指状青菌的分离培养方法
柑橘秋冬主要病虫害之病害青绿霉病
【症状识别】这两种病害的发病症状聚相似性，多在树冠下部叶片上形成一层致密的绿色附着 物，阻碍叶片光合作用，影响树势及下部枝条开花结果。发病初期，多从果蒂或伤口处发病， 在果实表面出现水渍状病斑，呈褐色软腐，后长出白色霉层，以后又在其中部长出青色或绿色 粉状霉层，霉层带以外仍存在水渍状环纹，病斑后期可深入果肉，导致全果腐烂。不同之处： 青霉病以开始贮藏时发生较多，不会附着包装纸，能闻到发霉气味。绿霉病以贮藏中后期发生 较多，仅长在果皮上，霉层常附着在包纸上，能闻到一股芳香气味。
柑橘秋冬主要病虫害
之-病害：青绿霉病
【分布情况】青霉病和绿霉
病分布普遍，是柑橘贮藏、
运输期间主要的病害。
【发病病源】青霉菌PENICILLIUM DIGITATUM 称意大利青霉菌，引起青霉病； P.DIGITATUM 称指状青霉菌，引起绿霉病。均属半知菌亚门真菌。意大利青霉菌落产孢处淡 灰绿色，分生孢子梗集结成束，无色，具隔膜，先端数回分枝呈帚状；分生孢子初圆筒形，后 变椭圆形或近球形。指状青霉菌落暗黄绿色，后变橄榄灰色；分生孢子梗同上；分生孢子无色， 单胞，卵形至圆柱形。
发病病园
【发病规律】这两种病菌腐生于各种有机物上，产生分生孢子，借气流传播，通过各种伤口侵 入为害，也可通过病健果接触传染。温度大，树冠交叉密集郁闭的果园中易发生，多发生在树 冠下部老叶上。一旦发病则逐渐扩大蔓延，管理粗放，树势差的果园，中下部叶片可全被附着。 一般情况柑橘贮藏初期多发生青霉病；贮藏后期多发生绿霉病。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
【防治方法】采收，包装和运输中尽量减少伤口，不宜在雨后，重雾或露水未干时采收。
① 减少果实受伤。选择边续晴天，露水干后采摘；采摘时轻采轻放，剪口短平，用棉布、皮革等 柔软材料衬垫容器，减少机械损伤。 ② 采收后的果实应堆放在阴凉通风处预贮4-6天，使果皮变软后再入库贮藏。 ③ 药剂防治。可以在采果前7-10天，对准果实喷施双胍辛胺乙酸盐、咪鲜胺类杀菌剂。也可在采 后（45%咪鲜胺500-800倍、40%嘧霉胺1000-2000倍）对采收后24小时内浸果2-5分钟，也有 的将药剂与果蜡混合处理果实。 ④ 果实进库前10-15天，对贮运用具及储藏库进行消毒处理，可用硫黄熏蒸消毒24小时。 ⑤ 塑料薄膜单果包装，避免接触白扩散。 ⑥ 有条件的储藏库控制温湿度，湿度80%-85%为宜，甜橙温度以1-3度为宜，注意通风换气。
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
青霉菌
• 图中央是青霉菌，周
围是致病细菌。距青 霉素最远的细菌个大、 色浓， 活力十足；距青霉菌 较近的细菌个较小、 色较浅，活力较差； 而最接近青霉 菌的细菌个最小、色 发白，显然已经死亡
如何提取青霉素
青霉素生产可分为菌种发酵和提取精制两个步骤 。 ► ①菌种发酵：将产黄青霉菌接种到固体培养基上，在25℃下 培养7～10天，即可得青霉菌孢子培养物。用无菌水将孢子 制成悬浮液接种到种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空 气、搅拌，在27℃下培养24～28h，然后将种子培养液接种 到培养基中，通入无菌空气，搅拌，在27℃下培养7天。 ► 提取精制：将青霉素发酵液冷却，过滤。滤液在pH2～2.5的 条件下，于萃取机内用醋酸丁酯进行多级逆流萃取，得到丁 酯萃取液，转入pH7.0～7.2的缓冲液中，然后再转入丁酯中， 将此丁酯萃取液经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即 可得青霉素钾盐。青霉素钠盐是将青霉素钾盐通过离子交换 树脂（钠型）而制得。
处理方法
注意搞好环境卫生，保持培养室周围及栽培地清洁，及时 处理废料。接种室、菇房要按规定清洁消毒；制种时操作 人员必须保证灭菌彻底，袋装菌种在搬运等过程中要轻拿 轻放，严防塑料袋破裂；经常检查，发现菌种受污染应及 时剔除，决不播种带病菌种。如在菇床培养料上发生青霉 菌，可及时通风干燥，控制室温在 20～22℃，待杂菌抑 制后再恢复常规管理。调节pH，适当提高pH，在拌料时 加1%～3%的生石灰或喷2%的石灰水可抑制杂菌生长。 药剂拌料，用干料重量0.1%的甲基托布津拌料，防治效 果更好。还需注意菇房和菇场通风换气，避免高温高湿； 局部发生此病时，可用5%～10%的石灰水涂擦或在患处 撒石灰粉，也可先将其挖除，再喷3%～5%的硫酸铜溶液 杀死病菌。
青霉菌代谢类型 ----异养需氧 型
柑橘绿霉病中草药高效抑菌剂的筛选及抑菌机理研究
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[工作]菌种分离思路
![[工作]菌种分离思路](https://img.taocdn.com/s3/m/dde9f955326c1eb91a37f111f18583d049640fe0.png)
菌种分离思路：⌝菌种筛选方案：[1] 初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。
初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。
初筛的手段应尽可能快速、简单。
[2] 复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。
