精准医学在癫痫中的应用

精准医学在癫痫中的应用 癫痫是脑部神经元同步异常化放电导致的反复发作性、短暂性痫性发作。据统计，在全球范围内约有5亿入口被此病所困扰，对患者的生活质量和社会功能造成了严重的影响[1]，它为神经科常见疾病之一。目前虽然有20余种不同的抗癫痫药物，但仍至少有1/3患者的癫痫是难治性癫痫。另一方面，药物的不良反应也十分严重，包括加重癫痫发作或者是引发新的癫痫类型[2]。因此，针对癫痫，发现更有效和更易耐受的药物，亟待解决。在过去的几年里，遗传学研究未能解决由点突变、染色体排序等不同遗传学改变所引起的癫痫综合征[3-5]。近年来，随着全基因组分析和下一代测序技术的进一步发展，癫痫相关基因的数量在不断扩展，且研究基因突变的有效体内外模型和药物基因组学也再不断发展，这些进展不但改善了当前抗癫痫药物的应用，也确定了新的治疗靶点[2-3]，均有助于形成癫痫方面的精准医学(precision medicine，PM)。 一、癫痫遗传学病因 癫痫分子遗传学研究早在20年前就已经开始了，并且已经进入了一个快速发展的阶段。联锁分析、靶向候选基因研究等传统遗传学技术和下一代测序技术的应用，已经鉴别出了许多癫痫相关基因(表1)，且其数目仍在继续增长[6]。

尽管癫痫危险基因的鉴别有所进展，但是PM依赖于个体患者致病突变基因的鉴别，而不仅仅是人群中癫痫发病风险基因的鉴别。因此癫痫PM需要开发定量评估特异性突变致癫痫特异度的方法，帮助确定并比较正常群体与患病群体之间致病突变的遗传变异模式，其包括突变的类型及其频率。事实上，基因水平得分与变体水平得分相整合后的生物信息学，将可能预测严重早发性疾病个体基因组中的致病突变基因[7-8]。 二、药物基因组学 由于抗癫痫药物(antiepileptic drugs，AEDs)个体疗效的多样性和潜在的不良反应，而药物基因组学基于检测个体的遗传背景如何影响药物治疗反应变化(药效学和不良反应)[9]，因此其在癫痫患者的精准化治疗中发挥着非常重要的作用。患者的遗传多态性通过改变药代动力学(即吸收，分布，转运，代谢，清除)和药效学(即作用位点)两方面来影响不同患者间的不同治疗效应[10]。编码AEDs代谢酶基因序列变异的多态性[11]。，导致了AEDs个体反应的多样性。如众所周知的细胞色素P(cytochrome P，CYP)450酶CYP2C9和CYP2C19参与大多数AEDs的代谢，这些酶的多态性引起了药物血清浓度和药物清除率的显著差异[12]。 CYP2C19等位基因缺乏的患者，其苯巴比妥的清除率会降低[13-14]，此外，在编码CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因[15]。以及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine diphosphate glucuronosyhransferase，UGT)酶[16]。多态性存在的情况下，丙戊酸钠的代谢和清除也可降低。 目前已知有两种不同机制介导AEDs的抗药性：①血一脑脊液屏障转运蛋白表达的改变阻碍AEDs到达神经元作用靶点；②AEDs导致作用靶点敏感性的改变。研究普遍认为药物转运蛋白以及多药耐药抵抗基因的过度表达导致了抗癫痫药物的耐药性[17]。例如：P一糖蛋白(P—glycoprotein，Pgp)，药物外排转运蛋白，Siddiqui等[17]认为多药耐药基因(multi—drug resistance gene，MDRl)或ABC超家族的ATP结合盒B亚家族成员1(ABC superfamily(ATP—binding cassette，sub—family B，member 1，(ABCBl))基因核苷酸的多态性与Pgp功能改变以及不断增加的药物抵抗性相关。另外，AEDs代谢相关电压依赖性钠通道编码基因多态性与药物抵抗之间存在潜在的关系。