T_DNA转移研究进展

第5卷　第3期(专辑) 2001年11月

生命科学研究

Life Science Research

V ol.5　N o.3

(Suppl.)

N ov.2001 T2DNA转移研究进展Ξ

王自章1,张树珍2,李杨瑞3

(1.广西大学农学院,中国广西南宁　530005;　2.中国热带农业科学院生物技术国家重点实验室,

中国海南海口571101;　3.广西农业科学院,中国广西南宁　530007)

摘　要:植物遗传转化技术近年在农作物性状改良、植物生物反应器利用以及基因功能鉴定等方面得到了广泛的应用.T-DNA转移是植物细胞农杆菌介导遗传转化整合和表达外源基因的基础.农杆菌T i质粒vir基因编码蛋白、农杆菌一些染色体基因编码蛋白及植物细胞一些基因编码蛋白或因子均参与T2DNA转移.转移过程包括农杆菌对植物细胞的识别、附着,细菌对植物信号物质的感受,细菌vir基因的诱导表达,T复合体的形成,跨膜运输,进核运输和整合等一序列过程.植物细胞因子与农杆菌T2DNA转移相关蛋白的相互作用最近被认为在T2DNA转移过程中起重要作用.

关键词:T2DNA转移;农杆菌;宿主植物因子

中图分类号:Q789 文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2001)S0-0120-05

The Process of T2DNA T ransfer

WANG Z i2zhang1,ZHANG Shu2zhen2,LI Y ang2rui3

(1.College o f Agronomy,Guangxi Univer sity,Nanning530005,Guangxi,China;　2.National K ey Biotechnology Laboratory for

Tropical Crops,C AT AS,Haikou571101,Hainan,China;　3.Guangxi Academy o f Agricultural Sciences,Nanning530007, Guangxi,China)

Abstract:The role of proteins encoded by related genes determined in the T i plasmid virulence region(vir genes), in the bacterial chrom os ome,as well as in the plant chrom os ome in the process of T2DNA trans fer were introduced. The process includes recognition and attachment,sensing of plant signals,activation of vir genes,generation of T2 DNA com plex,T2DNA com plex export from the bacterial cell,im port into the host plant cell nucleus and integration into the host genome.

K ey w ords:T2DNA trans fer;Agrobacterium tumef aciens;host plant factors

(Life Science Research,2001,5(Suppl):120～124)

农杆菌(Agrobacterium tumef aciens)由于在感染植物时能将其T i(tum or inducing)质粒上的一段DNA(T2DNA)转移进入植物细胞核并整合到植物基因组中,随基因组进行遗传和表达,而被发展成为植物遗传转化的重要介导工具.T2DNA的转移需要细菌T i质粒上的T2DNA和毒性(vir)区编码蛋白参与,T2DNA没有序列特异性,可用任何DNA片段将其两个25bp边界序列之间的区段进行置换而不影响其转移;毒性区含有8个主要的基因座,即vir A、vir B、virC、virD、virE、virF、virG和virH等,每个基因座又分别含有1至多个基因,如virD含4个基因,分别命名为virD1、virD2、……

Ξ收稿日期:2001-02-26

作者简介:王自章(1965-),男,广西乐业人,博士,从事甘蔗农杆菌介导遗传转化研究,E2mail:wangziz@https://www.360docs.net/doc/f716595619.html,;张树珍(1965-),女,云南姚安人,中国热带农业科学院副研究员,博士,从事植物基因工程研究,T el:098926892944;李杨瑞(1957-),男,广西农业科学院院长,博士生导师.

virD4等,这些基因编码的蛋白是介导T2DNA转移的主要成分.除这些成分外,农杆菌染色体毒性(chv)基因,如chvA、chvB、chvC、chvD、chvE、exoC、cel、att等基因的编码蛋白也参与T2DNA的转移,此外,植物细胞的一些基因产物也与T2DNA转移有密切关系[1].T2DNA转移要求穿越细菌和植物的细胞壁、原生质膜和核膜.T2DNA转移过程可划分为如下几个步骤:1)农杆菌对植物细胞的识别和附着;2)农杆菌对植物信号物质的感受;3)农杆菌vir基因的活化;4)T2DNA复合体的产生;5)T2 DNA复合体从细菌细胞输出;6)T2DNA复合体输入植物细胞核;7)T2DNA整合到植物基因组中.

