鱼用口服疫苗免疫佐剂研究进展

南方农业学报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＳＯＵＴＨＥＲＮＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ

ＩＳＳＮ２０９５—１１９１；ＣＯＤＥＮＮＮＸＡＡＢｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｆｆｎｙｘｂ．ｃｏｎｌ

ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ：ｉｓｓｎ．２０９５－１１９１．２０１２．０６．８６９

鱼用口服疫苗免疫佐剂研究进展

黄钧－，施金谷·，一，陈明２，黄艳华１，温华成１，彭民毅１，王瑞２，梁万文２（１广西大学动物科学技术学院／广西水生动物疾病诊断实验室，南宁５３０００５；２广西水产研究所／广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，南宁５３００２１）

摘要：免疫佐剂是一种先于或与抗原同时使用，能够增强机体的非特异性免疫能力及相应抗原的免疫原性，但其本身不具备抗原特性的物质。文章对鱼用口服疫苗免疫佐剂的作用机理以及霍乱毒素（ＣＴ）、大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＪＴ）、细胞因子等几种主要鱼用口服疫苗免疫佐剂的应用情况进行综述，发现鱼用口服疫苗免疫佐剂的研究应用过程中仍存在作用机理研究相对滞后、忽略肠道黏膜免疫机理特殊性、使用成本过高、安全性等问题，建议今后加强对鱼类肠道黏膜免疫机理以及口服疫苗免疫佐剂作用机理的研究，优化口服疫苗免疫佐剂的免疫剂量和程序，降低生产成本，研发出更为广泛、廉价的口服疫苗免疫佐剂，提高其安全性等，以促进水产养殖业的健康发展。关键词：鱼用口服疫苗；免疫佐剂；霍乱毒素；大肠杆菌不耐热肠毒素；细胞因子；应用现状中图分类号：￥９４８文献标志码：Ａ文章编号：２０９５—１１９１（２０１２）０６—０８６９—０４…

Ａａｖａｎｃｅｉｎｏｒａｌｖａｃｃｌｎｅｌｍｍｕｎｅａｄｊｕｖａｎｔ１０ｒＩＩＳＩＩ

ＨＵＡＮＧＪｕｎｌ，ＳＨＩ

Ｊｉｎ—ｇｕｌ”，ＣＨＥＮＭｉｎ９２，ＨＵＡＮＧＹａｎ－ｈｕａｌ，ＷＥＮＨｕａ－ｃｈｅｎ９１，

ＰＥＮＧＭｉｎ—ｙｉｌ，ＷＡＮＧＲｕｉ２，ＬＩＡＮＧＷａｎ—ｗｅｎ２

（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＧｕａｎｇｘｉＡｑｕａｔｉｃＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＤｉａｇｎｏｓｅＬａｂ，Ｎａｎｎｉｎｇ

５３０００５，Ｃｈｉｎａ；２ＧｕａｎｇｘｉＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｉｓｈｅｒｉｅｓ／ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｑｕａｔｉｃＧｅｎｅｔｉｃＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄ

ＨｅａｌｔｈｙＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３００２１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｏｕｇｈａｄｊｕｖａｎｔｉｔｓｅｌｆｄｏｅｓｎｏｔｐｏｓｓｅｓｓａｎｔｉｇｅｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｗｈｅｎｉｔｉｓｕｓｅｄｂｅｆｏｒｅｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈａｎｔｉｇｅｎ，ｉｔｃａｎｆｏｒｔｉｆｙｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｉｔｙａｂｉｌｉｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｔｏｔｈｅａｎｔｉｇｅｎ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ

ｏｆｏｒａｌｖａｃｃｉｎｅｉｍｍｕｎｅ

ａｄｊｕｖａｎｔｆｏｒｆｉｓｈｅｓａｎｄｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆｍａｊｏｒａｄｊｕｖａｎｔｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎ（ＣＴ），ｈｅａｔ—ｌａｂｉｌｅ

ｅｎｔｅｒｏｔｏｘ—

ｉｎ（ＬＴ）ａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄｉｎｔｈｅｐａｐｅｒ．Ｓｅｖｅｒａｌｐｒｏｂｌｅｍｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｓｕｃｈａｓｌａｇｇｅｄｍｅｃｈａｎｉｓｍ

ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｉｇｎｏ—

ｒａｎｃｅｔｏｐａｒｔｉｃｕｌａｒｉｔｙｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｈｉｇｈｃｏｓｔ，ａｎｄｓａｆｅｔｙ，ｅｔｅ．Ｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｏｕｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ｏｆ

ａｑｕａ·

ｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｕｓｔｒｙ，ａｓｌｅｗｏｆｍｅａｓｕｒｅｓｓｈｏｕｌｄｂｅａｄｏｐｔｅｄｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｕｓｔａｉｎｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌ

ｉｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｏｒａｌｖａｃｃｉｎｅｉｍｍｕｎｅａｄｊｕｖａｎｔ，ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇｄｏｓｅａｎｄｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｏｒａｌｖａｃｃｉｎｅｉｍｍｕｎｅａｄｊｕ—ｖａｎｔ，ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｓｔ，ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｃｈｅａｐｅｒａｎｄｓａｆｅｒｏｒａｌｖａｃｃｉｎｅｉｍｍｕｎｅａｄｊｕｖａｎｔ，ＳＯｅｎｈａｎｃｉｎｇｉｔｓｓａｆｅｔｙｔｏｐｒｏｍｏｔｅｈｅａｌｔｈｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｕｓｔｒｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｏｒａｌｖａｃｃｉｎｅｆｏｒｆｉｓｈ；ａｄｊｕｖａｎｔ；ｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎ（ＣＴ）；ｈｅａｔ—ｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ（ＬＴ）；ｃｙｔｏｋｉｎｅ；ａｐｐｌｉｃａ—

ｔｉｏｎｓｔａｔｔｌｓ

０引言近几十年来，随着国内外学者对鱼类肠道免疫机理的研究不断深入，鱼用口服疫苗的研制取得长足发展，与之密切相关的鱼用口服疫苗免疫佐剂也越来越受到重视。免疫佐剂是一种先于或与抗原同时使用，能够增强机体的非特异性免疫能力及相应抗原的免疫原性，但其本身不具备抗原特性的物质。常见的免疫佐剂有铝盐佐剂、弗氏佐剂等，这些佐剂通常是作为注射型免疫佐剂，既能保护抗原，又能够增强机体

对抗原的吸收，增强免疫效果（Ｄｏｔｓｉｋａｅｔａ１．，１９９７；陈

明等，２０１０）。目前，人们已研制出多种口服疫苗免疫佐剂。Ｍｅｒｉｎｏ—Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ等（２００１）以大肠杆菌不耐热肠毒素Ｂ亚单位（ＣＴＢ）作为佐剂对斑带副鲈进行口服免疫，结果发现以ＣＴＢ作为佐剂组的抗体效价水平最高，其免疫保护率高达７０％，并能防止由维氏气单胞菌所引起的组织损伤。常青等（２００６）通过在饲料中添加壳聚糖投喂花鲈３０ｄ，其机体的补体活性、溶菌酶活性及吞噬活性显著增强。此外，脂质体、海藻酸钠、霍乱毒

收稿日期：２０１２—０３—２１基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻１１２３００６—４）作者简介：黄钧（１９５７一），副教授，主要从事水产动物健康养殖及病害防控技术的教学与研究工作，Ｅ—ｍａｉｈｈｊｌ３５１＠１６３．ｃｏｒｎ