例如，编码电压门控钠离子通道1型蛋白d亚基(sodium channel protein type l subunit alpha SCN 1 A)的内含子5位第91个碱基序列为鸟嘌呤>腺嘌呤(intervening sequence5—91 G>A，IVS5—91 G>A)的多态性与治疗所需的卡马西平剂量增加相关。 药效反应的遗传学研究虽已取得进展，但仍存在局限性，因此将药物基因组学用于评估抗癫痫药的治疗反应仍待进一步研究。然而，药物基因组学的另一个重要价值是预测药物不良反应及其发生风险。如苯妥英钠和卡马西平的特异性皮肤反应[18]。目前已经很明确的知道在亚洲人群中，人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)HLA—B*1 5：02等位基因与卡马西平介导的Stevens—Johnson综合征以及表皮坏死综合征相关，在欧洲人群中HLA—A*31：01等位基因与卡西平介导的超敏反应相关，这种超敏风险从5．0％增加到了26．0％[19]。Chung等[20]认为HLA—B*15：02增加了卡马西平介导的Stevens—Johnson综合征的发生率，这可能与等位基因介导的T淋巴细胞毒性的活化相关，因为活化的T淋巴细胞可以释放大量的颗粒溶素导致表皮坏死。因此，预测药物不良反应发生风险的基因遗传学多态性研究已经成为药物遗传学的主要目标。基因多态性影响下的药物基因组学的发展，为癫痫个体患者抗癫痫药物治疗的药效学和不良反应提供了精准化的指导，但仍需经过临床前实验的大量研究才可进一步应于临床。 三、功能建模 将癫痫的遗传原因翻译成新的或更有针对性的治疗，取决于有效的模型系统。首先，其可阐明基因突变引发癫痫的发生机制，为药物研发提供新的方向。其次，个体突变的体外功能读出可以提供关于致病机制(例如功能获得与功能丧失机制)、预后以及在某些情况下治疗选择的重要信息[21]。理想的基因相关癫痫临床前模型的特征包括以下几点：①可高效表达人类中确定的遗传风险因素；②准确阐述人类疾病的发生机制和药物敏感性；③有足够的可扩展性以实现AEDs的高通量筛选。但目前已知的单个模型无法满足上述所有的标准，需要跨模型的综合方法。有三大类功能模型共同满足上述标准。 1．单细胞模型 这是最简单的模型，它是将标记的突变基因嵌入通常不表达该基因的细胞系中，从而检测标记的突变基因产物的表达效应。迄今为止，最常用的细胞类型是人胚肾293(human embryonic kidney293，HEK293)细胞系和zll谢H爪蟾卵母细胞。在细胞水平上，它们已经成功地应用到电压门控和配体门控的离子通道的研究中。在1一氨基丁酸(gamma aminobutyric acid，GABA)受体基因突变引发癫痫的研究中，详细地阐述了如何使用这些系统[22-23]；与原位神经元相比，虽然单细胞模型系统是人工的，但它们提供了揭示癫痫相关基因致病机制的有效方法。 2．网络模型 单细胞模型的主要缺陷是缺乏细胞网络及其彼此之间的交联效应。许多癫痫的遗传病因导致非细胞自主缺陷，其致病性后果仅在神经元网络的背景下显示是明显的。结合管理神经元网络活动的非侵人性方法的进步促进了大规模神经网元络评价，多孔、基于板的多电极阵列的发展允许每天筛选数百个神经元网络。且随着最近引入光学生理和光遗传学方法，可以检测小而快速的神经元电变化，并可以选择性地刺激神经元群。因此，神经元网络的应用是一个有前景的新的研究方向。研究遗传性癫痫的神经元网络细胞来自于以下途径，最简单地，通过直接从小鼠遗传模型收获神经元细胞来开发培养体外神经元网络，它允许比在体内更高通量的筛选。也可以使用癫痫个体的人类细胞直接开发培养神经元网络，先将这些细胞重编程成为诱导性多能干细胞(组)，然后将它们分化成合适的细胞(如：神经元细胞和神经胶质细胞)。