1　农杆菌染色体毒性基因编码蛋白与农杆菌对植物细胞的识别和附着

农杆菌感染植物细胞的第一步是识别和附着,然后产生纤维丝锚定在植物细胞表面[2].这一过程与细菌某些染色体组基因,如chvA、chvB、pscA、att等的表达蛋白有关.Chv B合成β21.2葡聚糖;ChvA是一内膜蛋白,与葡聚糖运输有关; ex oC(PscA)合成环葡聚糖和琥珀酰聚糖,β21.2葡聚糖在农杆菌粘附到植物细胞上是必需的[3], ChvE是一种周质糖结合蛋白,能加强vir基因的诱导和细菌趋化性[4].Cel合成纤维素细丝,Att则与农杆菌粘附到植物细胞表面有关[2].此外,植物细胞的一些蛋白和糖分子对细胞识别也有作用,类似于动物细胞病原菌受体的玻连蛋白,也可作为植物对农杆菌的细胞表面受体,最近通过T2 DNA标签鉴定到一些拟南芥突变株没有与农杆菌结合的能力[5].

2　VirA与对植物信号物质的感应

VirA是一种可感受信号分子的二聚跨膜传感蛋白,可分为跨膜域和周质域,跨越域可感受和传导信号,周质域则可检定单糖分子,通过与ChvE作用对低水平的酚类化合物作出响应[3].这些信号物质主要是受伤植物产生的酚类化合物,如乙酰丁香酮(AS)、木质素、黄酮化合物前体等[6],另外,酸性PH值、葡萄糖、半乳糖等也可诱导virA活化[3].信号分子最初与2个染色体编码蛋白P10和P21结合再传递给VirA.酚类化合物可直接被传递[7];但糖类则需经ChvE传导[3].ChvE 的高水平表达可扩大VirA对酚类的识别范围而使玉米被农杆菌感染[7].感受信号后VirA在C端特定的组氨酸进行自主磷酸化,该域含有蛋白激酶活性,由于磷酸组氨酸高能磷酸键的不稳定而传递给VirG的天冬氨酸残基上.因此,在信号传导过程中,VirA既作蛋白激酶也作为磷酸转移酶.

3　Vir G与vir基因的诱导

VirG是一种细胞质传导蛋白,具有磷酸化稳定性,磷酸化后可以作为vir基因表达的转录调控因子,具有与启动子结合的高亲和性,它通过特异性也与vir基因启动子中—12bp的保守序列结合而加强对与转录有关的其它蛋白的集聚,从而活化vir其它基因.与vir A一样,virG也是组成型表达,并具有自行活化表达功能,以产生足够的VirG而有效地活化vir其它基因[8].携带有组成型启动virG三元载体的农杆菌可提高其T2DNA 的植物转化效率和扩大其宿主范围[9].植物信号分子完成信号传递后,VirG诱导virH表达,VirH 具有对酚类物质的解毒功能,避免过多酚类对细胞的伤害[10].

4　VirD1、VirD2、VirE2与T复合体的形成

vir基因被诱导表达后即产生一条与编码链T2DNA区相同的单链DNA分子,即T链.T链与VirD2和VirE2缔合后形成T转移复合体.

T链的产生起始于T2DNA的左边界,由5′至3′方向合成,止于右边界.首先由一个DirD22VirD1复合体在超螺旋结构的T i质粒的T2DNA边界结合,使DNA松开,该复合体具有位点和链特异性内切酶特性,在反义T2DNA链边界的第3和第4碱基之间切成缺刻,然后VirD2共价结合到T链的5′端和反义链左边界缺刻露出的5′未端.T链移出后,由细菌DNA合成系统将反义链左右边界间的缺口修复,并由连在T i质粒5′端切口上的VirD2将切口连接起来,恢复成完整的T i质粒,T 链5′链上的VirD2将伴随它完成整个转移过程,起运输引导信号和防止外切酶降解作用.VirD1在完成T2DNA边界切割后即离开复合体[11].当VirD2和VirD1不足时,VirC1可协助加工形成T 链.

T链与VirD2结合形成未成熟的T复合体,该未成熟复合体可通过两种方式变成成熟T复合体:1)未成熟的T复合体和VirE2/VirE1复合物分

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别通过同一通道进入植物细胞的细胞质,VirE2从VirE1上脱下并结合到T链上,形成由VirD2、T链和VirE2构成的T复合体;2)在细菌细胞内VirE2即与T链结合以防止它重新退火,然后成熟的T 复合体才进入植物细胞[1].

一个22kb的T链可结合1176个VirE2分子,它们沿着长轴方向附着在T链表面,在电子显微镜下呈半刚性、中空、圆筒型、外径为12.6nm 的电话软线结构,即T链的5′端连着VirD2,表面覆盖VirE2[12].

