表达异源基因的方法及其所用的载体
分子生物学zuq题库
分子生物学zuq题库６３转基因动物的应用：（１）对基因组织或时期特异表达的研究（２）通过研究转入外源基因后的新表型，能够发觉基因的新功能；（３）导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，能够发觉新的基因（４）可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究（５）建立研究外源基因表达、调控的动物模型（６）对遗传性疾病的研究（７）建立人类疾病的动物模型，（８）动物新品种的培养（９）基因产品的制备（１０）在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。
６４转基因植物技术路线：（１）选择及获得外源目的基因，（２）受体细胞培养，（３）选用适当的转基因方法将目的基因导入受体细胞（４）将转化细胞进行适当培养（５）选择阳性转化细胞（６）培植阳性转化植株（７）转基因植株的鉴定。
６５转基因植物在医学上的应用：（１）可成为新的疫苗来源，植物病毒也成为人类疫苗的可能来源（２）因为植物病毒对动物不致病，因此可利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以诱导哺乳动物免疫系统发生反应。
（３）还可产生单抗，作为化疗药物的靶向载体。
６６基因打靶的必备条件：（１）胚胎干细胞：ＥＳ细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。
体外培养要坚持细胞的分裂增殖与正常的核型，同时抑制细胞的分化。
（２）打靶载体：a、neo阳性选择标志：b、ＨＳＶ－tk阴性选择标志：６７构建打靶载体的差不多过程：（１）获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此ＤＮＡ片段克隆到一样的质粒载体中；（２）从重组质粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；（３）将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；（４）在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将ＨＳＶ－tk基因克隆到此线性载体中。
６８ＤＮＡ芯片技术的应用：（１）ＤＮＡ序列测定（２）基因表达分析（３）基因组研究（４）基因诊断（５）药物研究与开发（药物选择、新药发觉、合理用药、中草药鉴定和真假药辨不）６９引起ＤＮＡ一级结构变异的诱变剂的作用机制：（１）碱基类似物诱发突变（２）改变ＤＮＡ的化学结构（３）结合到ＤＮＡ分子上诱发移码突变（４）紫外线及其其它射线引起的ＤＮＡ分子变化。
异源基因表达系统
（3）分泌表达载体
由于蛋白在表达过程中常形成包涵体， 克服此类问题的主要方式是以分泌表达形式， 将蛋白运送到外周质、外膜甚至进入培养介 质中，这需要在信号肽的帮助下完成。
正因为伴侣蛋白具有促进蛋白质正确折叠的 能力，因此，人们试图通过与伴侣蛋白的共表达 来避免包涵体的产生．
（6）表面呈现表达载体
表面呈现表达分两种情况：一种是噬菌体表面呈 现技术．另一种是细菌表面呈现。
此处仅讨论后一种。细菌表面呈现表达优越性在 于：可以提供活疫苗及有利于寻找药物；有助于研
•虽然该方法改进了生产哺乳动物基因产物的能力，但并不是 万能的。产物溶解性和二硫桥正确的排列仍然是使用大肠杆菌 进行异种基因表达最大的障碍。
通过改变细胞的折叠机制提高产品质量
1. 如果我们设计生产的蛋白在一种热力学不稳定的状 态，我们则无法获得这种可溶性蛋白。
2. 细胞会使用分子伴侣（阻止聚集作用的路径）和可 折叠的催化剂（促进可折叠过程的特殊阶段）来制 造一个合适的折叠蛋白分子。
原核生物中表达真核基因产物
•大肠杆菌仍然是异源基因产物表达的热门宿主。 尽管有多年的大量实验室经验，当在原核生物中
表达真核基因产物时，与产物质量相关的争论依然存 在。 •大肠杆菌的密码子偏爱性与哺乳动物系统有很大不同， 当在这种细菌中尝试表达哺乳动物基因产物时会出现 问题。
密码子的遗传背景
