造血干细胞在外周血干细胞移植中检测的意义和方法 综述 陈明铸

造血干细胞在外周血干细胞移植中检测的意义和方法（综述） 造血干/祖细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)从20世纪40年末发展至今作为一种可以治疗造血系统的多种疾病的治疗方法，已经被广泛在临床上使用。其中外周血干细胞移植（PBSCT）在80年代被应用于临床后大有替代骨髓移植的倾向。外周血干细胞移植 （PBSC transplantation, PBSCT）的优势包括：（1）造血功能的快速恢复；（2）减少肿瘤细胞污染；（3）降低病人费用；（4）增加移植物中T细胞和NK细胞数量，产生移植物抗白血病效应(GvL),降低移植后复发；（5）避免麻醉和手术等。[1] 同时PBSC的产物更适于体外调控，如CD34+细胞的筛选、肿瘤细胞的清除和基因移植。PBSCT在近年来得到了迅速的发展。在国外已经成为血液病及部分实体肿瘤患者大剂量放射治疗或化学药物治疗后重建骨髓造血的常规治疗措施。 然而，在进行PBSCT时需要采用不同的动员方案，以将骨髓（BM）内造血干内造血干 / 祖细胞动员到外周血( PB) , 因为外周血采集物中造血干/ 祖细胞( PBSC) 的数量对移植的成功有着直接的影响 。所以PBSCT的关键因素为确定移植所需PBSC的小量及采集PBSC的最佳时机。目前主要有 4 种检测PBSC的方法 : ① 早期使用的集落培养法 , 其检测粒 - 巨噬细胞集落形成单位(CFU- GM ) , 但无法定量计数 PBSC , 并因方法的复杂性和不规范性 , 致使CFU- GM结果差异较大 , 只适用于标本的回顾性分析。② 全自动血细胞计数仪检测幼稚细胞( I M I+细胞) 、造血祖细胞( HPC) , 该方法经济、快捷、简便,但特异性较差,存在幼稚细胞干扰。因此,无法用于指导自体外周血干细胞移植。③FCM定量检测CD34+细胞。CD34是与HPC有关的膜表面分子,表达于不同分化阶段的HPC 表面 , 其性质为含磷的糖蛋白。 CD34+细胞实际上包括所有的HPC , 如CFU- GM , 红细胞暴发形成单位( CFU -E) , 巨核细胞集落形成单位( CFU- Mk) , 混合细胞集落形成单位( CFU - Mix) 和原始细胞集落形成单位( CFU- Blast ) 。 利用CD34 抗体 , 结合 FCM 检测CD34+细胞 , 快速 、 灵敏 、特异 , 已广泛应用 , 并成为分析HPC 的推荐参考方法。④分子生物学方法分析 CD34m RNA , 其特异、敏感、快速、准确,但实验条件、技术要求较高 ,目前临床开展较为困难。[2]

一、集落培养法检测粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM） 集落培养法是指对外周血中单个核细胞（PBMNC）进行体外培养，2周后观察CFU-GM数目，以间接反映PBSC数，CFU-GM可以反映特定系列祖细胞增殖能力。对PBSCT所需的CFU-GM数量有不同报道，即（15-50）×104CFU-GM/Kg体重。如此大量的造血祖细胞（HPC），可在病人经化疗，血象开始恢复后，每天2-5次，连续2-5d进行白细胞过滤而获得。尤其在化疗后给予人类重组粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF），病人外周血中可出现HPC的暴发增殖。此时，可利用集落培养法检测CFU-GM。检测时，通常以肝素抗凝血经离心或溶血去除红细胞，得白细胞富集液，或经白细胞过滤器得到PBMNC采集液，以（2-4）×104个细胞/ml一式3份移入含有各种营养成分和CSF的半固体培养基进行培养。经37℃、5%CO2、95%湿度条件下温育14d，用倒置显微镜观察CFU-GM（定义为≥50个细胞/集落），用CFU-GM百分数乘以标本中细胞总数即为外周血中的CFU-GM数。Siena等对未治疗的实体瘤病人外周血集落培养法进行重复性研究发现，含有50-150个集落的变异系统(CV)为1%-30%，而大于150个或小于50个集落的CV可超过30%。 尽管集落培养法开展最早，不可直观计数，但其无法定量计数 PBSC。而且，由于方法的复杂性和不规范性，包括使用许多生物试剂，主观性地判断结果（如利用显微镜计数CFU-GM）以及缺乏标准化操作规程等，致使不同实验室得到的CFU-GM结果差异很大，故其只能作为骨髓功能恢复所需细胞数的大致估计。此外，集落培养法主要检测的是分化较为成熟的祖细胞，即粒-巨噬细胞系，而对更为接近PBCS的细胞，如长期培养起始细胞（LTC-IC）和延长LTC-IC（ELTC-IC）则无法分析。尽管目前采用体外培养法能对上述两类细胞进行检测，但其为半定量，方法复杂，耗时长（至少需5周），无法指导临床采集暴发增殖的PBSC。因此，集落培养法只适用于标本的回顾性分析。

