药用植物内生菌的分离和鉴定
雷公藤内生真菌的分离及活性菌株的筛选
Ｄ Ａ来证 明其 内生 菌 的存 在… 。它是 植 物 微 生 Ｎ 物 系统 中的天然 组 成成分 ， 进化 过程 中与植 物 在
康植物的各种组织和器官 内部的一类真菌 ， 被感
染 的 宿主植 物一 般不 表 现出外 在症 状 ， 可通 过组 织学 方法 或 从 经 严 格 表 面消 毒 的植 物组 织 中得
Ａ ｓ ａｔＴ ｅ ｅｕｓｉ ｉ ｔ ａ３ ｎｏｈ ｔ ｎｉｔ ｉ ｅｅｓｌｅ ｏ ｒ ｔ ｙｉｎｗｌ ｒｉＨ ｏ ｙ ｓ ｅ １－ ｂｔ ｃ：ｈ ｓｌ ｄ ａ ｄｔ ｔ ６ｅｄｐ ｙｃｕｇ ｓａ ｓ ｒ ｉ ａ ｄｆｍ Ｔｉ ｅ ｇｕ ｉｏｄｉ ｏｋｂ ｓ １ ｒ ｒ ｔ ｎｃｅ ｈ ｉｆ ｒ ｎ ｗ ｏ ｔ ｒ ｐｒ ｆ ｉ ｔ ｕ ８１ ＂
６ ６％。 ６． ７
关键词 ： 雷公 藤 ；内生真菌 ； 生物活性
中图分类 号 ：４３ Ｑ ３ ￥３ ；９５ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０ ４ ５４２ ｏ ）５ ３８ ５ １０ —１２ （０ ６ ｏ —００ 一ｏ
Ｔ ｅ ｓｌ ｏ ｄ ｐ ｙ ｃ ｎ ｉｒｍ ｒ ｔｙ ｉ ｉｏ ｉ Ｈ ｏ ｄｔｅ ｃｅｎ ｇ ｈ ｏ ｔ ｎｏ ｅ ｏ ｈ ｔ ｇ ｆ ｉ ａ ｉ ｆｎ ｉ ｏ Ｔｉ ｅ ｇ ｎｗｌ ｒ ｉ ｏｋａ ｒ ｉ ｐ ｒ ｕ ｆ ｄ ｎ ｈ ｓ ｅｎ
维普资讯
浙江农业 学报 Ａ ｔ Ａ ｒ ｕｔｒ ｈ ｉｎｅｓ ８５ ：０ ３２２ ０ ｃ ｇｉ ｌ ａ Ｚ ｅａｇ ｎｉ１（ ）３ ８ １．０ ６ ａ ｃ ｕ 活 性 菌 株 的 筛选
申屠旭萍 ， 陈宵峰 ， 晓平 俞
（ 中国计量学院 生命科学学 院， 浙江 杭州 ３０ １ ） １ ８ ０
摘
要： 以传统药用植物雷公藤为试验材料 ， 离筛选能产抑制作物病 原真 菌的活性物质 的 内生真 菌。通 过 分
9种药用植物内生或附生真菌的分离及其杀虫、抑菌活性
抑制 真菌活性 测定 ： 株发酵液 １ 与９ 融化 的 将菌 ｍＬ ｍＬ Ｐ Ａ培养 基混 匀 ， 入无 菌 的培养 皿 中制成带 药培 养基 平 Ｄ 倒 板 。待培 养 基凝 同后 ， 每个 培 养基 平 面上 放 １ 在 个供 试 菌
基平 板上 ， ４ ２ ２ ～ ６℃ 下避 光培 养”。 ’ 表 １ 内生 、 附生 真 菌 的分 离 结 果
植物样品
坐
内 菌 菌株 生真 ／
株 编 号
１ ． 菌株的纯化 ＿２ ２
尖 端 蔺 丝 挑 取 法 对 所 分 离 的 内生 、 生 真 菌 进 附 行 纯 化 。 定 期 观 察 其 生 长情 况 ． 新 长 的菌 丝 挑 取 将
本研究选用9种药用植物采用5种植物病原真菌5种病原细菌1种蚊幼虫进行系统的生物测定以期评价这些植物内生附生真菌的生物活性为筛选结构新颖的农药活性化合物和综合开发利用植物资源提供依据
第 ４ 卷第 ４ ８ 期
农 药
ＡＧＲ０ＣＨＥ＾ 缸ＣＡＬ Ｓ
Ｖ ． ８ ＮＯ ４ ｂ１ ４ ． ．
至
Ａｐ ． ０９ １ ２０
挑取 少量 蔺落接种 于培养 瓶 巾 ， 在转 速为 １ ０ ２ ０ｒ ｉ 的 ～ ０ ／ ｎ ８ ａ ｒ
摇床 上于 ２～ ８Ｇ培养 ７ １ ： ６ ２ （ ： ～ ２ｄ １ ． 发 酵产 物 处理 ＿４ ２ 发酵终止后 ， 滤 纸过滤发 酵产物 ， 液备用 。 用 滤
１２５ 生 物 活 性 测 定 ＿．
均 可 分 离 到 较 多 的 附生 真菌 或 内生 真 菌 ， 比例依 次为 其
附生 真菌 的分 离培养 ： 采 集 的新鲜 植物各 部分 组织 ２ ．４ ３ ．８ 、 ２６ ％ 、９５ ％（ 将 ３７ ％、 ４０ ％ ２ ．３ １ ．５ 见表 １ 。 ） 用 来 水 冲洗 ， 去表 面 附着 的泥 沙 ， 内晾 干后 直接 在 除 室 超 净 Ｔ作 台上 ｊ无 菌 刀片切 成小块 样品 ， ＝ ｝ ＿ Ｊ 紧贴于 分离 培养
