HE染色的步骤及方法
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
HE染色步骤
1：取材固定，一定彻底！
2：60% 4小时、70%过夜、80%、90%、95% I各4小时、95% II过夜，100% I、II各1小时，二甲苯I 10分钟，II、III各5分钟，蜡I、II 各2小时；最后制成蜡块。
（AF液2小时、95% I乙醇过夜、95% II乙醇30分钟，100%乙醇 I、II各1小时，二甲苯I 、II各 20分钟，蜡I一小时、蜡II 2小时、蜡III一小时）
3：切片机，5 微米。
捞片、烤干24小时。
4：二甲苯梯度脱蜡，至自来水洗。
彻底！
5：苏木素染色5分钟；
6：自来水洗。
7：1%盐酸酒精分化，蘸两下即可。
8：自来水洗。
9：伊红染色1 分钟。
10：自来水洗。
11：碱水返蓝，蘸两下即可。
12：自来水洗。
13：酒精梯度脱水，至二甲苯。
树胶封片。
如果伊红染色太深的话，解决办法：先把带有二甲苯的片子放入100% II酒精5分钟，然后再把切片放入低浓度酒精中（70%）3—5分钟,依次脱水至二甲苯，重新封片。
HE染色步骤
HE染色液的配制：Harris苏木素：甲液苏木素0.9克100%酒精10 ml乙液铵（或钾）明矾20 克蒸馏水200ml然后加入氧化汞0.5克甲液加乙液加热煮沸后离开火焰缓缓加入氧化汞，玻棒搅拌，然后烧杯于冷水速冷，第二天过滤（夜），临用前加几滴醋酸（100ml加入0.25克）对核着色效果更好。
伊红1%：1g溶于10ml蒸馏水，溶解后逐滴加冰醋酸，边滴边搅拌，至糊状时，再加数毫升蒸馏水，继续逐滴加冰醋酸至沉淀不再增加时过滤，滤纸放入温箱（50-60）过夜，烘干物用100 毫升85%酒精溶解。
1.切片：将切片刀磨好，装到机上，将预定使用的刀部位移至蜡块下方，刀的倾斜角为30度，调整切片机厚度为6um，右手摇片扒，左手持一毛笔拖住蜡带，随切片机的转动轻轻把蜡带拉开，用毛笔拖住蜡带，挑断后顺序放在纸上。
（切片时，放入-20度冰箱中冻一下再切，效果比较好）2.摊片：41-42度，将预先切开的蜡片摊于水面上，使蜡片受热自然张开浮在水面上，也可用细针帮助张开皱褶，用经过APES处理过的载玻片伸入水中把蜡片移至玻片上，拨正位置。
注：2%APES前期处理载玻片的方法第一缸：4ml APES + 196 ml丙酮，配成2%的APES液，1.5-2 min第二缸：200ml丙酮（I）2min，震荡第三缸：200ml丙酮（II）2min，震荡第四缸：200ml蒸馏水（I）5min第五缸：200ml蒸馏水（II）5min自然风干，备用3.烘片：8h4.HE染色步骤二甲苯脱蜡(1)(2)5～10min(冬天10～20min)→100％酒精1 min→95％酒精1 min→85％酒精1 min→70％酒精1 min→50％酒精1 min→蒸馏水1–3 min(苏木精时水擦干)→苏木精染色1–2 min→自来水冲洗3–5 min(酚化分化3–5 min)→蒸馏水洗3–10min →70％酒精1–2 min→85％酒精2min→伊红20s→95％酒精→100％酒精(1)(2) 1～2min→二甲苯(1)(2)5～10min→封片。
组织he染色步骤
设备用具：切片机、恒温箱、溶蜡箱、玻璃缸、载玻片、盖玻片、手术刀片、镊子、包埋盒。
试剂：10％福尔马林、酒精、二甲苯、固体石蜡、苏木精、酸水、氨水、酒精伊红染色剂型、加拿大树胶（二）HE染色石蜡切片的制作过程步骤一：取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
步骤二：脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
步骤三：浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
步骤四：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。
切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
步骤五：脱蜡常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。
苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。
伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。
染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