基因表达中的主要影响因素现在已经非常清楚。 稀有密码子聚类能够导致核糖体的暂停和移码，
减低目的基因产物的产量导致不可靠地截断产物 的生成。 密码子遗传背景影响的位置敏感性在3’端的遗传 信息比在5 ’末端更严重。 通过改变较大肠杆菌或为大肠杆菌宿主解码稀有 碱基的供体tRNA偏爱密码子稀有使用的密码子容 易补救二者之一。
异源和同源 dmrt1 基因过表达载体在青鳉体内的整合和表达
1. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071; 2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306; 3. 大连海洋大学 水产与生命学院, 辽宁 大连 116023
摘要: 利用半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) dmrt1 基因和青鳉(Oryzias latipe) dmrt1 基因构建过表达载体, 采用显 微注射技术将两种载体分别导入青鳉受精卵中, 比较异源和同源 dmrt1 基因对青鳉胚胎孵化率的影响以及两种 dmrt1 基因在青鳉体内的基因整合率、基因表达率及对芳香化酶基因(cyp19a)表达的影响。结果表明, 注射 48 h 后, 两种载体均在胚胎内大量表达, 注射青鳉同源性 dmrt1 载体的受精卵孵化率(69.5%)要显著高于注射异源性 dmrt1 载体的受精卵(36.5%)。30 dph(days post hatching)两组被注射稚鱼均能检测到基因整合, 注射同源 dmrt1 的整合率 (30%)要高于异源 dmrt1(10%)。30 dph 稚鱼体内检测不到异源性 dmrt1 载体的表达, 但能检测到同源 dmrt1 载体的 mRNA 表达, 同时芳香化酶基因的表达受到了抑制。本研究为研究舌鳎性别分化相关基因功能提供了基础, 并为 在模式鱼类中研究海水鱼相关基因功能累积了必要的资料。
异源表达——精选推荐
异源表达异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合⽬的基因另外重组⼯程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：1。
以质粒的形式存在于菌体⾥，以质粒表达这种⼀般保存还是容易的，多数情况下⽤抗⽣素压着就问题不⼤，⽽且直接⽤质粒保存，⽤时现转也能顺利表达的情况也有的是2。
重组在宿主基因组中，与宿主蛋⽩⼀起表达这就保存起来⽐较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿⼏代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插⼊的位点在宿主基因组的⾮活跃区域，过⼏代就基因沉默了。
⼀般个⼈认为可以⼀试的⽅法包括(1)⽤抗⽣素传代、保菌后抗⽣素复苏等等(2)得到⼯程菌后第⼀代就保10管，取⼀管传⼀代再保10管，再取⼀管做使⽤菌株，也就是保存最原始的菌种(3)筛选时多筛点，⼏⼗个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜⼀般没那个精⼒)还能保留表达能⼒的算相对⽐较稳定了异源蛋⽩的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，⽽且由于蛋⽩本⾝千差万别，很难有⼀个很完善或很标准的流程⽅法。
另外，表达的宿主也是多种多样，⽬前⽐较常⽤的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆⾍细胞，哺乳动物细胞等，各⾃有着其本⾝的特点，优缺点各异。
但是，异源表达⼜是分⼦⽣物学中很重要的⼀个⼯具，园⼦⾥不少战友都在做这⽅⾯的⼯作，许多帖⼦在讨论这⽅⾯的问题。
因此想发起⼀个针对这⽅⾯的专题讨论，希望有助于⼤家的⼯作，当然也希望能对⾃⼰的⼯作有所帮助，欢迎⼤家讨论。
还有，由于本⼈只做了有关E.coli和甲醇酵母的⼯作，其他虽然我们研究所也有⼈做，但毕竟本⾝没做过，若有错误或不严谨的地⽅欢迎战友们指正。