一株具抗菌活性的恒山黄芪内生真菌的分离与鉴定
Ａｂ ｔａ ｔ ｓｒ ｃ ：Ｆｏｕ ｔ — ｉ ｔ ａ ｎ ｆｅ ｏ ｙｔｃ ｆ ｎｇ ｒ ｓ ｌ ｔ ｄ ｆ ｏｍ ｈｅ ｒ ｏｔ ｔ ｍ ｎｄ ｌａ ｒ ｙ ｎ ｎｅ ｓ ｒ ｉ ｓ ｏ ｎｄ ｐｈ ｉ ｕ ｉｗｅ ｅ ｉｏ ａ ｅ ｒ ｔ ｏ ，ｓ ｅ ａ ｅ ｆ ｏｆＡｓｒ ｔａｇａｌ ｅ ｒ ａｃ ｕｓ，ａ ｎｇ ｔ ｍ ｈ ｔ ａ ｎ ＡＲ０８ ｈ ｄ ｓ ｒ ｎｇ ｒａ ｉ ｃ ｏ ｉ ｌａ ｔｖ ｕｓｍ ｍｂ ａｎ ｅ ｍｏ ｈｅ ｔ ｅ ｓ ｒ ｉ ａ ｔ ｏ ｅ ｎｔｍｉｒ ｂ ａ ｃ ｉ —
物 具有 长期 的互 惠共存 共生 关系 ， 以这些 真菌代 所 谢 产 物类 型多样 ， 目前 内生 真菌 被认为 是筛选 新 型
抗生 素 的重 要 资源 ］ ．
中 国 药 典 规 定 药 用 黄 芪 （ ｔａ ａ ｕ ｍ— Ａｓｒｇ ｌ ｓｍｅ
＊ 收稿 日期 ： ０ ２０ — １ ２ １ －４ ２
ａ ｐ ｒ ｉｌ ｓ ｕ ｉ ａ ｕ ． Ｉ ａ ｔｏ ｇ ｒｓｓａ ｃ ｏ Ｇ ｂ ｃｅ ｉ ，Ｇ— ｂ ｃｅ ｉ ａ ｄ ｐ ａ ｔ ｓＡｓ ｅ ｇ ｌｕ ｍ ｔ ｓ ｔｈ ｄ ｓ ｒ ｎ ｅ ｉｔｎ ｅ ｔ ａ ｔｒａ ｆ ｇ ａ ｔ ． ａ ｈ ｅ ｉ ｕ ｉ
内生真 菌 （ｎ ｏ ｈ ｔ ｕ ｇ） 指 某 些特 殊 的 ｅ ｄ ｐ ｙ ｉ ｆ ｎ ｉ泛 ｃ 真菌 ， 它生 活史 的一定 阶段 或全部 阶段 寄生 于健康 植物 的组织 和器 官 内部 ， 被感染 的宿 主植 物不表 而
现 出外 在病 症口 ， ］ 可通 过组织 学方法 从经 过严格 表
菌均具有很 强 的抗性． 关 键 词 ： 芪 ；内 生 真 菌 ；生 物 活 性 ；分 类 鉴 定 黄 中 图 法 分 类 号 ： ８ ． Ｒ２ ２ ５ 文献标识 码 ： Ａ
贵州白苞蒿抗肿瘤、抗氧化内生真菌的筛选与鉴定
贵州白苞蒿抗肿瘤、抗氧化内生真菌的筛选与鉴定白苞蒿Artemisia lactiflora是一种重要的药用植物。
对已分离获得的54株白苞蒿内生真菌粗提物分别采用MTT法和DPPH法进行体外抗肿瘤和抗氧化活性筛选，并采用分子生物学方法对筛选出的活性内生真菌进行鉴定。
结果显示，共计10株（18.5%）白苞蒿内生真菌粗提物对人骨髓白血病细胞系（HL-60）、人乳腺癌细胞系（MCF-7）和人前列腺癌细胞系（PC-3）生长的抑制活性较好，其中以链格孢属GYBH47菌株粗提物的抗肿瘤活性最佳，对3种肿瘤细胞株的生长均有抑制作用；共计2株（3.7%）白苞蒿内生真菌粗提物的抗氧化活性较好，其中，拟茎点霉属GYBH42菌株粗提物同时具有抗氧化活性和细胞毒活性。
表明贵州白苞蒿内生真菌是寻找有价值的生物活性成分的潜在资源，其生物活性成分值得进一步研究和开发。
标签：白苞蒿；内生真菌；细胞毒活性；抗氧化活性；分子鉴定1 材料1.1 内生真菌贵州白苞蒿内生真菌54株，由本实验室分别自贵州省贵阳、毕节和威宁地区白苞蒿的根、茎和叶中分离获得，保存于贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心药用真菌实验室。
1.2 肿瘤细胞HL-60（人白血病细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）和COLO205（人结肠癌细胞）均购于南京凯基生物技术有限公司。
1.3 试剂试药阿霉素购于美国Sigma公司，DPPH自由基购于日本和光纯株式会社，Vit E购于中国食品药品检定研究院，真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、Master Mix、异丙醇和真菌 5.8S rDNA通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG），ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）均购于生工生物工程（上海）有限公司。