⌝菌种筛选的手段[1] 初筛[2] 从菌体形态变异分析[3] 平皿快速检测法：具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等[4] 摇瓶培养法：初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。
土中细菌的富集培养与分离分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。
但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。
富集方法：运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。
富集可以促进抗性的产生并维持下来。
土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。
水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。
用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。
水中细菌分离的简易富集技术：(1) 在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；(2) 在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
(3) 培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。
(4) 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。
【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种
代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物 阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等 糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等 葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核 酸酶等 纤维素酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果 胶酶、纤维素酶等
样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）； 离心法（浓缩） 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌
诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
某理工大学《微生物学教程》考试试卷(708)
某理工大学《微生物学教程》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（230分，每题5分）1. 普遍转导、局限转导和溶源转变中的噬菌体均为缺陷噬菌体。
（）答案：错误解析：普遍转导的噬菌体为完全缺陷噬菌体，局限转导中的噬菌体为部分缺陷噬菌体，溶源转变中的噬菌体为正常的温和噬菌体。
2. 血球计数板计数区的面积是1mm2。
（）答案：正确解析：血球计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池。
计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。
计数池有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大方格，每个大格面积为1.0毫米×1.0毫米＝1.0平方毫米；容积为1.0平方毫米×0.1毫米＝0.1立方毫米。
3. 所有真菌营养体的基本单位是菌丝。
（）答案：错误解析：丝状真菌营养体的基本单位是菌丝，而构成酵母菌营养体的基本单位是单个细胞。
4. 质粒的拷贝数受RNA控制。
（）[南开大学2014研]答案：正确解析：从本质上讲，质粒的复制启动是受一种负反馈机理控制的。
根据这种模型，细胞中RNA分子的浓度是随着质粒拷贝数的多寡而增减的。
5. 在DNA病毒中，碱基C的量一定等于碱基G的量。
（）[南开大学2014研]答案：错误解析：DNA病毒中也可能存在单链DNA，G和C含量不一定相同。
6. 通过EMP途径的逆向反应可进行多糖合成。
（）答案：正确解析：EMP途径的逆向反应可合成多糖。
7. 接合孢子是接合菌亚门的无性孢子，内生。
（）答案：错误解析：接合孢子是结合菌亚门产生的有性孢子，是一种内生孢子。
8. 用作转化实验中的肺炎链球菌有两个菌株，其一为有荚膜、菌落表面光滑、有致病力的R型菌株，另一为无荚膜、菌落表面粗糙、无致病力的S型菌株。
四大类微生物菌落形态的比较和识别
四大类微生物菌落形态的比较和识别一、实验目的和内容目的：1 熟悉四大类微生物菌落的主要特征2 掌握识别四大类微生物菌落形态的依据和要点，并应用于识别未知菌落内容：1 观察已知的四大类微生物菌落特征2 辨认未知的四大类微生物菌落特征实验原理掌握识别四大类微生物菌落形态的要点对于从事菌种的筛选、杂菌的识别和菌种鉴定等项工作都有重要意义。