至今人们还不了解T链和VirE2的结合是发生在细菌细胞内,还是在它们分别转移到植物细胞以后.根据它们之间有强的分子作用而又都在细菌细胞内形成,甚至通过共同的通道进入植物细胞,而且可被抗VirE2抗体共同沉淀的特点,而认为结合发生在感染的早期;可是,以没有致病力的含T链但VirE2缺失和含VirE2但T链缺失的两个农杆菌株共同转化烟草却能恢复其感染,说明VirE2和T链是彼此独立从细菌输出的,而且VirE1与VirE2结合后可阻止VirE2与ssDNA的结合,便于VirE2输入植物细胞,到植物细胞质后VirE1和VirE2分开,让VirE2与T链结合[13].

当用无毒性的VirE2突变体农杆菌接种具有VirE2表达的转基因植物,可恢复它的致瘤能力;而且经VirE2突变体农杆菌感染后植物细胞中没有T链积累,说明VirE2与T链在细菌细胞质中结合,防止它被核酸外切酶降解,在体外也观察到这种保护作用[14],因而支持VirE2和T链在进入植物核前就发生结合的观点.

5　VirB与T复合体跨膜运输

vir B操纵子编码11种蛋白质,它们属于整合膜蛋白或与膜相关联蛋白,这些蛋白构成T链跨膜运输的孔道和T菌毛.VirB1、VirB5,VirB6,VirB7, VirB8、VirB9和VirB10都含有大的周质域[15].T复合体的跨膜运输也按照细菌的Ⅳ型分泌系统[16],由VirD4基因和vir B操纵子编码的蛋白装备,构成一纤细的T菌毛和一跨膜易位转运复合体.在经毒性(Vir)诱导的农杆菌细胞表面可观察到T 菌毛,它由VirB2和VirB5组成.它的作用是与植物受体细胞感受连接,然后把信号传导给转运复合体而启动T复合体运输[15].

转运复合体由VirD4蛋白和各种VirB组成,VirB1被认为是用它的转糖基酶活性定位溶解细菌肽聚糖层,并在此位点的细菌包膜装备转运复合体,同时VirB1的N端信号肽介导将一个较小的VirB1分泌到细胞外面参与植物受体细胞建立联系[16].在复合体中VirB3和VirB4促进毒性菌毛装备,VirB3可穿跨细菌体膜,VirB4是具有ATP酶活性的转膜蛋白,偶联的ATP水解能促进T复合体转运[15].VirB6与转运体孔道形成有关.VirB7和VirB9则以VirB7/VirB7同源二聚体和VirB7/VirB9异源二聚体形式形成转运复合体的核心,可能是由VirB7的脂质部分锚定而定位于细菌外膜的. VirB8位于细菌周质表面的内膜,可能与运转装置有关.VirB10也是跨膜蛋白.VirD4在毒性菌毛的形成是必需的,由于VirD4是跨膜ATP酶,这可在T 链形成及引导T复合体进入转运复合体提供能量[15].在组成运输孔道的VirB蛋白中,VirB8和VirB10位于细菌内膜,而VirB7和VirB9复合体在外膜上,通过酵母双杂合试验发现,VirB8、VirB9、VirB10之间发生相互作用,而且VirB8和VirB9的相互作用对T2DNA转移是必须的[17].

装备好的毒性菌毛和转运复合体尚不能输出T复合体,还需要有与受体植物细胞的物理接触活化,否则通道是关闭的,而使T复合体在细菌内积累[16].外界条件也会影响到转运复合体的稳定性,VirB10在28℃时的稳定状态远低于19℃[18].

6　VirD2、VirE2与T复合体进核运输

由于在T复合体通过核孔进入核内时,核孔直径可扩大2.5倍,让T复合体通过,而认为进核是一个主动过程[12].VirD2在进核转移的功能主要是导向作用,它连在T链的5′端,而其分子的两个未端各有一个核定位信号(N LS),其中C端的N LS具有2个相邻的碱性氨基酸,一个长度可变的间隔区和一个碱性氨基酸聚簇区.它们在农杆菌感染时起核导向作用[19].但由于N LS缺失农杆菌突变体仅减少而不是阻断T2DNA的表达和致瘤,而认为VirE2也参与进核过程,而且在该突变体转化的植物细胞核内有VirE2的积累,经分析, VirE2中部的蛋白序列具有介导进核作用[19].进一步的VirE2及VirD2N LS双缺失突变体农杆菌不能感染野生型烟草,但可引起VirE2表达转基因植物致瘤[14].以VirE2及荧光素标志的ssDNA微注射可促进标记ssDNA在核积累,没有VirE2存

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在时标记ssDNA则仅在细胞质中分布[19].但由于VirD2连在T链的5′端,而VirE2却附在靠近T链的3′端,它们的核导向机制将是不同的.

