酶工程实验——大蒜细胞SOD的提取、SOD活力测定
SOD活性的测定
SOD活性的测定一、酶液的制备：称取0.5g样品放入研钵中，加2毫升0.05M PH=7.8的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4℃冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。
二、S OD的测定：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；现配现用。
（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；现配现用,避光保存。
(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，同上(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用蒸馏水定容至1000ml。
避光保存。
同上SOD反应混液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例为1.5：0.3：0.3：0.3：0.25，按母液顺序配制，然后依次加入核黄素0.3ml和酶液50微升。
2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取50微升的酶液，4000Lux照光30分钟，同时取两支试管，一支做对照，一支做空白（对照、空白不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，反应后遮光保存，以空白调零，560nm比色。
每个试验重复三次（3试验+3空白+3对照）3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A CK—A E）×V／（W×0.5 ×Vt×A CK）单位：NBT光还原50%为单位SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。
植物中SOD的分离提取及性质研究实验报告
反应，在 420nm 下测定吸光值。
2. 酶液的最适温度探究
试管
1号
2号
3号
4号
5号
试 剂 ml
温度处理（ ）
0
25
50
75
100
PH8.3 磷酸缓冲 液
3
3
3
3
3
SOD 酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
蒸馏水
2
2
2
2
2
在各自的温度下静置 10min,然后取出
邻苯三酚
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
向提取液中加入 0.25 倍体积的氯仿-乙醇混合液，搅拌 15min,5000r/min，离心 15min,弃除杂蛋白，得粗酶液。（留取 1ml 粗酶液备用，正确量取剩余粗酶液的体积，记录） SOD 的沉淀分离
将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min,5000r/min, 离心 15min 得 SOD 沉淀。 将 SOD 沉淀溶于 0.05mol/LPH 7.8 的磷酸缓冲液中，于 55~60° C 热处理 15min，再离心弃沉淀的得 SOD 酶液（留取 1ml 酶液备 用，正确量取剩余酶液的体积，记录）
2 / 16
加 2、不连续电泳
不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于 浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离 胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度） 的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续 电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的 选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得 到电泳分离最重要的指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技 术。
大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化
广东石油化工学院实验报告生物技术系专业生物技术班别学号姓名同组人实验课程大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化实验日期 2011-6-13至2011-6-21成绩大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化一、实验目的：1.学习并掌握大蒜SOD 提取与纯化的方法及原理。
2.学习并掌握DEAE-纤维素离子交换层析分离纯化蛋白质的操作方法。
3.学习并掌握SDS-PAGE 法测定蛋白质分子量的方法。
4.学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD 酶活的方法。
5.熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。
二、实验原理：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O 2-) 的歧化反应，使 O 2-转化为 H 2O 2 和 O 2。
因此，SOD 是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。
SOD 是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD 、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 3种。
Cu/Zn-SOD 是分布最广而且是最重要的SOD ，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD ，一般由两个亚基组成。
SOD 对热、pH 以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD 对氰化物及过氧化氢均敏感。
SOD 不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
Cu/Zn-SOD 由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm ，由于含铜，所以在可见光680nm 处有最大吸收。
国内测定SOD 活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。
在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O 2-）。
中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。
植物中SOD的分离提取及性质研究
植物中SOD的分离提取及性质研究前言：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。
SOD广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。
SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。
在医药中，SOD可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。
植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。
材料及方法：一、试剂(1) PH7.8 0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液(2) PH8.2 50mmol/l Tris-HCL(3)0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液:准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。
4℃冰箱中保存可用1～2d。
(4)7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液:准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。
4℃冰箱中保存可用2～3d。