⾸先在这⾥提出⼏⽅⾯问题，希望⼤家讨论：1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但⽐较常⽤的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆⾍细胞，哺乳动物细胞等，各⾃代表了⼀种体系。
基因差异表达的研究方法
基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展
漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展刘晓庆;那日;郭九峰【摘要】近年来由于漆酶在生物漂白和农作物秸秆利用等方面具有广阔的应用前景,对漆酶的研究越来越受到国内外学者的重视.然而,自然界漆酶的产量和酶活较低,难以适应工业化生产需求.此外,漆酶的产酶效率低,成本高.实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径.目前,国内外已有多种来源的漆酶基因被成功克隆,并在不同的宿主细胞中实现异源表达,但迄今为止漆酶基因异源袁达结果仍然不理想,离真正实现漆酶的高效表达还有一定距离.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】4页(P18-21)【关键词】漆酶;宿主细胞;异源表达;基因克隆;酶活性【作者】刘晓庆;那日;郭九峰【作者单位】内蒙古大学物理科学与技术学院,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特010021【正文语种】中文【中图分类】S188漆酶(laccase，Ec1.10.32)属于含铜的多酚氧化酶，能有效降解自然界中木质素等复杂有机物。
真菌和植物中都可以分泌漆酶，少数的昆虫和细菌也可以分泌漆酶，而真菌是漆酶的主要生产者。
它通过获得O2对苯酚物质进行催化作用，而生成物中仅有水。
漆酶是一种不可多得的环保型氧化酶。
漆酶是参与自然界木质素循环与利用的重要酶之一。
漆酶对富含木质素的农作物残渣的有效降解作用不仅可以减少秸秆焚烧带来的环境问题，而且可以提高青贮饲料的品质和利用率，对与木质素结构相似的污染物也有明显的降解能力。
据统计，漆酶有作用底物250多种[1]1。
漆酶的底物多样性决定了它是一种多功能氧化酶。
它在工业、农业及食品工业都有着极其广泛的应用。
近年来研究表明，漆酶在生物技术方面也有重要的作用，可用于生物传感器与生物检测。
异源表达番茄蔗糖磷酸合成酶基因SlSPS促进拟南芥株型增大研究
河北农业大学学报 JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITY
Vol.44 No.3 May.2 0 2 1
文章编号：1000-1573(2021)03-0034-07
DOI：10.13320/ki.jauh.2021.0044
干旱促进水稻中 SPS 活性增加［17］。高盐处理下的 玉米秧苗的 SPS 活性增加［18］。本研究将番茄中的 1 个 SlSPS 基因转化拟南芥进行异源过量表达，并 对转基因的拟南芥进行表型观察发现，揭示 SlSPS 基因影响植物生长发育和蔗糖积累的生物学功能， 对番茄的产量和品质改良及其生产应用提供理论 依据。
研究发现，植物内不同的 SPS 家族基因的表达 特性不同，所发挥的功能也存在着共性和差异性。 反义表达 CmSPS1 的转基因甜瓜蔗糖含量下降、果 实变小［12］；转菠菜 SPS 基因的棉花表现出更高的 蔗糖 / 淀粉比率，棉花纤维细胞次生壁增厚，品质 提高［13］；转玉米 SPS 基因的马铃薯叶片 SPS 活性 提高，叶片抗衰老，产量增加、蔗糖含量提高［14］。 南极发草在南极夏天长白昼的环境下，SPS 活性极 高，蔗糖超量积累从而适应极端寒冷气候［15］。低 温处理下猕猴桃果实的 SPS 基因转录水平提高［16］。
异源表达番茄蔗糖磷酸合成酶基因 SlSPS
促进拟南芥株型增大研究
刘雅慧，朱龙英，杨学东，朱为民，张 辉，张迎迎
（上海市农业科学院 园艺研究所 / 上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201403）
摘要：为了探究番茄 SlSPS 基因的功能，通过克隆番茄中 SlSPS 基因，构建过表达载体并在拟南芥中进行遗传转化，