7　宿主植物细胞蛋白与VirD2和VirE2的进核导向

由于VirD2和VirE2可能采用不同的进核导向机制,人们已发现一些与VirD2和VirE2分别发生作用的植物蛋白.一些属于肽基辅氨酸顺反异构酶亲环素家族的植物蛋白(DIP1)与VirD2发生作用[20],如拟南芥的R oc1、R oc4和CypA等.亲环蛋白属于一种伴侣蛋白,可能起维持ViD2构象的作用.该异构酶的抑制剂———环胞素也抑制CypA 与VirD2的结合,而阻止农杆菌介导拟南芥和烟草的转化.另外,未知功能的DIP2和DIP3也与VirD2结合.

蕃茄DIG3cDNA编码的一种细胞因子———2C 型丝苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)与VirD2的N LS区有强的相互作用;而拟南芥PP2C突变体可提高其对农杆菌的敏感性,PP2C过度表达的烟草原生质体抑制进核转化[1].

一种属于核脱辅酶素α(K ary opherinα)家族的拟南芥蛋白(AtK APα)也与VirD2发生作用[21],它可促进荧光标志的VirD2在经渗透处理的酵母细胞中积累.

最近,一种定位于拟南芥细胞膜的碱性拉链蛋白VIP1和VIP2特异性地与VirE2相互作用[1],在VIP1和经G FP标记的VirE2共同表达时可促进哺乳动物和酵母细胞中VirE2进入细胞核.由于VIP1能使VirE2获得进入非植物细胞的能力,而且在动物和酵母中找不到VIP1的同源蛋白,而认为VIP1即是VirE2进入植物细胞的特异因子. VIP2可能起识别并联接到植物染色质上,由于它不仅与VirE2互作,还跟VIP1互作,推测它们作为一复合体具有VirE2的核导向和引导VirE2/T链复合体到达整合位点的作用.

8　VirD2、VirE2及植物细胞因子与T2DNA 整合

T2DNA整合过程了解得不太清楚,由于T2 DNA不象转座子和逆转录病毒DNA转移元件一样,能自主编码转移和整合相关的酶,所以T2DNA 的整合必须有来自农杆菌(VirD2和VirE2)和植物细胞本身因子的参与.

VirD2C端的ω域可能与整合有关[22],在VirD2整合酶的基序中,如组—精—酪氨酸突变为精—甘氨酸后降低了体外整合的精确性,但不影响整合效率.VirD2还可能在植物DNA修复机制合成第二链后参与将T2DNA的5′端连接到植物基因组上.VirE2也可能参与整合过程,至少与T 链3′端的忠实整合有关.

植物细胞因子在整合过程中也起作用, Mys ore[23]等分离子一批抗农杆菌转化的拟南芥突变体(rat),其中rat5为H2A组蛋白基因突变体,具有遗传不稳定性而且没有转化T2NDA的瞬时表达,说明H2A与整合有关.不能完成整合是造成一些拟南芥生态型抗农杆菌感染的原因.不能有效地整合也被认为是单子叶植物抗农杆菌感染的原因[24].

9　展望

农杆菌介导已成为农作物遗传转化最广泛和最有效的方法,近年来人们对其机理进行了广泛的研究,取得了长足的进展,特别在vir基因编码蛋白的结构及功能、T2DNA的形成及转运等方面.但随着人们在进行单子叶植物农杆菌介导转化所遇到的困难,人们又开始探索宿主植物细胞内一些因子对T-DNA转移和整合的影响,这方面虽然刚刚起步,但将具有深远的意义,因为农杆菌对植物细胞表面的附着、T2DNA从细菌跨越植物细胞壁和细胞膜进入植物细胞、T复合体的进核运输和T2DNA与植物基因组的稳定整合等过程都是相关农杆菌蛋白与植物蛋白直接相互作用的过程.对于农杆菌基因编码蛋白的作用人们了解较为清楚,而对于植物基因编码的相关因子却知之甚少.随着人们对这些机理的深入了解,将极大地提高农杆菌介导法转化的效率,尤其是对单子叶植物的转化.

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