步骤六：染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。
步骤七：脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
冰冻切片HE染色步骤
冰冻切片HE染色步骤1.组织包埋，使用OCT首先，需要用铝箔纸制作一个模子。
在模子里放入一些OCT，然后将96孔板放在液氮上。
接着，将放有OCT的模子放在96孔板上，以防止铝箔纸模接触到液氮。
等待OCT凝固后，取出模子，将修剪好的组织放在凝固的OCT上，再用OCT将组织包埋起来。
不要包埋太多，然后将其放回液氮中，等待OCT全部凝固后，放入-80°冰箱保存。
2.冰冻切片机上切片当需要切片时，取出切片，放入冰冻切片机中，使其恢复一段时间，大约30分钟到60分钟。
3.固定将切好的片子自然晾干，然后使用固定液A固定30秒至60秒。
接着，水冲洗30秒，再使用固定液B固定60秒。
固定液A的配制方法为：80%中性福尔马林+19%至95%乙醇+1%冰醋酸。
固定液B的配制方法为：75%无水乙醇+25%冰醋酸。
中性福尔马林的配制方法为：90%PBS+10%至40%甲醛。
4.取出已经切好及固定好的冰冻切片取出已经切好及固定好的冰冻切片，短期放入泡沫盒中，放少许水，制作成湿盒保存切片；长期放入-20度冰箱保存，以防止组织变形。
5.苏木素染色将切片放入苏木素中染色10分钟。
成熟苏木素的制作方法是，加入碘酸钠，即0.2克碘酸钠/L苏木素。
6.水冲洗用水冲洗切片。
7.1%盐酸乙醇5秒将切片放入1%盐酸乙醇中，重复5次，使得细胞核与细胞质分化。
1%盐酸乙醇的制作方法是，将1%的HCl加入99%无水乙醇中。
8.放入水中10分钟将切片放入水中10分钟。
9.放入XXX5分钟将切片放入XXX中染色5分钟。
10.使用乙醇洗涤最后，使用80%、95%、100%乙醇依次洗涤，每个2秒，将XXX洗掉。
冰冻切片HE染色步骤
冰冻切片HE染色步骤
一、前期准备
1.准备一台离心机，一台冰冻切片机，以及一些必要的试剂。
2.准备好HE染色的染料，染色的步骤如下：第一步请准备容器，将染料加入容器，每100毫升液体添加1克染料，加入稀盐酸调节PH值为7，然后加入清水到1000毫升。
3.根据患者的病史，准备相应的脓液或活检标本，准备切片培养基，涂片器，和贴片剂。
二、冰冻切片
1.将标本放入冰冻机，调节冰冻机到适合组织切片切割的温度，一般为-30℃。
2.将冷却后的标本放入冰冻机的金属梢，使标本在梢上稳定不动。
3.在梢上的标本上调整至合适的位置，并使用钳子轻轻捏住，能稳定的切割标本。
4.将梢放入冰冻机的切割室，将刀头拉扯，然后上下拉动，从而完成组织的切割。
5.完成切割后，将切片放入保存液中，放入冰箱冷藏，保存至HE染色时使用。
三、组织贴片
1.将预先制备好的培养基，及HE染料容器加入离心机，离心至合适的转速。
2.将冷藏好的切片取出，用湿润的布蘸取适量的贴片剂，在切片表面覆盖贴片剂。
3.在贴片后的组织标本上，会见涂片器，将涂片器中加入HE染料，以及按顺序均匀地涂抹在贴片后的组织标本上。
4.将涂抹好的组织标本放入。
HE染色
he染色目录1HE染色介绍2染色分类3染色结果4常规HE染色步骤1 4.1 试剂配置1 4.2 染色流程1HE染色介绍苏木精—伊红染色法( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。
苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
2染色分类易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性（neutrophilia)。
组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。
在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。
而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。
如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。
所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。
脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。
苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
伊红是细胞浆的良好染料。
由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。
经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。
HE染色操作流程
HE染⾊操作流程HE染⾊操作流程HE染⾊，即是苏⽊精-伊红染⾊法，是最常⽤的染⾊⽅法，在质量较佳的HE染⾊切⽚上，各种组织或细胞的⼀般形态结特点都可以观察到。
苏⽊精染液为碱性，主要使细胞核内的染⾊质与胞质内的核糖体着紫蓝⾊；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红⾊。
[试剂材料]1.试剂：%醇溶性伊红染液，改良的哈瑞（Harris）苏⽊素，%盐酸酒精溶液伊红：配制⽅法：中性红 0.5g，80%酒精100ml,将伊红溶于酒精内搅拌，全部溶解后即可使⽤。
苏⽊精：配制⽅法：A液：苏⽊素1g，⽆⽔酒精10mlB液：硫酸铝钾20g，蒸馏⽔200ml两液分别溶解后混合，加热煮沸后，慢慢加⼊红⾊氧化汞，此时有⼤量⽓泡产⽣，故容器要⼤，以防液体溢出，然后将染液迅速冷却，冷却后过滤，并每100ml加⼊冰醋酸6ml，⽢油10ml。
%盐酸酒精溶液配制⽅法：盐酸，70%酒精100ml2.材料：⽯蜡切⽚[操作流程]1.将⽯蜡切⽚置于烘箱中60℃烤1～2h；2.⽯蜡切⽚常规⼆甲苯，⼄醇脱蜡⾄⽔，3.苏⽊素染10分钟，4.流⽔冲洗，去余⾊，5.0.7%盐酸⼄醇分化数秒钟，6.流⽔冲洗，切⽚变蓝约15分钟，%⼄醇30秒钟，8.酒精性伊红染30秒，95%⼄醇30秒钟，95%⼄醇30秒钟，100%⼄醇30秒钟，%⼄醇30秒钟，13.⽯碳酸⼆甲苯30秒钟，（1： 4⽯碳酸1-⼆甲苯4）⼆甲苯30秒钟，⼆甲苯30秒钟，16.中性树胶封⽚。
[实验结果]：镜下观察细胞核呈蓝⾊；细胞浆⼀般呈红⾊；胶原纤维呈不同程度的红⾊，红细胞呈亮红⾊；粘蛋⽩呈浅蓝⾊；钙化组织呈深蓝⾊等。
[实验中所需试剂的⽣产商，货号及产地]：。
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HE染色的步骤及方法
HE染色（hematoxylin and eosin staining）是一种广泛应用于组织学研究与临床病理学中的常规染色方法，用于显示组织和细胞的形态结构、特征和组织的组织学构造。
HE染色的主要步骤包括固定、脱水、透明、浸染、洗涤、脱色、洗涤、著色、酸洗、洗涤和封片等。
下面将详细介绍每个步骤的具体方法。
1.固定：将待染的组织标本放入含有4%至10%的缓冲醛（如10%的中性缓冲醛）中固定。
固定的时间一般为24至48小时，具体时间根据组织的大小和种类而定。
2.脱水：在固定后，将组织标本转移到带有不同浓度的乙醇溶液中进行脱水。
脱水的目的是逐渐将水分从组织中溶解掉，以便更好地进行后续处理。
常用的乙醇浓度为70%、80%、95%、绝对乙醇和绝对乙醇。
3.透明：将脱水的组织标本转移到透明剂中，如苯酚、甘油等。
透明的目的是去除残留的乙醇，并将标本与石蜡相容，以便进行后续处理。
4.浸染：将透明的组织标本转移到硬化的石蜡中，通过加热使其温度达到融点，使组织与石蜡充分浸透。
通常情况下，标本需要浸染多次以确保充分浸透。
5.洗涤：将浸染好的组织放入清洁的容器中，用去离子水或缓冲液轻轻洗涤，以去除未浸透的石蜡。
6. 脱色：将洗净的组织标本放入xylene或但醇溶液中进行脱色，以去除标本中的石蜡。
脱色时间视标本的大小和种类而定，通常为30分钟至1小时。
7.再洗：将脱色的组织标本用去离子水或缓冲液轻轻洗涤，以去除残留的脱色剂。
8. 著色：将洗净的组织标本置于染色剂中进行著色。
HE染色中，常用的染色剂为血红和嗜酸性染料安伊汀（Eosin）。
组织标本一般需在血红染色剂中浸泡2至5分钟，然后脱水，再在安伊汀染色剂中浸泡2至5分钟。
也可根据需要调整具体的染色时间。
9.酸洗：将著色好的组织标本用弱酸性缓冲液进行酸洗，以去除过量的染色剂。
酸洗时间一般为几秒钟至几分钟。
10.再次洗涤：将经酸洗的组织标本用去离子水或缓冲液轻轻洗涤，以去除残留的酸洗液。
11.封片：将洗涤好的组织标本置于显微镜载玻片上，加盖玻片，并用合适的密封剂封住边缘，以保护组织标本并提高显微观察的清晰度。
HE染色步骤及方法的具体细节可能会因实验室、设备和个人的不同而有所变化。
上述步骤提供了一般性的指导，但在具体操作中，还应根据实际情况进行调整和微调。
对于一些特殊的标本和实验目的，也可能需要采取其他的特殊处理方法。