乙酸乙酯（EtOAc）、二甲基亚砜（DMSO）、乙醇等试剂购于贵州鼎国生物技术有限公司，均为分析纯。
1.4 培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基用于活化菌种；马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基用于培养种子液；查氏（Czapek′s）培养基用于菌株鉴定；肿瘤细胞株采用RPMI 1640培养，使用前加入10%胎牛血清。
红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选
红树植物内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍【摘要】本文对厦门集美红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala),海马齿(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)的多个部位进行内生真菌的分离和形态鉴定,并采用菌饼法对分离到的内生真菌进行抗菌活性筛选.结果显示,从3种红树植物的根、茎、叶中分离得到25株内生真菌,分别隶属8个类群,以链格孢属和曲霉属为主,分别占菌株总数的28.0％和24.0％;有19株菌株对至少一种指示菌有抑制作用,占菌株总数的76.0％.研究结果表明,红树植物来源的内生真菌数量多,种属丰富,同时具有良好的抗菌活性,是研究抗菌活性化合物的重要资源.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2013(022)003【总页数】4页(P263-266)【关键词】红树植物;内生真菌;分离鉴定;抗菌活性【作者】陈昭华;伍菱;杨秋明;王骥妍;朱敏佳;杜希萍【作者单位】集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;集美大学生物工程学院,福建厦门361021;福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建厦门361021;福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心,福建厦门361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q939内生真菌(endophyte)是指生活于健康植物组织内部、不引发植物产生明显病症的一类真菌。
不但对促进宿主植物的生长发育，增强抗逆性起到重要作用，而且许多内生真菌能产生与宿主相同或相似的生物活性物质［1-2］。
目前已从植物内生真菌中发现多种具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等活性代谢产物，在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值［3-6］。
野生兰科植物菌根内生真菌分离及鉴定
１ 材 料 和 方 法
１ １ 供 试 材 料 ．
２ ５种 野生 兰科 植 物为杭 州 师范 大学 生 命 与 环境 科 学 学 院 生 物化 学 与 分 子 生物 学 杭 州 市重 点 实 验 室
１ ４２ Ｐ ． ． ＣＲ 扩 增
利 用 通 用 引 物 Ｉ １（ Ｔ Ｃ ＡＧＧＴ ＴＳ ５＿ Ｃ ＧＴ ｒ ＧＡＡＣ Ｔ Ｇ ３）和 Ｉ Ｓ ５－ Ｃ Ｃ ＴＴ Ｃ ＧＴ － 扩增 内生 真 菌 ｒ ＮＡ Ｉ Ｓ区段 ． Ｄ Ｔ Ｐ Ｒ反应体 系为 ：０ ｘＴ ｑ Ｂ ｆ ｒ含 Ｍｇ。 ２ ５ Ｌ 模板 Ｄ ． Ｌ ｄ Ｐ ２ ５ｒ ｏ／ ） ． Ｌ Ｃ １ ×Ｅ ａ ｕｆ （ ｅ 。 ） ． 、 。 ＮＡ ２ ０ 、ＮＴ （ ． ｔ ｌＬ １ ５ｔ 、 ｅ ｏ ． ｔ
