分离培养的操作方法
实验三细菌的分离培养及移植
➢ 美蓝指示剂可显示干燥器中的厌氧程度，美蓝在有氧时呈 氧化型（蓝色），无氧时呈还原型（无色）。
➢ （2）李伏夫法
➢ 此法系用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应，以 吸收空气中的氧气，其反应式如下：
➢ 方法：
➢ ①取一个干燥器，用水量出其体积。
➢ ②按体积计算并称量出焦性没食子酸和10％氢氧化钠的用 量。
➢ ③将氢氧化钠溶液倒入干燥皿的底部，将焦性没食子酸用 纸包好，用青霉素小瓶将焦性没食子酸支撑于氢氧化钠溶 液上方，两种药品勿接触。
➢ ④放上隔板，将接种好的培养皿放在隔板上。
➢ ⑤放入一支美蓝指示剂管。
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nana22ss22oo44na22coco33na22soso44na22sosoco22该法与焦性没食子酸法操作基本相同只该法与焦性没食子酸法操作基本相同只是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐中的oo22按1000cm1000cm33空间用连二亚硫酸钠空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各及碳酸钠各3g3g称取药品在纸上混匀后称取药品在纸上混匀后加水少许使混合物潮湿立即放入干燥器加水少许使混合物潮湿立即放入干燥器底部上放隔板及培养皿密封培养
，接种后将平皿用石蜡密封，倒扣置37℃恒温箱 中培养2～3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌先 后生长的现象。
➢ 2、化学方法
利用还原作用强的化学物质，将环境或培养 基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降 低氧化-还原电势。
➢ （1）焦性没食子酸法
原理：
细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。
从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。
操作步骤一．需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。
划线法示意图见图4-3。
（1）连续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。
将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。
将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。
灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
培 养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。
培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？导语对于⼤部分科研⼈员来说，研究中⼀般⽤到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进⾏细胞传代和保种。
然⽽，这些细胞系常常由于体外长期培养，⽽丢失原有⽣物学特性，对药物处理的反应差距越来越⼤。
因此，原代细胞的地位⽇渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添⾊不少。
然⽽，就⼩编亲⽣经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合⾃⾝经验，为⼤家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养⽅法。
第⼀部分：原代细胞的基本知识1. 什么是原代细胞培养?原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进⾏培养的细胞。
这⾥的组织主要指：组织器官、外周⾎及胚胎等。
原代细胞培养：由于原代细胞⽣长缓慢，繁殖⼀定的代数停⽌⽣长（⼀般10代以内）。
所以⼀般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。
2. 原代细胞与细胞系（cell lines）的区别原代细胞和细胞系的⽐较：Primary cells Cell lines增殖能⼒较弱强繁殖代数⼀般只能传10代以内⽆限增殖，50代左右遗传物质完整性遗传物质未改变遗传物质发⽣改变⽣物特性最接近临床样本偏离临床样本培养容易程度⽐较复杂简单，易操作原代细胞和细胞系的⽐较3. 原代细胞的应⽤由于原代细胞⽣物学特性未发⽣很⼤改变，最接近和反映体内⽣长特性，因此是：(1) 研究⽣物体细胞的⽣长、代谢、繁殖提供有⼒的⼯具；(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准⽤药的⽬的。
第⼆部分：原代细胞分离和培养技术原代培养的原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常⽤胰蛋⽩酶/胶原酶)、螯合剂(常⽤EDTA)或机械⽅法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以⽣存、⽣长和繁殖，这⼀过程称原代培养。
