漆酶催化邻苯二酚开环的自由基反应机制
真菌漆酶工程及其在有机合成中的应用
真菌漆酶工程及其在有机合成中的应用摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于真菌，高等植物及细菌中。
由于漆酶反应条件温和并具有广泛的专一性，被认为理想的绿色催化剂。
综述通过合理设计和定向改造真菌漆酶及漆酶工程并运用于有机合成领域的研究。
关键词：漆酶催化剂有机合成中图分类号：q554.9 文献标识码：a 文章编号：1007-3973（2013）003-078-03漆酶是一种含铜的蛋白酶，通过夺取底物一个电子能够催化酚类、多酚类和苯胺氧化，通过电子传递将氧气还原成水。
漆酶和漆酶介质体系在生物修复、纸浆漂白、纺织品生物整理和生物燃料电池等方面都有潜在的应用。
值得注意的是，漆酶具有在官能团的氧化与将异源分子连接到新的抗生素衍生物之间执行快速精密的转化的功能，或者催化合成复杂天然产物的关键步骤，因此可用于有机合成领域。
1 漆酶的性质1.1 生化特征漆酶是含有四个铜原子并与三个氧化还原位点（t1，t2和t3）相结合的典型单体胞外酶。
t1型cu在氧化还原测试中呈现绿色，与还原性底物的氧化作用有关。
三核簇（含有一个t2型cu和两个t3型cu）与t1位点相距12a，分子氧在此处被还原成水。
在不同的培养条件下，真菌合成漆酶会出现不同的同工酶。
大多数漆酶都是单体蛋白，不同来源的漆酶其分子被不同程度的糖基化，平均分子量在60-70kda，碳水化合物含量在10-20%，这有助于漆酶的高稳定性。
通常与酶通过共价键相连的碳水化合物包括甘露糖，n-乙酰葡糖胺和半乳糖。
氨基酸链含有包括n-末端分泌肽在内大约含有520-550个氨基酸。
1.2 生物学功能与工业应用漆酶生物学功能包括孢子抗病性，色素沉着，选择性的催化木质素降解，腐殖质脱毒过程等。
漆酶具有广泛的底物专一性，因此广泛应用与生物技术中。
在小分子介质存在的情况下，漆酶能显著增强其底物专一性。
通过使用漆酶介体体系可能扩宽漆酶工业应用的范围。
例如，漆酶和漆酶介体体系已经应用于纸浆造纸中的脱木质素和生物漂白，发电站废水处理，纺织和染印工业中纤维素酶学修饰和染料漂白，酶法交联木质素材料生产中密度纤维板等。
EGCG抗氧化，延缓衰老
EGCG抗氧化，延缓衰⽼ 氧化对⽣命活动⾮常重要，营养物质的正常代谢、能量的供给等等都是通过体内氧化所获得的，可以说离开氧化⽣物就⽆法⽣存。
不过在另⼀⽅⾯，氧化会转换成不安定的因⼦伤害你的健康和美丽。
当氧化的正⾯作⽤没有很好地发挥的时候，氧化的负⾯功效⽴刻就会显现出来，产⽣⾃由基，⾝体⾥的⾃由基会慢慢增多，于是疾病和衰⽼这些现象也会随之⼀⼀冒出头来。
衰⽼是⼈体各器官功能开始逐步降低的⼀种⽣理现象，是⼀个缓慢渐进的过程，是⼀种不可避免的⾃然规律。
导致⼈体衰⽼的原因有许多学说，如脑中⼼说、⾃由基说、微循环障碍学说等。
集中到⼀点，就是细胞组织的衰⽼。
作为⼈体基本组成单位的细胞，全⾝由60~100万亿个细胞所组成，当细胞得不到⾜够的营养（⽔、氧和各种营养物质），就不能满⾜其⽣长和新陈代谢的需要，因⽽出现衰⽼，或由于细胞在新陈代谢过程中被⾃⾝所产⽣的副产物——氧⾃由基过多所致的细胞毒害作⽤，细胞受氧⾃由基的攻击，使细胞不能按正常规律发育，长期积累就使细胞乃⾄⼈的未⽼先衰。
因此⼈体垃圾（⾃由基）是健康的⼤敌。
归根结底,氧化和衰⽼都是由体内垃圾(⾃由基)引起的.⾃由基是造成⼈体⽼化及诸多疾病的重要原因之⼀，据估计⼤约80％-90％的⽼化性、退化性疾病都与⾃由基有关，其中包括⼼⾎管疾病、⽼年性痴呆、⽪肤⽼化、免疫⼒低、癌症、关节炎、帕⾦森⽒症、⽩内障等等。
“⾃由基”对⼈体健康带来的严重伤害不得不引起重视. 根据美国医学界的调查，25岁之前，⼈的⾝体中会⾃然产⽣抗氧化、抗衰⽼的成分，但过了25岁，这些成分就会慢慢消失。
解决之道，就是给⼈体补充抗氧化、抗衰⽼的物质，减少⾃由基的产⽣或清除过多的⾃由基，防⽌⼈体被氧化。
所以为了抵抗来⾃外界和体内的过氧化，我们必须不断补充外源性的抗氧化剂，以保护和加强⾃⾝抗氧化系统，才能达到延长⽣命延缓衰⽼的⽬的。
抗氧化、消除有害的⾃由基对于⾝体的健康和保持年轻体质⾄关重要。
EGCG是茶多酚的主要成分,是⼀种天然的抗氧化剂。
漆酶活性测定方法
