靠地截断产物 的生成。 密码子遗传背景影响的位置敏感性在3’端的遗传 信息比在5 ’末端更严重。 通过改变较大肠杆菌或为大肠杆菌宿主解码稀有 碱基的供体tRNA偏爱密码子稀有使用的密码子容 易补救二者之一。
异源和同源 dmrt1 基因过表达载体在青鳉体内的整合和表达
1. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071; 2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306; 3. 大连海洋大学 水产与生命学院, 辽宁 大连 116023
摘要: 利用半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) dmrt1 基因和青鳉(Oryzias latipe) dmrt1 基因构建过表达载体, 采用显 微注射技术将两种载体分别导入青鳉受精卵中, 比较异源和同源 dmrt1 基因对青鳉胚胎孵化率的影响以及两种 dmrt1 基因在青鳉体内的基因整合率、基因表达率及对芳香化酶基因(cyp19a)表达的影响。结果表明, 注射 48 h 后, 两种载体均在胚胎内大量表达, 注射青鳉同源性 dmrt1 载体的受精卵孵化率(69.5%)要显著高于注射异源性 dmrt1 载体的受精卵(36.5%)。30 dph(days post hatching)两组被注射稚鱼均能检测到基因整合, 注射同源 dmrt1 的整合率 (30%)要高于异源 dmrt1(10%)。30 dph 稚鱼体内检测不到异源性 dmrt1 载体的表达, 但能检测到同源 dmrt1 载体的 mRNA 表达, 同时芳香化酶基因的表达受到了抑制。本研究为研究舌鳎性别分化相关基因功能提供了基础, 并为 在模式鱼类中研究海水鱼相关基因功能累积了必要的资料。
青海湖盐单胞茵QHL1ectABC基因簇克隆鉴定及二氨基丁酸转氨酶基因ectB的异源表达
生 物 学 杂 志
Ｊ ＯＵＲ ＮＡＬ Ｏ Ｆ Ｂ Ｉ Ｏ Ｌ ＯＧＹ
Ｖｏ ｌ ＿ ３０ Ｎｏ ． ２
Ａｐｒ ，２ ０１ ３
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ２ ０ ９ ５—１ ７ ３ ６ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ２ ． ０ ０ ５
Ｈ ａ ｌ ｏ ｌ ｎ Ｏ Ｉ Ｉ ￣ Ｓ ｓ ｐ ．Ｎ ｊ ２ ２ ３ ｅ ｃ ｔ Ａ Ｂ Ｃ基 因簇 所 编 码 的 酶 蛋 白相 似 性 分 别 达 ５ ７ ％、 ９ ６ ％和 ８ ５ ％ 。利 用分 子 克 隆技 术 构 建 二 氨
基 丁酸转氨 酶基 因 ｅ ｃ ｔ Ｂ的重组表达 载体 ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ 一 ｅ ｃ ｔ Ｂ， 通过 限制 性 内切 酶酶切 和 测序 分析 ， 结果表 明其 目的基 因的
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔ ｈ ｅ ｍ ｏ ｄ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ｈ ａ ｌ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｅ Ｑ Ｈ Ｌ １ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ２ ０ ｗ ａ ｔ ｅ ｒ ｓ ａ ｍ ｐ ｌ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｑ ｉ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ Ｌ ａ ｋ ｅ ｗ ａ ｓ ｐ ｒ ｅ ｌ ｉ ｍｉ ｎ ａ ｒ ｉ ｌ ｙ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ａ ｓ ａ ｍ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ｏ ｆ
ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｕ ｓ Ｈｏ ｌ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ．Ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ｅ ｃ ｔ Ｂ ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ １ ２ ６ ９ ｂ ｐ ｒｏ ｆ ｍ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｗａ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｐ Ｃ Ｒ．Ｔ ｈ ｅ ｅ ｃ ｔ ＡＢ Ｃ ｇ ｅ ｎ ｅ ｃ ｌ ｕ ｓ ｔ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｂ ｉ ｏ ｓ ｙ ｎ —
基因差异表达的研究方法
基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
异源表达
异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：1。
以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是2。
重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。
一般个人认为可以一试的方法包括(1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等(2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种(3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。
因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。
还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。
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基因功能鉴定和异源表达是两个不同的概念，下面我将为您介绍一下它们的含义和方法。
基因功能鉴定
基因功能鉴定是指确定基因编码的蛋白质的生物学功能的过程。
在生物学研究中，确定基因功能对于理解生物系统的运作方式和解决人类疾病具有重要意义。
目前常用的基因功能鉴定方法包括基因敲除、基因过量表达、RNA干扰等。
基因敲除是将基因从细胞中删除，通过比较敲除细胞和野生型细胞的表型差异来确定基因的功能。
基因过量表达则是将基因在细胞中过量表达，观察表型变化以确定基因的功能。
RNA 干扰则是通过沉默基因表达来评估基因功能。
这些方法可以单独或结合使用，以确定基因的生物学功能。
异源表达
异源表达是指将外源基因或DNA序列导入宿主细胞或组织中，使其在宿主中产生蛋白质或RNA的过程。
这种方法被广泛用于生物制药、基因治疗等领域中。
异源表达可以通过转染、病毒载体、质粒转化等多种方法实现。
例如，将人类某一基因的DNA序列导入大肠杆菌中，可以使其在大肠杆菌中产生人类蛋白质，从而进行蛋白质的生产和纯化。
总之，基因功能鉴定和异源表达是生物学和生物技术领域中的两个重要概念，对于研究生物学和应用生物技术都有着重要的意义。