从平 板上 刮 取 约 ０ ．１ ｇ菌 丝 体 置 于 研 钵 中 ， 入 １ ｍＬ 裂 解 缓 冲 液 （ ０ 加 １ ０ ｍｍｏ／ ｉ ＨＣ 、 ｌＬ Ｔｒ － １ ｓ １ ０ｍｍｏ／ ＤＴ ４ ０ｍｍｏ／ ａ Ｉ ２， Ｓ ） ０ ｌＬ Ｅ Ａ、 ０ ｌＬ Ｎ Ｃ 和 Ｄｓ 与少 许 石英砂 ， 菌丝 充分 研磨 ． ９ ６ 将 液体 转移 至 １ ５ｍＬ ． 离心 管 ， 加 入 等 体 积 氯 仿 ／ 戊 醇 （ 积 比 为 ２ 并 异 体 ４：１ 抽 提． ） 高速 离 心后 取 上 清 液 ， 入 ２ Ｌ Ｒ ｓ 加 Ｎａｅ （ ０ｍｇ ｍＬ ，７℃水浴 保温 ３ ｉ． １ ／ ） ３ Ｏｒ ｎ 随后 ， ２倍 体积 无水 乙醇 沉淀 Ｄ ａ 用 ＮＡ， 用 ７ ％乙醇洗 涤 ２次 ， 并 Ｏ 自然 风 干后 溶 于适量 Ｔ Ｅ溶 液 ， 贮存 于 一２ Ｏ℃备 用． 取 ３肛 Ｌ ＤＮＡ样 品 用 ０ ８ 琼脂 糖凝 胶在 １ ． ×ＴＡＥ电泳 缓 冲液 中进 行 电泳 （ ０ ３ ｉ） 溴化 乙 １ ０Ｖ， ０ｒ ｎ ， ａ 啶 染色后 ， 紫外灯 下 观察拍 照 ．
药用植物金银花内生细菌的分离和特性研究_徐亚军
1.1 试验材料 供试金银花采自河南省商丘师范学院药用植物园地，
海拔 48 m。 采集生长旺盛、健康的金银花植 株的根、茎、 叶，装入无菌的密封袋带回实验室。
116
供试培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基[10]、LB 液体培养 基[10]、麦 芽 汁 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 [11]。
表 1 金银花植株不同部位内生细菌微生物计数结果
根 菌 落 平 均 数(个 /mL)
53.7 3 0 58 5.6 0
MPN(个/g) 1074
1160
茎 菌 落 平 均 数(个 /mL)
16 4.3 0 14.7 3 0
MPN(个/g) 320
294
叶 菌 落 平 均 数(个 /mL)
25 4.6 0 25.3 4 0
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：1004-874X （2013 ）03-0115-04
Isolation and characteristic of endophytic bacteria in medicinal plant Flos lonicerae
XU Ya-jun, ZHAO Long-fei, DAI Meng, RUAN Wen-jing, BAI Li-min, ZHANG Guang-yue, BU Ling-ling, ZHOU Pei-pei, ZHANG Man
(College of Life Science, Shangqiu Normal University/Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions of Henan University/Engineering Technology Research Center of Biomass Degradation and Gasification, University of Henan, Shangqiu 476000，China)
蛇足石杉内生菌的分离与鉴定
１ 材 料 与 方 法
１ １材料 与培 养基 ．
蛇 足石 杉 （ ｐ ｒ ｉ ｒａａ 采 自石 门县 壶瓶 山国家 自然保 护 区． 源体 来源 于蛇 足石 杉茎 尖培 养 组 Ｈｕ ｅｚａｓ ｒ ｔ ） ｅ 菌 织 中， 长 于外植 体切 口外 的菌 体． 生