漆酶活性测定方法本页仅作为文档页封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March一、测 O法2漆酶是一种多酚氧化酶，它所催化的反应过程中有O z 的介入。
测量反应的耗氧量既可间接地推知漆酶的活性。
较早建立的瓦氏呼吸器检测法便是基于这一原理。
这一方法后来改进为利用氧电极来测量耗氧量，如弗罗纳等以愈创木酚为底物，利用氧电极测定了漆酶催化反应过程中的耗氧量，并将 1个漆酶活性单位定义为PH6 ． o 及2 5 ℃条件下以愈刨木酚作为电子供体时所需要的酶量。
亦可取醌醇作底物．利用氧电极测定漆酶消耗1. 0 μmo lO2的活性。
郭明高提出了测定生漆漆酶活性的吸氧法。
即将生漆溶于甲苯，测定酶促吸氧速度和累计酶促吸氧量，同时利用碱促吸氧法测定反应前后漆酚浓度的变化，从而可以求得漆酚浓度衰减的规律及漆酶促吸氧的克分子比。
此法的特点是反应时漆酶处于其天然存l 在的状态而反应底物又恰为漆酶的天然底物漆酚，这在漆酶测活研究中尚属首倒 [ 2 1 。
漆树酶活力检测用0..1m ol·L-1磷酸盐缓冲液与有机溶剂配成一定体积的底物，其浓度为1．35×10 m ol·L-1。
分别移取3mL于1cm测量池和参比池中，恒温水浴中预热10min．注入20μL漆树酶溶液(含酶2～3 μg)于测量池中，立即搅匀，测定350nm处吸光度A随时间的变化值．漆酶比活力定义为一定温度下,单位酶量催(mg·min-1)．将漆树酶在不同溶剂体系中的化反应的初速度，单位记为△A350mm比活力与漆树酶在纯水体系中的比活力相比，其比值称活力比()212 漆酶活性的定量测定方法21211 分光光度计法测定漆酶活性对苯二胺(λmax495) 、愈创木酚(λmax 485) 、邻苯二酚(λmax 400)和漆酚(λmax 420)都可用做漆酶活力测定的底物。
漆酶固定化的研究动态及应用前景
表 １ 各种 固定化方法特点的 比较
联， 使酶蛋 白能 以有序方式附着在载体 的表面 ， 并尽 可
究 ．教育科学 ，９ ５ ：７－ １ ２ （ ） ８ ９
［ ］ 守志 （ ） ９９ ［ 国家 研究 理事会． １戢 译 ．１９ ． 美］ 国家科 学教育 标准．
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１ ・ Ｏ
生物 学教学 ２１年（ ７ 第６ ０２ 第３卷） 期
联 聚集体 （ｏ ｂ —Ｃ Ｅ ｓ ， ｅｍ ｉ Ｌ Ａ ） 该交 联 聚集 体集 多种酶 的
生物 学教学 ２１年（ ７ 第６ ０２ 第３卷） 期
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漆酶 固定 化 的研 究动 态 及 应 用 前 景
杜东 霞 （ 泽 生 科 菏 学院 命 学系 山 ２ ０ ） 东 ７ １ ４５
摘 要 本 文概述 了漆 酶固定化的基本方 法 ， 着重介 绍了漆酶固定化的创新 和发展 ， 并对其应用前景进行 了展望 。 漆酶 固定化 应用前景 关键词
２ 新型 固定化漆酶技术的创新和发展
沉淀和化学交 联两 步组成 ， 首先 向处 于溶解 状态 的酶 溶液中加入适 宜 的蛋 白质沉 淀剂制 备酶沉 淀 聚集 体 ， 随后加入交 联剂（ 常为戊二 醛 ） 通 进行 交联 ， 交联剂 戊 二醛的醛 基 和酶 沉 淀 聚 集 体 的 氨基 发 生 Ｓｈｆ碱 反 ｃｉ 应 ， 而制备出颗粒大小为 ｌ Ｏ ￣ 的不 溶 于 水 的 从 ～ｌ０ ｍ
２ １ 交联 酶 聚 集体技 术 交 联 酶 聚集 体 （ｃ ｓ ． ｒ ｓ— ｏ ｌ ｋｄｅｚｍ ｇｒ ａ ｓ Ｃ Ｅ ｓ 是 由荷 兰德尔 福特理 ｉ ｅ ｎｙ ｅａｇｅ ｔ ， Ｌ Ａ ） ｎ ｇｅ 工大学 的 Ｃ ｏ ［ 于 ２０ ａ等 ８ ］ ００年率先提 出的一种 新型 的 酶 固定化技术 。其 原理见 图 １９ ， ］ 该技 术通 常 由物 理 Ｅ
光催化中自由基捕获实验添加量
光催化技术是一种利用光能来促进化学反应的方法，近年来得到了广泛的应用和研究。
光催化反应中的自由基是一个具有重要意义的研究对象，其产生和捕获对于光催化效率和反应产物的选择具有重要的影响。
本文将重点讨论光催化中自由基捕获实验添加量的研究现状和发展趋势，以期为相关研究提供借鉴和参考。
一、光催化中自由基的产生与捕获在光催化反应中，光能的吸收激发了催化剂或底物分子的电子，产生了一系列中间体，其中自由基是重要的反应中间体之一。