(5)含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液:A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。
B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。
大蒜中超氧化物歧化酶的分离纯化以及其特性探究(翻译)
大蒜中超氧化物歧化酶的分离纯化以及其特性探究摘要：本文描述从大蒜中提取超氧化物歧化酶的℃一种简单易行、经济实惠的方法。
其分离纯化分为三个部分：PBS氯仿-乙醇提取，丙酮沉淀和DEAE离子交换层析。
大蒜SOD的酶活力为4124U/mg，回收率为53.3%，浓缩系数是192。
SDS-PAGE 电泳分析显示大蒜SOD具有高度的一致性，当pH为4-11时，SOD的酶活将会在很大程度上被氰化物和过氧化氢抑制。
经验证，温度低于50℃或超声波处30min，酶的活力仅有轻微的减少，大蒜SOD的最大吸收峰值为269nm。
关键词：超氧化物歧化酶，大蒜，提纯，色谱法1.引言虽然大蒜药用已经有几千年了，但是直到最近才研究其作用方式。
大蒜不仅可以抑菌、抗病毒、抑制真菌和原生动物，而且对心血管和免疫系统有很好的功效1。
很多年来来，对打算的研究报告一直集中在其作为抑菌要的方面，从而忽视了其他的药理学作用2-5。
及其有报道称大蒜SOD有其独特的药理作用。
6对于生命有机体，超氧化物歧化酶（SODEC1.15.1.1）是一种十分重要的金属螯合酶，可催化有害的超氧化物阴离子歧化生成过氧化氢和氧分子。
基于其抗氧化作用，SOD一直被用于医学治疗、化妆品和其它化学工业7.8.目前大部分的SOD都是从动物血浆或植物细胞中提取，这些组织中含量低，提取工艺复杂，提高SOD的生产成本，这限制了它更广阔的应用。
研究表明，打算是含有SOD最为丰富的植物，100g大蒜中的SOD酶活力范围2000-3000U，远超过另一种SOD含量丰富的植物——刺梨，然而，之前很少有研究大蒜的SOD及其作用机制。
直到现在，大蒜的研究只是涉及SOD的详细分子结构和部分药理作用。
本文介绍了一种有效、经济实惠的提取纯SOD的方法，这不仅为后续成本低廉可生物再生新型的提取方法提供方向，也对大蒜SOD的药理功能的进一步探究奠定了基础。
2.材料和方法2.1原材料大蒜（中国广州市购买），标准牛血SOD（天津应用生命科学研究所）2.2大蒜的预处理去皮，将蒜瓣放入搅拌器到捣碎2.3磷酸缓冲液提取100g蒜泥中加入300mL磷酸缓冲液（50mmol/L，pH7.4）室温下浸提40min，再用200mL磷酸缓冲液反萃取大蒜渣两次，过滤，取清液。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定所需药品：（1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液：A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液1毫升B+10.76毫升A（2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。
（3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。
（4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液（5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液（6）石英砂实验步骤：1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。
然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。
酶液可在低于0℃下的环境中保存。
2.按下表加入试剂：试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。
接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。
假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。
M/N=100/XM——2、3号杯中溶液的光密度的平均值N——其余杯中溶液的光密度值X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。
结果计算：SOD活力按下式计算：A=V*1000*60/（B*W*T）A——酶活力（酶活力单位·g-1·FW·h-1）V——酶提取液体积（毫升）B——一个酶活力单位的酶液量（微升）W——样品鲜重（克）T——反应时间（分）因测定样品数量多时也可用下列简式计算：A=（D1-D2）*V*1000*60/（D1*B*W*T*50%）D1——2、3号杯光密度的平均值D2——测定样品的光密度值。
SOD活性测定
SOD活性测定SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
－A325mm/min----------------------------------------＊100％度样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验四、五大蒜细胞SOD的提取、SOD活力测定
一. 实验目的
学习超氧化物歧化酶的提取与分离方法
二. 实验原理
超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子（O2－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2－＋H2＝＝O2＋H2O2。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
三. 实验方法及步骤
1．组织或细胞破碎
称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。
2．SOD的提取
将上述破碎的组织或细胞，加入2－3倍体积的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000rpm，离心15min，弃沉淀，得提取液。
3．除杂蛋白
提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000rpm离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。
4．SOD的沉淀分离
将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000rpm离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液中，于55－60℃热15min,离心弃沉淀，得到SOD 酶液。
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
5．SOD活力测定
取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。
(ml)
在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。
加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应2min，然后立即测定各管在480nm处的光密度。
对照管与样品管的光密度值分别为A和B。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。
即：
酶活力（单位）＝2·（A－B）·N/A
式中N――样品稀释倍数；
2――抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。
若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算：
酶活力单位/ml＝2·（A－B）·N/A ·V/V1＝26·（A－B）·N/A
式中V――反应液体积（6.5ml）；
V1――样品液体积（0.5ml）。
最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化回收率。
四. 附注
材料和试剂
（1）新鲜蒜瓣
（2）大蒜细胞，通过细胞培养技术获得
（3）磷酸缓冲液：0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲溶液。
（4）氯仿－乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇＝3：5（V/V）。
（5）丙酮：用前冷却至4－10℃。
碳酸盐缓冲液：0.05mol/L,pH10.2。
EDTA溶液：0.1mol/L。
肾上腺素液：2mmol/L。