主要包括取材——分离——培养等3部分；在原代细胞应⽤较多的包括：组织器官（如实体瘤、⽪肤等）、悬浮细胞的取材等。
微生物的分离与培养
微生物的分离与培养实验原理：一、培养基的制备培养基通过人工加入微生物的生长所必需的各种成分，包括水，碳源，单元，无机盐和生长因子各种营养物质配置而成的养料。
二、微生物的接种微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。
由于实验目的，培养基种类及容器等不同，所以接种方法不同。
用不同的接种方法以获得生长良好的纯种微生物。
三、微生物的培养不同的微生物对营养需求不同，根据这点可以通过培养基对微生物的做初步分离。
四、质粒的提取碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。
在PH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断链，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断链，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4.8D的NaAc高盐缓冲液冲击去调节其PH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA，蛋白质—SDS的复合物等一起沉淀下来而被除去。
五、PCR技术DNA的半保留复制时生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋或单链。
在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制或同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
六、琼脂糖凝胶电泳许多重要的生物，如蛋白质，核酸等都具有可电离的基因，在某一特定的PH下他们可以电离正电荷或负电荷，当加上电均后，这些带点分子就会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
而电泳技术就是利用在电均的作用下，由于待分离样品中各种分子带点性质，分子大小形状等的差异，从而产生不同的迁就率，对样品进行分离，鉴定或纯化的技术。
PCR产物的回收将含有质粒DNA的荧光色带切下，溶解后填充到硅胶柱中，利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA，在低盐和高PH条件下DNA可在被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。
实验一大肠杆菌的分离和培养
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
病原物的分离培养、纯化和人工接种
四川农业大学论文植物病理学姓名：代妮专业：植物保护班级：10级2班学号：201004602012/6/25病原物分离培养、纯化和人工接种病原物的分离培养、纯化和人工接种内容摘要：本实验以辣椒炭疽病和茶叶斑病为材料，采用组织分离法分别对其病原真菌进行分离培养、纯化和，再用针刺接种法对其进行人工接种。
以柯赫氏法则（Koch’s Postulate）为依据，对辣椒炭疽病和茶叶斑病病原进行鉴定。
全过程拟分步实验完成，第一步完成PDA培养基的配置、分装、灭菌、斜面及平板培养基的制作；第二步采用组织分离法，在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片病组织块（进行升汞消毒时间分别为10s、15s、20s、25s四个时间梯度），完成病原真菌的分离，并置于恒温箱内进行培养，3-4天后观察菌落生长情况，发现每个方向都长出菌落，但消毒25s的菌落生长最为茂盛，挑取生长最茂盛的菌落转移至斜体中进行纯化培养;第三步完成辣椒炭疽病原的针刺接种，定期观察感病辣椒症状,发现与所取辣椒病组织材料症状相同。
关键词：辣椒炭疽病茶叶斑病病原物PDA培养基分离培养纯化人工接种正文：1 目的要求通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用方法，学习常用的接种方法，掌握根据柯赫氏法则鉴定植物病原物的方法。
2 用具、试剂与材料2·1用具：手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、250mL 锥形瓶、漏斗、试管、2000mL烧杯、小烧杯、移液管、止水夹、石蕊试纸、乳胶管、报纸、棉花、医用纱布、解剖剪、接种环、酒精灯；2·2试剂与材料：马铃薯、琼脂、葡萄糖（或蔗糖）、NaOH溶液、盐酸、漂白粉、70%酒精、升汞；茶叶斑病病叶、辣椒炭疽病果实3 内容方法3·1培养基的配置真菌和细菌等微生物与其他生物一样，生长和发育都需要一定的营养条件。
不同类群的微生物对营养条件的要求不同。
因此，在人工培养微生物时，就必须考虑它们的营养要求。
细菌的分离培养与移植实验报告
实验五细菌的分离培养与移植[实验目的]1、掌握细菌分离培养及移植的基本要领和方法。
[实验原理]在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。
分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。