SlSPS 基 因 过 表 达 载 体 pCAMBIA1300-35SSlSPS 转入农杆菌 GV3101 后，通过蘸花法转化拟
自考医学考试分子生物学(习题卷4)
自考医学考试分子生物学(习题卷4)第1部分：单项选择题，共85题，每题只有一个正确答案,多选或少选均不得分。
1.[单选题]Lac阻遏蛋白结合乳糖操纵子的（ ）A)CAP结合位点B)O序列C)P序列D)Z基因答案:B解析:2.[单选题]下列哪一种质粒属于耐药性质粒?（ ）A)F质粒B)R质粒C)col质粒D)质粒噬菌体答案:B解析:3.[单选题]培养液中，影响腺苷酸环化酶的活力，使细胞内cAMP的活力下降，从而抑制LAC操纵子的转录的原因是由于存在A)乳糖B)葡萄糖C)半乳糖D)果糖答案:B解析:4.[单选题]密码子存在于A)DNAB)rRNAC)mRNAD)tRNA答案:C解析:5.[单选题]大肠杆菌DNA复制的延伸过程中，起主要作用的酶是A)DNA聚合酶Ⅲ全酶B)DNA聚合酶IC)DNA聚合酶ⅡD)引物酶答案:A解析:C)核糖体+蛋氨酰tRNA+mRNAD)翻译起始因子+核糖体答案:C解析:7.[单选题]下列不属于PCR体系的基本成分是A)DNA或RNA模板B)特异性引物C)核苷三磷酸(NTP)D)缓冲液答案:C解析:8.[单选题]下列不属于小分子RNA的是A)hnRNAB)snRNAC)scRNAD)miRNA答案:A解析:9.[单选题]顺式作用元件的形式不包括A)密码子B)增强子C)CAAT盒D)GC盒答案:A解析:10.[单选题]下列不属于顺式作用元件的是A)启动子B)转录因子C)终止子D)衰减子答案:B解析:11.[单选题]下列哪一种酶在DNA复制述程中具有校读作用A)DNA聚合酶IB)DNA聚合酶IIC)DNA聚合酶IIID)DNA解旋酶答案:A解析:12.[单选题]下列不属于细胞凋亡的特征是A)出现炎症反应B)出现凋亡小体13.[单选题]通过对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因矫正过程称为A)碱基修复B)基因转换C)重组修复D)基因修复答案:A解析:14.[单选题]聚合酶链反应有三个基本步骤组成循环反应，它们是变性、和延伸。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
表达异源基因是将外源基因插入到接受者的基因组中，以获得某种新的特性或者功能。
表达异源基因的方法是研究与开发基因疗法的基础，在基因编辑、转基因技术和生物技术研究中也有着广泛的应用。
本文将重点介绍表达异源基因的方法以及载体的应用。
一、表达异源基因的方法
1.转化法
转化法是一种常用的表达异源基因的方法。
它的原理是，将外源基因构成的载体（如质粒、病毒粒子等）靶向植物细胞或细菌，并利用抗性基因实现外源基因的持久性表达。
例如，在植物转基因研究中，可以将生物素基因构成的质粒，通过抗药性基因转化到植物细胞，从而使植物具备抗药性能力。
2.融合表达法
融合表达法是另一种常用的表达异源基因的方法。
它的原理是将外源基因与宿主基因融合，以达到表达异源基因的目的。
例如，在蛋白质表达研究中，可以将外源基因与宿主基因融合，使得宿主细胞能够表达外源蛋白质。
融合表达法可以有效提高蛋白质的表达水平，是蛋白质表达研究中的重要方法。
二、表达异源基因所用的载体
1.质粒
质粒是一种常用的表达异源基因的载体，它由DNA分子构成，可以存在于细菌、真菌、植物细胞等细胞中。
质粒的优点在于，它可以轻松地在不同的宿主细胞中传播，并可以持久的表达异源基因。
例如，质粒可以用来转化植物细胞，使其具有抗性能力。
2.病毒粒子
病毒粒子也是一种常用的表达异源基因的载体。
它可以用来携带外源基因进入宿主细胞，以实现对基因的表达。
例如，病毒粒子可以用来转化植物细胞，使其具有抗虫性能力。
此外，病毒粒子还可以用来转染宿主细胞，以获得某种特定的功能。
综上所述，表达异源基因的方法和载体都是研究与开发基因疗法的基础，它们在基因编辑、转基因技术和生物技术研究中也有着广泛的应用。
常用的表达异源基因的方法有转化法和融合表达法，而载体有质粒和病毒粒子。
它们可以有效地将外源基因插入到接受者的基因组中，以获得某种新的特性或者功能。