菌落是由某一微生物的少数细胞或孢子在固体培养基表面繁殖后所形成的子细胞群体，因此，菌落形态在一定程度上是个体细胞形态和结构在宏观上的反映。
由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，因而其菌落形态特征也各异。
在四大类微生物的菌落中，细菌和酵母菌的形态较接近，放线菌和霉菌形态较相似。
菌和酵母菌的异同细菌和多数酵母菌都是单细胞微生物。
菌落中各细胞间都充满毛细管水、养料和某些代谢产物，因此，细菌和酵母菌的菌落形态具有尖似的特征，如湿润、较光滑、较透明、易挑起、菌落正反面及边缘、中央部位的颜色一致，且菌落质地较均匀等。
它们之间的区别如下：细菌：由于细胞小，故形成的菌落也较小，较薄、较透明且有“细腻”感。
不同的细菌会产生不同的色素，因此常会出现五颜六色的菌落。
此外，有些细菌具有特殊的细胞结构，因此，在菌落形态上也有所反映，如无鞭毛不能运动的细菌其菌落外形较圆而凸起；有鞭毛能运动的细菌其菌落往往大而扁平，周缘不整齐，而运动能力特强的细菌则出现更大、更扁平的菌落，其边缘从不规则、缺刻状直至出现迁居性的菌落，例如变形杆菌属和菌种。
具有荚膜的细菌其菌落更粘稠、光滑、透明。
荚膜较厚的细菌其菌落甚至呈透明的水珠状。
有芽孢的细菌常因其折光率和其他原因而使菌落呈粗糙、不透明、多皱褶等特征。
细菌还常因分解含氮有机物而产生臭味，这也有助于菌落的识别。
酵母菌：由于细胞较大（直径约比细菌大10倍）且不能运动，故其菌落一般比细菌大、厚而且透明度较差。
酵母菌产生色素较为单一，通常呈矿蜡色，少数为橙红色，个别是黑色。
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—、真菌的分离培养方法（－）平板划线分离法
1．取适合指状青霉的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。
2．如面包、水果、蔬菜等含碳水化合物多的食物上,真菌的生长比较明显,可用接种针挑取孢子后,直接作划线分离。
取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，【或放在三角瓶中，放几颗玻璃珠，震荡摇晃20分钟】使分离菌悬浮于水中。
3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。
4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。
如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。
另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。
（二）稀释分离法
1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml或10ml），分别标记1、2、3、4、5号。
取样品（如田土等1g，水果真菌孢子），投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。
2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮
液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。
注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。
3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。
然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。
二．指状青霉培养性状观察
指状青霉\真菌界\无性型真菌门\半知菌纲（Fungi Imperficti）\壳霉目（Sphaeropsidales）\杯霉科（Discellaceae）\指状青霉属\指状青霉
指状青霉在固体培养基上的生长表现：
菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养2～5d，可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状等。
菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直径1～2mm或更小）。
很多霉菌的孢子能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。
识别特征：
菌落绒状,暗黄绿色,后变橄榄灰,有特殊的香味;侵害柑橘果实，引起绿霉病。
生殖特征：
分生孢子梗短,帚状枝大而不规则;产孢瓶体在不同的高度上形成;分生孢子卵形至圆柱形。
三．指状青霉的形态观察
（一）真菌水浸片的制备及观察
常用美兰染色液制备真菌水浸片来观察真菌的菌体形态，并且活细胞能还原美蓝为无色，故可区别死细胞、活细胞。
将美兰染色液一滴滴加在干净的载玻片中央，如不染色则加蒸馏水一滴，用解剖针挑取培养3~5天的少量菌丝体放在载玻片的液滴中，将玻片置于解剖镜下，细心地用解剖针将菌丝体分散成自然状态，并加盖干净盖玻片。
为避免产生气泡，应先将其一边接触液滴，再慢慢放下盖片，然后置于显微镜载物台上进行观察。
观察时注意它们的菌丝有无隔膜、孢子囊柄与分生孢子柄的形状、分生孢子小梗的着生方式、孢子囊的形态、足细胞与假根的有无、孢子囊孢子和分生孢子的形状和颜色、节孢子的形状和特点等。