＊
收 稿 日期 ：０ ０ ７ ２ ２ １ —０ —２ 基 金 项 目 ： 海 市农 业 生 物 基 因 中心 重 点 项 目 （ 上 沪农 基 ２ ０Ｏ ）湖 南 省 科 技 计 划 项 目（ ２ ０ Ｎ２ ３ ； 西 农 业 大 学 人 Ｏ９３ ； ￥ ０ ７ ２ ）江
成分［ ． ８ 目前 在各 种农 作物 及果 树等 经 济作物 中发现 的 内生细 菌 已超过 １ ９种 ， 别属 于 ５ ］ ２ 分 ４个属 ． 大多 数
植 物 内生 真菌属 于子 囊 菌类 （ ｃ ｍｙ ｅ） 其 无 性 型 ， 括核 菌 纲 （ ｙｅ ｏ ｅｅ 、 菌 纲 （ ｉｃｍｙ ｔｓ Ａｓｏ ｃｔ及 包 Ｐ ｒｎ ｍｙ ｔ） 盘 Ｄ ｓｏ ｅｅ ） 和腔菌 纲 （ ｏ ｕｏ ｓｏ ｅｅ 的许 多种 类 以及 它们 的一 些衍 生 菌 ． 过对 一 些 药用 植 物 的研 究 发 现某 些 Ｌ ｃ ｌａｃ ｍｙ ｔ） ］通 内生菌 可 以产生 与宿 主植 物相 同或 相 似 的药 用成 分 ， 为药 物生 产开 辟 了新途 径 ， 为人 类 解决 某 些药 用 植物 生 长缓慢 、 资源 紧缺 等 因素带来 的药 源 紧张 和生 态破坏 问题 提供 了新 的思路 ． 内生菌 的 多种 生物 学 功 能使
鉴 定． 过 马铃 薯 培 养 基 （ Ｄ 培 养 茵 体 ， 过 三 点接 种 、 区划 线 的 方 法 进 行 分 离纯 化 ， 用 显微 摄 影 的技 术 进 行 形 态 观 通 Ｐ Ａ） 通 分 利
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0.2%氯化汞溶液浸泡1min—无菌水冲洗
3-4次—无菌接种培养—纯化备用
白芷分离出的内生菌菌落形态
白芷内生菌根真菌菌落形态
白芷内生菌根细菌菌落形态
白芷内生菌叶真菌菌落形态
白芷内生菌叶真菌菌落形态
（2）白芷内生菌与三种病原菌对峙培养
用分离出的内生菌与串珠镰孢菌，禾谷镰刀
菌，玉米弯孢菌三种指示菌做对峙培养实验，初步 研究内生菌的抑菌作用。
在此谨向唐老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！
参考文献
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致谢
在论文写作过程中，得到了唐俊老师的耐心指导以及李树林
学长的帮助，从课题的选择到项目的最终完成，唐俊老师都 始终给予我细心的指导和不懈的支持，他治学严谨是我永远 学习的榜样，并将积极影响我今后的学习和工作。同时还要 感谢生命科学学院提供了先进的试验仪器及良好的试验条件， 感谢周围同学的热心帮助，这一切都是我最终完成这次实验 的重要保证。
2、药用植物内生菌的意义
（1）内生菌与植物互利共生 （2）内生菌医药价值
（3）内生菌农药价值
（4）内生菌食品防腐
二、材料与方法
1、材料
健康药用植物白芷根、叶采于安徽省药材之乡亳州。
培养基：马铃薯固体培养基（用以挑选内生真菌） 牛肉膏蛋白胨培养基（用以挑选内生细菌）
2、方法
（1）白芷内生菌分离纯化 无菌水冲洗—75%酒精浸泡1-3min—
主要内容
研究背景 材料与方法 结果与讨论
致谢
一、研究背景
1、植物内生菌
植物内生菌是指一类在其部分或者全部生活史 中存活于健康植物组织内部，不引发宿主植物表现 出明显感染症状的微生物，它包括内生真菌，内生 细菌，内生放线菌。目前已报道在各种农作物及经 济作物中发现的植物内生细菌已 超过129种，分属 于 54个属。
白芷内生菌与玉米弯孢菌的对峙实验
玉米弯孢菌单独培养的菌落形态
白芷内生菌与禾谷镰刀菌的对峙实验
禾谷镰刀菌单独培养的菌落形态
白芷内生菌与串珠镰孢菌对峙实验
串珠镰孢菌单独培养的菌落形态
三、结论与讨论
1、白芷内生菌抑制病原菌生长 2、白芷内生菌与病原菌相互抑制 3、消毒过程不够彻底或者过于彻底 4、抗菌活性化学成分有待鉴定