图位克隆

1.1 构建遗传作图群体

用于作图群体的类型可有多种。一般说来，在这类群体中，异花授粉植物分子标记的检出率较自花授粉植物的高。但是对于基因的图位克隆而言，培育特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的关键环节。这些遗传材料应该满足这样的条件，即除了目标基因所在座位的局部区城外，基因组DNA序列的其余部分都是相同的，在

这样的材料间找到的多态性标记才可能与目标基因紧密连锁。

目标基因的近等基因系(NILs)是符合条件的一类群体。近等基因系是指几乎仅在

目标性状上存在差异的两种基因型个体，这可通过连续回交的途径获得。由于NILs

的遗传组成特点，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近。Martin等(1993)就是用RAPD技术分析番茄PTO基因的近等基因

系而获得了与该基因表现共分离的分子标记，以该分子标记为探针筛选基因组文库而实现了染色体登陆。又如在玉米上，利用AFLP技术分析玉米CMS-S型雄性不育的恢复

基因及近等基因系，已获得与目标基因紧密连锁的分子标记并以其用作分离RF3基

因的探针。

一般说来，当标记为显性遗传时，欲获得最大遗传信息量的F2群体，须借助于

进一步的子代测验，以分辨F2中的杂合体。为此，Michelmore等(1991)发明了分离

群体分组分析法(bulked segregant analysis，BSA)以筛选目标基因所在局部区域的

分子标记。其原理是将目标基因的F2(或BC1)代分离体的各个体仅以目标基因所控制

的性状按双亲的表型分为两群，每一群中的各个体DNA等量混合，形成两个DNA混

合池(如抗病和感病、不育和可育)。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个

DNA混合池之间理论上主要在目标基因所在局部区域的差异，这非常类似于NILs，

故也称作近等基因池法。研究表明，近等基因系法、分离群体分组分析法再结合

AFLP等强有力的分子标记技术使人们能够在短时间内从数量众多的分子标记中筛选出

与目标基因紧密连锁的标记。更为有意义的是，这种策略在尚未构建遗传图谱的物种中也是可行的。

1.2 筛选与目标基因连锁的分子标记

筛选与目的基因连锁的分子标记是图位克隆技术的关键，常用的分子标记有

RFLP、RAPD、SSR和AFLP等。这些技术有别于最初的形态标记、细胞学标记和生化标记，一般表现出稳定、可靠的特点，有的使用成本也相对较低，特别适用于筛选与目标基因紧密连锁的标记，尤其是与目标基因共分离的标记。因此能够加快克隆基因的进程，研究者可依据不同的研究目标、对象、目的、条件等，选择使用这些技术。值得提及的是随着分子标记技术的发展，一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也有了长足的进步，它们相得益彰，互为促进，为基因的图位克隆提供了有益的借鉴。

1.3 借助连锁图谱筛选分子标记

当基因图位克隆策略刚刚提出的时候，植物分子连锁图谱的构建尚处于萌芽阶段，当时找到一个与目标基因连锁的分子标记通常要花费数月甚至数年的时间。在过去的十年里，这种状况有了显著改善，由于可以很方便的建立和维持建图所必需的较大的分离群体，因而植物分子连锁图构建工作的发展速度超过了动物的同类研究。现在业已建图的植物已多达几十种，其中包括了所有重要的农作物，水稻，玉米，番茄，小麦，马铃薯，拟南芥等重要经济作物和模式植物的遗传图谱已相当精细，含有数百甚至数千个标记。高密度分子连锁图的绘制为筛选与目的基因紧密连锁的分子标记提供了良好的开端。比如，番茄的遗传图谱含有1000个分子标记，其基因组大小约为1000×106bp，因

此对任何基因，都可以找到与之相距在1000 kb之内的分子标记。

1.4 借助比较基因组共享分子标记

比较基因组研究主要是利用相同的DNA分子标记(主要是cDNA标记和基因克隆)

在相关植物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同(共线性)或相似性(同线性)，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。已有的研究表明，存在生殖隔离的不同植物物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。如番茄、马铃薯和辣椒；水稻、小麦和玉米；小麦、黑麦和大麦；高粱和玉米；拟南芥和芸薹属；以及大麦和水稻。更为有趣的是，Moore等(1995)同时对水稻、小麦、玉米、谷子、甘蔗及高粱等6种主要禾本科物种的基因组进行了比较作图研究，结果

表明其中基因组最小的水稻居于中枢的位置，即这些禾本科植物基因组的保守性可归结到水稻基因组的19个连锁区段上。由这19个区段可实现对所研究的全部禾谷类作物

染色体的重建，并可构成一个禾谷类作物祖先种的染色体骨架。通过这一研究，人们对禾谷类作物的进化演变历程有了更深入的认识。植物比较基因组的研究成果表明，在更广的范围上，包括禾本科、十字花科、豆科植物及一些树木的基因组在基因组成和基因排列顺序上都存在很大程度的一致性。而在包括小麦、玉米和水稻等重要农作物的禾本科作物上，基因组成和排列顺序的一致性非常完好，人们可以在模式植物水稻上用图位克隆技术克隆相关物种的大多数重要基因。此外，比较基因组研究还给人们一个重要的启示，那就是模式植物上遗传作图的成果可推而广之，这对那些遗传作图工作相对滞后的植物尤其重要。比较基因组作图使建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加，从而大大提高获取离目标基因很近的分子标记的可能性。

比较基因组作图是利用分子标记技术在1个目标性状的分离群体中把目的基因定

位于染色体的一定区域内，然后通过利用高密度的分子连锁分析，以精细定位目的基因。目前，作图的类型可分为2类，分别是遗传图谱和物理图谱。遗传图谱对图位克隆虽

然非常重要，但更精细的物理图谱尤为重要。而增加图谱上的分子标记数目是精细作图的基础，增加分子标记的方法—是整合已有的遗传图谱，再者就是寻找新的分子标记。现在已有越来越多的植物的遗传图谱趋于饱和，如水稻已有3275个分子标记的图谱，覆盖基因组的1512.5 cM和10400个EST标记。目前利用稀有切点内切酶结合PEGE

技术已成功用于植物基因组的大规模物理作图，从而可以确定连锁标记与目的基因间的实际物理距离的大小，为基因的克隆奠定了基础。

1.5 局部区域的精细定位、作图

一旦把目标基因定位在某染色体的特定区域后，接下来就要对其进行精细的作图及筛选与目标基因紧密连锁的分子标记。目前的作图类型分为两类，分别是遗传图谱和物理图谱。

（1）遗传图谱的构建

染色体的交换与重组是遗传图谱构建的理论基础，通过作图群体的分析，如果一个基因与两侧最近的分子标记距离均在 2 cM以上，就需要作精细的遗传图谱。因为即

使是在小基因组水稻中，平均 1 cM也相当于250 kb左右的物理距离，如果在着丝粒

附近就可能相当于1000 kb左右，需要进行若干步的染色体步行，非常费时费力。因此，精细的遗传图谱对图位克隆显得非常重要，而增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的基础。在一个已知区域内增加分子标记有两种方法，第一种方法是整合已有的遗传图谱。如将生理、生化、分子标记图在同一区域内整合在一起，就会提高分子标记的密度。另一种方法是寻找新的分子标记。在植物上，精细作图的发展速度超过了动物的同类研究，这主要是因为在植物上可很方便地建立和维持较大的分离群体，并建立了几种不同的检测标记间连锁关系的统计软件。现在，业已建图的植物已多达几十种，其中包括了所有重要的农作物(Tanksley，1995)，如玉米、番茄、水稻、小麦、大麦、