自由基产生的方式多种多样，包括光解、单电子转移、能量转移等机制。
不同的反应条件和催化剂会产生不同类型的自由基，如氧化性自由基、还原性自由基等。
在光催化反应中，自由基的捕获对于控制反应的产物选择和提高反应效率具有重要作用。
不同的自由基捕获剂会选择性地与特定类型的自由基发生反应，阻止其继续参与反应过程，从而影响反应的进程和结果。
常用的自由基捕获剂包括叔丁醇、二苯基甲酮、邻苯二酚等。
二、自由基捕获实验添加量的研究现状自由基捕获实验添加量是指在实际光催化反应中添加的自由基捕获剂的量。
对于不同类型的光催化反应和催化剂，合适的自由基捕获剂添加量具有重要意义。
过高的添加量会抑制反应的进行，降低反应效率；过低的添加量则会无法有效捕获自由基，使其继续参与反应，影响产物的选择和反应结果。
确定合适的自由基捕获剂添加量对于光催化反应的进行至关重要。
目前，关于自由基捕获实验添加量的研究主要集中在以下几个方面：1. 自由基捕获剂的种类与添加量的关系不同类型的自由基捕获剂具有不同的捕获活性和选择性，添加量的大小也会影响其捕获效果。
研究人员通常通过实验方法探究不同自由基捕获剂在不同添加量下对光催化反应的影响，以找到最佳的添加量和最适合的自由基捕获剂种类。
2. 自由基捕获实验添加量的优化通过调节自由基捕获剂的添加量，优化光催化反应的过程，提高反应效率和产物选择性。
研究人员通过系统的实验设计和数据分析，寻找最佳的自由基捕获剂添加量，建立优化的光催化反应条件。
有关邻苯二酚又称儿茶酚
邻苯二酚又称儿茶酚。
分子式为1,2-(HO)2C6H4。
邻苯二酚多数以衍生物的形式存在于自然界中。
基本信息中文名称：邻苯二酚。
英文名称：o-Dihydroxybenzene；Catechol。
别名：1，2-苯二酚；儿茶酚；焦儿茶酚；焦儿茶素；二羟基苯。
邻苯二酚CAS No.：120-80-9。
分子式：C?6H?6O?2；C?6H?4〖DK〗(OH)?2。
分子量：110.11。
危险标记：15(毒害品)。
包装方法：塑料袋或二层牛皮纸袋外纤维板桶、胶合板桶、硬纸板桶；塑料袋或二层牛皮纸袋外普通木箱；螺纹口玻璃瓶、铁盖压口玻璃瓶、塑料瓶或金属桶（罐）外普通木箱；螺纹口玻璃瓶、塑料瓶或镀锡薄钢板桶（罐）外满底板花格箱、纤维板箱或胶合板箱。
物理性质主要成分：纯品。
外观与性状：无色结晶，见光或露置空气中变色，能升华。
熔点(℃)：105。
沸点(℃)：246。
相对密度(水=1)：1.34。
相对蒸气密度(空气=1)：3.79。
蒸气压(kPa)：1.33(118.3℃)。
闪点：127℃。
燃烧热(kJ/mol)：2854.9。
稳定性和反应活性：稳定。
禁配物：酰基氯、酸酐、碱、强氧化剂、强酸。
避免接触的条件：光照、空气。
危险特性：遇明火、高热可燃。
受高热分解放出有毒的气体。
与强氧化剂接触可发生化学反应。
溶解性：溶于水，易溶于乙醇、乙醚。
化学性质邻苯二酚是一种强还原剂，易被氧化成邻苯醌，反应式如下：邻苯二酚在室温下可还原费林溶液和氧化银溶液。
与氯化亚砜反应，生成亚硫酸邻苯二酚酯：与邻苯二胺反应，生成吩嗪：与氢氧化钡作用生成钡盐。
邻苯二酚最早是由干馏原儿茶酸或蒸馏儿茶提取液得到的，其反应式如下：后来发现，干馏某些植物和碱熔融某些树脂等也能得到邻苯二酚。
工业上是通过重氮化（见重氮化反应）邻氨基苯酚后水解，或者在高压釜中水解邻氯苯酚制得。
邻苯二酚常用作显影剂，但不如对苯二酚的作用强；也可作试剂、消毒剂等。
用途是重要的化工中间体，可用于制造橡胶硬化剂、电镀添加剂、皮肤防腐杀菌剂、染发剂、照相显影剂等。
邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸的漂白作用机理
邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸的漂白作用机理邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸（1,2-benzene disulfonic acid peroxide）是一种化学试剂，它具有漂白作用，并且广泛应用于纸张、织物和印刷品的漂白过程中。
邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸的漂白作用机理涉及多个反应步骤，其中包括自由基反应和氧化反应。
首先，邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸的漂白作用是通过自由基反应来实现的。
自由基是一种具有非常活泼的化学性质的分子，其主要特征是带有一个未成对的电子。
在漂白过程中，邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸会通过光或热激活，产生自由基。
这些自由基可以与有机杂质发生反应，引起其分子链的破裂，从而使其颜色变淡。
其次，邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸的漂白作用还涉及氧化反应。
氧化是指物质在与氧气或氧化剂作用时，失去电子或氢原子，或者增加氧原子或其他电子或氢原子的化学反应。
在漂白过程中，邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸会与有机染料发生氧化反应，使其失去彩色基团或转化为无色物质。
这种氧化反应可以通过将自由基引入有机染料分子中来实现。
邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸的漂白作用机理还涉及一些其他的反应步骤。
例如，它可以通过与异亚硫酸盐（bisulfite）反应来消除产生的过氧化物自由基。
这种反应会生成硫酸氢离子和亚硫酸盐根离子，从而降低了过氧化物自由基的浓度。
此外，邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸的漂白作用还可能涉及酸碱中和反应。
在漂白过程中，邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸通常会以酸性形式存在。
当它与碱性物质如氢氧化钠或碳酸氢钠反应时，会发生中和反应，生成相应的盐类和水。
总结起来，邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸的漂白作用机理主要涉及自由基反应、氧化反应、酸碱中和反应等多个反应步骤。
这些反应步骤可以使颜色较重的有机杂质发生分解、氧化和中和等反应，从而实现漂白的效果。
邻苯二甲酰亚胺过氧乙酸作为一种重要的漂白试剂，在纸张、织物和印刷品的制造过程中发挥着重要的作用。
曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法
曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法1.多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定1.1基本原理：多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。
在后熟衰老过程或采后的贮藏加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。
多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。
因此，可以用比色法测定多酚氧化酶的活性。
1.2实验试剂和仪器：a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL）b．试剂1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。
母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。
取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。
2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。
3）50mmol/L邻苯二酚溶液取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。
1.3实验步骤1）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。