在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。
同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。
[实验材料]菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌等。
器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。
培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂平板、酒精灯、接种环。
[实验内容]1、细菌的分离平板划线接种法通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
可用做分离纯种细菌。
操作方法（三区划线法）：a、右手拿接种环，烧灼冷却后，勾取菌种。
b、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
c、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
d、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
e、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
平板分区划线法培养后菌落分布情况平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。
竹荪菌丝分离方法
竹荪菌丝分离方法引言：竹荪（学名：Lentinus edodes）是一种重要的食用菌，也是一种药用菌。
竹荪菌丝是竹荪的细胞丝状结构，是培养竹荪的基础。
分离竹荪菌丝是进行竹荪培养和研究的关键步骤，本文将介绍竹荪菌丝分离的方法。
一、准备工作1. 选择合适的菌种：选择健康、无污染、无病害的竹荪子实体作为菌种。
2. 材料准备：准备好培养基，可以使用琼脂或木质素琼脂等适合竹荪生长的培养基。
二、分离菌丝的方法1. 表面消毒：将竹荪子实体表面的杂质清除，可以用刀具将外层皮肤刮去，然后用70%酒精进行表面消毒。
2. 分离菌丝：将表面消毒后的竹荪子实体切成小块，然后将小块菌体放在培养基上。
3. 培养菌丝：将培养基上的竹荪子实体放置在适当的温度和湿度条件下，让菌丝生长。
一般来说，竹荪的适宜生长温度为20-25摄氏度，湿度为80-90%。
4. 菌丝分离：当菌丝生长到一定程度时，可以用无菌的工具将菌丝分离到新的培养基上，以形成纯菌丝。
三、培养菌丝的注意事项1. 环境卫生：在进行菌丝分离和培养过程中，要保持实验室的卫生，避免细菌、真菌等杂质的污染。
2. 培养基选择：根据竹荪的生长特点选择适合的培养基，以促进菌丝的生长。
3. 温湿度控制：保持培养环境的适宜温度和湿度，有利于菌丝的生长和繁殖。
4. 无菌操作：在进行菌丝分离和培养时，要做好无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
四、菌丝分离后的应用1. 菌种保存：分离出的纯菌丝可以保存在培养基上或冷冻保存，以备后续的研究和培养使用。
2. 培养竹荪：分离出的纯菌丝可以用于竹荪的大规模培养，以满足市场需求。
3. 菌丝研究：分离出的纯菌丝可以用于竹荪菌丝的生物学和遗传学研究，以进一步了解竹荪的生长和发育机制。
结论：竹荪菌丝分离是进行竹荪培养和研究的关键步骤。
通过表面消毒、菌丝分离和培养等步骤，可以得到纯菌丝，为竹荪的大规模培养和研究提供了基础。
在进行菌丝分离和培养过程中，需要注意环境卫生、培养基选择、温湿度控制和无菌操作等因素。
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分离培养的操作方法
分离培养是一种常用的细胞培养方法，它可以将不同种类的细胞分离开来单独培养，以便进行研究。
下面将介绍分离培养的操作方法。
1. 准备工具和培养基
进行分离培养需要准备一些基本的工具和培养基，包括组织培养皿、吸管、离心管、离心机、细胞培养基、酶消化液等。
在使用之前，需要先对工具和培养基进行消毒处理。
2. 组织处理
将待分离的组织取出，去除表面的血管和结缔组织等杂质，然后用刀片将组织切成小块。
将组织块放入含有酶消化液的培养基中，用吸管将培养基慢慢吸入离心管中，避免气泡的产生。
然后将离心管放入37℃的恒温培养箱中，进行酶消化。
3. 离心分离
经过酶消化后，组织块会被分解成单个细胞。
将离心管放入离心机中，进行离心分离。
离心的速度和时间需要根据实验要求来确定。
离心后，可分离出不同密度的细胞。
4. 细胞培养
将分离出的单个细胞放入培养皿中，加入适量的细胞培养基，放入
恒温培养箱中进行培养。
培养的条件需要根据细胞的特性来确定，包括温度、CO2浓度、培养时间等。
需要注意的是，不同种类的细胞对培养条件的要求有所不同。
5. 细胞观察
在培养的过程中，需要对细胞进行观察和记录。
可以使用显微镜观察细胞的形态和数量，也可以通过细胞培养基的颜色变化来判断细胞的生长情况。
如果需要进行细胞传代，可以根据实验要求进行操作。
分离培养是一种基础的细胞培养方法，可以用于分离不同种类的细胞，以便进行研究。
在进行分离培养的过程中，需要注意工具和培养基的消毒处理，以及不同细胞对培养条件的要求。
通过分离培养，可以更好地了解细胞的特性和功能，为细胞生物学研究提供基础支持。