万方数据·８７０·南方农业学报

素（ＣＴ）、细胞因子等均被动物试验证明其能够有效地引起免疫反应。１鱼类口服疫苗免疫佐剂作用机理免疫佐剂不仅可以改变免疫球蛋白的种类，还可以改变免疫反应强度、增强免疫应答、诱导机体产生特异性免疫、消除机体产生的免疫耐受、减少机体免疫副反应等（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２）。目前，关于鱼类口服疫苗免疫佐剂的研究主要集中在是否具备佐剂效应，而其机理研究尚处于推测阶段，有关免疫佐剂在机体内与免疫细胞、免疫分子问相互作用以及对于信号通路等均有待进一步探索。现有的免疫佐剂作用机理研究主要集中在人类和小鼠，这些研究成果对鱼类口服疫苗免疫佐剂研究具有重要的指导意义。一般来说，佐剂免疫机理包括４个方面：（１）起免疫调节作用，主要是对体内细胞因子进行反馈调节，通过细胞因子的升高或降低来介导免疫反应（Ｏ’Ｈａｇａｎｅｔａ１．，２００１），表现为由辅助性Ｔ细胞（Ｔｈ）中Ｔｈｌ细胞介导的细胞免疫、Ｔｈ２细胞介导的体液免疫。（２）起抗原呈递作用，口服疫苗免疫佐剂能够保持抗原构象的完整性，并增强抗原的呈递作用，使抗体能够更好识别抗原而产生免疫反应。如左旋咪唑能够抑制可溶性免疫抑制因子，降低其氧化率，从而增强抗原的呈递作用（Ａｌｌｉｓｏｎ，１９９８）。（３）起靶向性作用，如脂质体等经口服后，能释放抗原或被抗原呈递细胞（ＡＰＣ）吞噬后释放其包裹的抗原；海藻酸钠微囊等微球佐剂则能通过ＡＰＣｓ靶向巨噬细胞，促进抗原加工（Ｌａｎｇｅｒｅｔａ１．，１９９７）。（４）诱导ＣＤ８＋细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）应答，而具有储存功能（孙红祥和潘杭君，２００５）。２几种主要鱼用口服疫苗免疫佐剂２．１霍乱毒素（ＣＴ）ＣＴ是由霍乱弧菌产生的一种肠毒素，由一个Ａ亚单位和５个Ｂ亚单位连接形成的ＡＢ；结构。ＣＴＡ是一个毒性亚单位，除了具有与ＣＴＢ连接的功能外，还具有ＡＤＰ核糖基转移酶活性，能够通过活化Ｇ蛋白引起细胞内环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）浓度升高，从而导致腹泻。ＣＴＢ是无毒的受体结合亚单位，能够与细胞膜上的神经节苷脂受体结合，诱导细胞构型改变，将ＣＴＡ转移到细胞膜或胞浆内。ＣＴ和ＣＴＢ都是一种较强的免疫佐剂，但由于ＣＴ具有肠毒性，限制了其作为佐剂的可能性。ＣＴＢ与抗原同时免疫动物时，能够极大增强免疫动物对抗原的特异性免疫应答。同时，ＣＴＢ还是一种良好的弱免疫原和蛋白半抗原的载体，能够增加弱免疫原的免疫原性，使蛋白半抗原获得免疫原性。目前，关于ＣＴＢ的研究主要集中在小鼠。Ｄｅｒｚｂａｕｇｈ等（１９９０）经Ｅｌ服途径给小鼠免疫３００～６００ＩｘｇＣＴＢ和链球菌糖基化转移酶的融合蛋白后，检测其血清抗体水平，结果显示，该融合蛋白可诱导产生的抗体水平达２００～４００倍。Ｍｅｒｉｎｏ—Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ等（２００１）提取维氏气单胞菌的胞外凝集素（ＭＣＢＰ）后，以ＣＴＢ作为佐剂对斑带副鲈进行口服免疫，同时设计ＭＣＢＰ组和ＭＣＢＰ微囊组，结果表明，以ＣＴＢ作为佐剂组的抗体效价水平最高，其免疫保护率高达７０％，且能防止由维氏气单胞菌所引起的组织损伤。ｌｓａｋａ等（２００４）研究发现，将重组ｒＣＴＢ和牛血清蛋白（ＢＳＡ）混合后经口服途径免疫小鼠，能够在小鼠肠道产生中度水平的ＢＳＡ特异性ＩｇＡ应答，且能引起高水平的血清Ｉ赆应答；单纯服用ＢＳＡ组则无特异性免疫产生。２．２大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴ）ＬＴ是由大肠杆菌毒性株产生的一种肠毒素，与ＣＴ相似，也是由一个毒性Ａ亚单位和非毒性五聚体Ｂ亚单位以非共价键连接而成的ＡＢ，结构。ＬＴＡ具有ＡＤＰ核糖基化活性，能够使肠道上皮细胞合成ｃＡＭＰ并分泌大量的肠液和电解质，引起腹泻。由于ＬＴＡ具有毒性，因而限制了ＬＴＡ作为免疫佐剂的应用前景。ＬＴＢ能够识别细胞表面的单唾液酸四己糖（ＧＭｌ）神经节苷脂以及其他受体，而常被作为抗原载体，与抗原联合使用，加强机体对抗原的摄取，增加其免疫应答能力（陈明等，２０ＬＯ）。同时，Ｂ亚单位与ＧＭｌ结合是ＬＴ发挥免疫原性的基础。ＬＴ及ＬＴＢ在动物中的研究应用较常见。张茂林等（２００４）将狂犬病毒减毒疫苗与Ｉ肫合后，分别通过灌

胃、灌肠、口腔滴入的免疫途径对小鼠进行免疫，经检测免疫小鼠的ＩｇＧ、Ｉ蛆及免疫保护率等指标，发现肠道免疫组的免疫应答水平明显高于口腔滴人和灌胃接种的免疫水平。Ｃｏｍｐａｎｊｅｎ等（２００６）研制出ＬＴＢ和一种病毒肽融合蛋白转基因土豆，经肛门免疫途径免疫鲤鱼，结果发现，与对照组相比，试验组的血清效价显著提高，但由于试验动物过少，ＬＴＢ作为水产口服疫苗免疫佐剂仍有待进一步研究探讨。ｗａｎｇ等（２０１２）将狂犬病毒糖蛋白（ＲＶ—Ｇ）基因片段和ＬＴＢ基因片段融合后插入ｐＶＡＸｌ真核质粒，并将该重组真核表达质粒转染到减毒沙门氏菌中形成ｐＶＡＸｌ一Ｇ—ＬＴＢ重组株，用该重组株１３服途径免疫小鼠，狂犬病毒ＩｇＧ抗体检测结果显示，重组株诱导产生的ＩｇＧ抗体水平明显高于对照组；而动物保护性试验结果表明，重组株的保护率达５０％。可见，ＬＴＢ能有效诱导机体激发细胞免疫和体液免疫。２．３细胞因子细胞因子是一类可溶性的小分子蛋白质或多肽，能够作用于细胞膜表面受体，促使免疫细胞增殖分