另一种方法是使用第三代人工核酸内切酶基因定点编辑技术(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR／CRISPR—associated．CRISPR—Cas)CRISPR／CRISPR—Cas或其他编辑方法，在诱导多能干细胞的受控同基因系中引入突变，然后扩增到相关细胞类型中。但是这些方法存在方法学挑战，因为源自诱导多能干细胞的神经元不能完全重现为成熟神经元，但是进一步研究将允许开发更现实可用的体外模型。 3．全动物模型 许多生物均可为癫痫的基因研究提供可能性，包括啮齿动物，鱼类和其他无脊椎动物[24]，但小鼠是应用最成功和最广泛的。全动物模型提供了药物存在与否的情况下，癫痫发作活动的行为和电临床的相关性。可扩展性是全动物模型的体内筛选的关注点，低等生物虽具有较好的可扩展性，但其缺点是不能评估共存症状(包括抑郁症，焦虑，运动障碍，智力残疾和其他认知障碍)。小鼠的动物模型已经为癫痫的发病机制提供了大量的证据[25]，并且小鼠中特异性癫痫基因的发现通常预估了其后来在人类癫痫致病性中的发现。此外，针对低等动物疾病表型的有效治疗药物，在转移到人类临床试验之前，可能需要在小鼠或体外人类细胞模型中验证。因此，对遗传性癫痫小鼠模型的进一步研究是至关重要的。更重要的是，使用小鼠模型可以筛选对其他器官系统的不良影响。 四、遗传性癫痫精准治疗举例 遗传学确认与分子诊断可以明确癫痫诊断和评估癫痫再发风险。此外，还为癫痫的靶向治疗提供方向，并最终形成靶向治疗方案。当前的治疗方法主要通过调节离子通道和神经递质受体来直接降低神经元兴奋性来达到抗癫痫目的。然而，最近发现的一些调节突触囊泡转运、哺乳动物帕雷霉素靶向(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路、染色质复制和翻译的新通路，为癫痫治疗提供了新的方法[26]。但这不是一个简单的任务，因为癫痫遗传学的复杂性使不同癫痫基因的突变可能会引起相同的症状，或单基因(如，SCNIA)突变与一系列癫痫表型相关(如从热性惊厥到异位内分泌综合征)[27]。尽管如此，新近的一些发现提供了有关癫痫精准治疗的首个见解。瑞替加滨是电压门控钾离子通道(vohage activated potassium channels，Kv)Kv7.2—7.5(KCNQ2—5)离子通道的正向变构调节剂，因而成为了第一个治疗癫痫的神经元钾通道开启物[28]。体外实验表明瑞替加滨潜在的最大作用体现在2/3异侧KCNQ通道上，这些通道潜藏着一些癫痫疾病(如：从家族性新生儿癫痫发作到严重形式的早发性癫痫脑病)，尤其是最近的一些体外实验研究表明，瑞替加滨打开了Kv7钾通道并修复了癫痫突变基因KCNQ2离子通道的正常功能[29]。但遗憾的是，KCNQ2基因突变导致的癫痫患者，在应用此药后出现了皮肤和视网膜的蓝色变这种巨大的临床副作用，因而很难在临床中得到评估[30-31]。另一个精准医学在遗传性癫痫的例子是推定使用治疗谷氨酸受体2A基因(glutamate receptor gene 2A，GRIN2A)相关癫痫的美金刚[32](美国食品和药物管理局批准的N一甲基一d一天冬氨酸(N—methyl—D—aspartate，NMDA)受体拈抗剂)，它可显著减少由GRIN2A新生错义突变引起的早发性癫痫患者的痫性发作，但对另一批携带此基因不同突变的儿童无效，因其编码的蛋白质功能完全不同[31]。还有，老的抗心律失常药奎尼丁被用来恢复非洲爪蟾卯母细胞突变KCNTl钾通道的过度活跃，口服奎尼丁可以改善迁移性部分性癫痫局灶性发作儿童的癫痫活动以及精神运动，因为获得了KCNTl的蛋白产物的功能[34]。然而，奎尼丁在有严重夜间局灶性和二次癫痫发作的KCNTl基因突变患者应用上的失败表明，有遗传障碍的患者中应谨慎应用奎尼丁。 因此，尽管有这么多针对癫痫患者进行定制治疗的有趣实例(表2)，但疾病特异性治疗仍然只适用于少数遗传性癫痫，其未解决大多数剩余患者的潜在生物学机制。