第五节 蛋白质的通性、纯化和表征
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第3章 蛋白质的分离、纯化和表怔
选择变性：用加热、调节 或变性剂选 选择变性：用加热、调节pH或变性剂选 择性地变性杂蛋白。 择性地变性杂蛋白。如提取胰蛋白酶或细 胞色素C时 因其稳定性高，可用2.5％ 胞色素 时，因其稳定性高，可用 ％ 三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。 三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。
2.分级法 分级法 常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。 常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。 3.除盐和浓缩 除盐和浓缩 盐析后样品中含大量盐类，应透析除去。 盐析后样品中含大量盐类，应透析除去。 也可用分子筛， 也可用分子筛，如Saphadex G25层 层 析除盐。如样品过稀，可用反透析、 析除盐。如样品过稀，可用反透析、冻 超滤等方法浓缩。 干、超滤等方法浓缩。
（一）凝胶过滤法测定相对分子质量 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对 分子质量 （三）速度沉降法测定相对分子质量
第六节 蛋白质的含量测定 和纯度鉴定
一 蛋白质含量测定 测定蛋白质含量的常用方法有：凯氏定氮法、 测定蛋白质含量的常用方法有：凯氏定氮法、 双缩脲法、 双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、 －酚试剂法、紫外吸收法、 染料结合法（ 染料结合法（Bradford法）和胶体金测定 法 法等。 法等。
第3章 蛋白质的通性、纯化和 表征
第一节 蛋白质的酸碱性质
蛋白质是两性电解质，也有等电点， 蛋白质是两性电解质，也有等电点，即 等电点 所带净电荷为零的pH值 所带净电荷为零的 值。 多数蛋白等电点为中性偏酸， 左右。 多数蛋白等电点为中性偏酸，约5左右。 左右 偏酸的如胃蛋白酶，等电点为1左右 左右； 偏酸的如胃蛋白酶，等电点为 左右；偏碱 的如鱼精蛋白，约为12。 的如鱼精蛋白，约为 。 蛋白质在等电点时净电荷为零， 蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度 最小，易聚集沉淀。同时其粘度、渗透性、 最小，易聚集沉淀。同时其粘度、渗透性、 膨胀性以及导电能力均为最小。 膨胀性以及导电能力均为最小。
第7章蛋白质的分离、纯化和表征
In contrast, the larger molecules have only the liquid surrounding the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脱) first.
分子的大小和形状 酸碱性质 溶解度 吸附性质 对配体分子的特异生物学亲和力
Protein Purification and Characterization
The aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用: Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the protein of interest
Small/more negatively-charged proteins migrate further through the gel than larger/less negatively-charged proteins
7.3 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀
Protein colloid character and deposition
用来确定Mr。
7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量
蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时，如果 蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。
【资料】蛋白质的通性纯化和表征详解汇编共41页
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
END
【资料】蛋白质的通性纯化和表征详 解汇编
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
4蛋白质的分离纯化和表征
超过滤（ultrafiltration）
滤膜 抽气 离心 滤膜ensity gradient）
生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。
多肽链主链骨架中的若干肽段，通过氢键，形成有规则 的构象，这称为二级结构。
α-螺旋 β-折叠 无规线团
在二级结构的基础上，多肽链间通过氨基酸残基侧链的 相互作用而进行盘旋和折叠，因而产生的特定的三维空间结 构，这称为三级结构，也称为蛋白质的亚基。 各个亚基在低聚蛋白中的空间排布及相互作用，称为蛋 白质的四级结构。
（一）根据分子大小不同的纯化方法
• ◇ 1.透析和超滤 • ◇ 2.密度梯度离心 • ◇ 3.凝胶过滤
1.透析和超滤
透析是利用蛋白质等大分子 不能通过半透膜的性质，使蛋白 质和其它小分子物质如无机盐单 糖等分开。常用的半透膜： 半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒
玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane
3.有机溶剂分级分离
• （1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀
酮、乙酸乙酯等。 • （2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。 • （3）有分级分离现象 • （4）要求对有机溶剂低温预冷。
主要有乙醇、丙
4.温度对蛋白质溶解度的影响
• 在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状 蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，
滴加样品
离 心 管
蔗糖浓度
蔗糖密度梯度
蛋白质分离纯化和表征优秀课件
2)也与蛋白质分子形状、溶液的密度 和粘度有关。
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
蛋白质的分离、纯化和表征_百替生物
第七章蛋白质的分离、纯化和表征7.1本章主要内容1）蛋白质的酸碱性质2）蛋白质分子的大小和形状3）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀4）蛋白质分离纯化方法7.2教学目的和要求：通过本章学习，使学生掌握蛋白质的物理化学性质，在此基础上对现实生活中的现象给出合理的解释，同时为后续知识的学习打下基础。
7.3重点难点1.蛋白质分离纯化方法2.蛋白质物理化学性质及应用7.4教学方法与手段讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。
7.5授课内容一、蛋白质的酸碱性质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用。
在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。
天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。
1.等电点和等离子点（中性盐Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）等电点：以兼性离子形式存在的蛋白质的pH值。
在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。
等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。
2.蛋白质的电泳分离3.离子交换层析分离蛋白质二、蛋白质的大小与形状测分子量的方法：1.化学组成法2.凝胶过滤法3.SDS-PAGE法4.沉降分析法5.渗透压法三、胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越多，溶解度越大。
1.稳定蛋白质胶体溶液的主要因素（1）蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。
蛋白质的表征
目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有： ①聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)； ②毛细管电泳(CE)； ③等电聚焦(IEF)； ④高效液相色谱(HPLC)，包括凝胶过滤、各种反相色谱、 离子色谱、疏水色谱等； ⑤质谱(MS)。 一些新的有效方法也在引入分析蛋白质的纯度，如质谱 等。由于它测定分子质量的精确度可达万分之一，因此丢失 一个氨基酸残基(平均分子质量约110Da)就可以检出；如有 氨基酸的取代形成突变株(可能分子质量有几十道尔顿的差 异)，也非常容易被发现。
较新方法是用毛细管电泳(凝胶筛分或无胶筛分)测定蛋白质的分子质 量，仅需纳克量，而且还可用积分仪或电脑联机精确定量。同时此法对蛋 白质的分辨率和准确性优于SDS-PAGE方法。在某一批IL-3产品的分子质 量测定中，用SDS-PAGE得到均一的区带，但在毛细管筛分电泳中为两个 毗邻的峰。两个峰的分子质量也有约1 000Da的差异，教材作者进一步用 质谱验证了这一结果。 最新的方法是用质谱测定蛋白质的分子质量。20世纪80年代初期，质 谱用于测定分子质量的有快原子轰击质谱和等离子体解吸飞行时间质谱。 近年来，高分辨率的磁质谱可精确测定分子质量2 000Da以下的多肽。到 90年代，由于电喷雾质谱(ESl)有了长足的发展，可以用于测定分子质量 约5万Da的蛋白质，而且只需皮摩尔(pmol)量的蛋白质，且其精度可达 0.01％。而MALDI-TOF则可测定蛋白质分子质量高达二三十万道尔顿。
蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质的来源是多样 的，主要来自动物、植物的各种组织和微生物，取材要采用含量丰富的 器官。 抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎，破坏细胞，以便于抽提出蛋白 质；抽提液的选择也因蛋白质而异。一般用低浓度的缓冲液，有时在从 肌肉抽提时也用稀碱，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的pH却是中性 的。在提取膜蛋白或包含体内的蛋白质时，还加入(非离子型)表面活性 剂或变性剂以增加溶解度。各种细胞中普遍存在各种蛋白水解酶，会导 致蛋白质的降解，低温操作和加一些相应蛋白酶抑制剂(如DFP、 PCMB、PMSF等)、螯合剂(EDTA等)是有益的。 将蛋白质抽提出来后，就要进一步纯化。纯化不外乎两方面：一是将 大体积变成小体积；二是把多组分蛋白质只留下单一种的蛋白质。前者 有吸附法、超滤法、冻干等。后者有根据蛋白质的分子形状和分子质量 大小、电离性质、溶解度和疏水性、生物功能专一性等，常用有各种盐 析法、超离心沉降、结晶、电泳、凝胶过滤，离子交换色谱、亲和色谱 等。近年来发展的FPLC和HPLC大大促进了许多蛋白质在毫克级的纯 化，其量足够用于蛋白质的化学研究。
蛋白质的表征
按照严格的要求，用电泳法证明蛋白质的纯度， 在一种pH下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充 分的。应该取两种pH缓冲液，它们分布在蛋白质等 电点的两侧，在这两种pH下电泳都证明此蛋白质是 纯的，这样才可靠。 应该指出，只用一种方法鉴定蛋白质纯度是不够 的，至少应该用两种以上的方法，而且是两种不同 的分离机理的方法来判断蛋白质纯度才比较可靠。 因为常常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在 离子色谱中却分辨为两个组分，反之亦然。 又如，一种样品用凝胶过滤法和SDS—PAGE电 泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两种方法的 机制是相同的。
目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有： ①聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)； ②毛细管电泳(CE)； ③等电聚焦(IEF)； ④高效液相色谱(HPLC)，包括凝胶过滤、各种反相色谱、 离子色谱、疏水色谱等； ⑤质谱(MS)。 一些新的有效方法也在引入分析蛋白质的纯度，如质谱 等。由于它测定分子质量的精确度可达万分之一，因此丢失 一个氨基酸残基(平均分子质量约110Da)就可以检出；如有 氨基酸的取代形成突变株(可能分子质量有几十道尔顿的差 异)，也非常容易被发现。
第五节 蛋白质的分子质量测定
近年来由于解决了分离介质的刚性问题，有了HPLC的凝胶过滤系 统(例如Waters的1-60、1-125、1-250和Beckman或ToyoSoda的 TSK2000SW，3000SW， 4000SW)，这样测定分子质量只需1h即可。 但在一般实验室应用的常规方法是SDS-PAGEL，刊，原理是在 SDS存在条件下，蛋白 质表面都携带了大量负电荷，呈杆状分子，在此 情况下，不是根据蛋白质的电荷而是根据其分子形状和大小来进行分 离。用量为0.1～lµg，这种方法误差为5％一10％，但极为简便。 凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子质量，而SDS-PAGE是测定蛋 白质亚基的分子质量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子质量，可 以方便地判蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步，而对蛋白质定量方法 的原理、适用范围、灵敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是克氏定氮法， 因为每一种蛋白质都有其恒定的含氮量(14％～16％)。 其方法是将一定量的蛋白质用浓硫酸消化分解，使其中的氮变成铵 盐，再与浓NaOH作用，使氨气放出而被吸收于标准酸液中，用反滴定 法滴定残余的酸，或用硼酸吸收后，再用标准酸直接滴定，求得该蛋白质 样品中的含氮量。 此法虽有普遍性，但操作繁琐，目前应用较少。稍后应用较广泛的方法 是双缩脲法、福林—酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝 法。 选择哪一种方法，一般考虑的原则是准确、操作方便、影响因素少