二、血细胞计数仪检测幼稚细胞HPC 细胞计数仪（如Sysmex公司的SE-9500，XE-2100，XE-5000等）利用幼稚细胞（immature myeloid information, IMI）通道，检测外周血中的幼稚细胞（即IMI+细胞）及HPC，最近年来发展起来的一门新技术。很多研究表明血细胞分析仪检测HPC具有较好的重复性 且与FCM检测骨髓动员后HPC具有较好的相关性。[3] 以Sysmex XE-5000 为例， Sysmex XE-5000作为Sysmex公司X系列全自动五分类血液分析仪最新和最高端的产品，除了采用传统的电阻抗法和射频电阻抗法还运用半导体激光及流式细胞技术。并且根据不同细胞的不同性质设有DIFF通道，WBC/BASO通道 ，NRBC通道，IMI通道，RBC/PLT-I通道，RET/PLT-O通道，HGB通道 可以快速准确的对血液中各种细胞进行测定。其中在IMI通道中，XE-5000利用成熟粒细胞膜表面含较高量的脂质及较低量的蛋白质而幼稚粒细胞膜表面则相反的原理。溶解红细胞、血小板、成熟白细胞、淋巴系幼稚细胞并使粒系的幼稚细胞保持原状。检测时在IMI通道中加入含聚乙二醇次乙基团和含硫氨基酸的表面活性剂以破坏细胞膜，导致成熟粒细胞膜破坏而幼稚粒细胞膜部分受损，从而使聚乙二醇次乙基团和硫化氨基酸进入细胞与细胞膜和细胞内容物结合。（见图一）不同的幼稚粒细胞对试剂的作用有所不同，利用直流电法测量细胞的大小，而射频则透入细胞内测量细胞核的大小及核与胞浆的密度。从而实现根据不同阶段的幼稚细胞的体积、核的大小、核浆比的不同，区分幼稚细胞使其分布在坐标系的不同位置目的。在以射频信号为纵轴，直流电信号为横轴的IMI散射图上不同的细胞占据的位置不同, 越幼稚粒细胞其核密度越低因而越接近横轴。Takahisa等的研究证实最接近于横轴的细胞团中以CD34+细胞为主，故该仪器将这一细胞团中的细胞数设置为参数造血干/祖细胞（HPC）。[4] 但是，值得注意的是由于使用IMI通道所检出的HPC是一类细胞膜具有多量多量磷脂成分 、 细胞内容物较少 、体积较小的细胞。有学者指出HPC与CD34+细胞检测的是不同的前体细胞群。所以这种方法与FCM检测被标记的CD34+细胞从而反应外周血干细胞数量是两种不同的思路。有报道称外周血中的幼稚细胞对HPC的检测有干扰，因此HPC的检测不适用于自体外周血干细胞移植时的检测。但在没有幼稚白血病细胞存在时，如同种异体外周血干细胞移植（Allo-PBSCT），选择正常人作供体，此时分析HPC意义较大，可对采集HPC的最佳时机提供较佳而且简便的方法。[5][6] 图一 三、流式细胞术（flowcytometry , FCM）检测CD34+细胞 因为外周血与骨髓中HPC表达同样的CD34抗原(CD34+)，所以外周血干细胞的检测可采用抗体标记CD34+细胞并检测其数量。为评估骨髓动员效果 , 判断最佳采集时机 , 用流式 细胞术进行CD 34+造血干细胞绝对计数已成为造血干细胞移植的常规检查之一 。流式细胞术（flowcytometry , FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。[7] CD34是 80 年代中期 发现的一种细胞表面分子, 此分子在 BM 和 PB 未成熟的造血细胞及所有具有造血潜能的集落形成细胞上表达 , 包括多能和定向造血祖细胞。CD34+细胞实际上包括所有的HPC，如CFU-GM，红细胞暴发形成单位(BFU-E),巨核细胞形成单位（CFU-Mk）,混合细胞集落形成单位（CFU-Mix）和原始细胞集落形成单位（CFU-Blast）。后两种HPC明显具有许多干细胞的特征，如它们可以自我更新，也可定向分化为一定数目的造血细胞系。体内试验也发现，经过致死剂量照射的狒狒移植足够数量的自体CD34+细胞，可以完全恢复其造血功能，同样的现象也可在经过骨髓、摧毁性治疗的病人中出现。CD 34+细胞在正常BM 单个核细胞中约占 1 %- 4 %。 多数实验表明 FCM 测定CD 34+细胞数量与CHU 实验具有良好的正相关。由于CD34+细胞在BM、 脐带血, 或是在动员后的PB中,含量均很低 , 因而造成测定结果的重复性和准确性均很差。准确计数 CD34+细胞的数量,可判定动员方案是否成功，何时开始采集及何时终止采集PBSC ,并可用于比较多个移植中心的疗效。目前流式细胞仪计数CD34+细胞是检测造血干细胞数量的参考方法。 以目前较为流行的ProCOUNT法为例进行说明。ProCOUNT计数 CD34+细胞是根据干/祖细胞特性而加以识别，用核酸染料（nucleic acid dye，NAD）、CD34 PE和CD45 PreCP三种试剂染色，在NAD/SSC散点图中设定造血干/祖细胞门R1，（高核酸含量，侧向散射光SSC弱）在CD45 PreCP/SSC散点图中设定造血干/祖细胞门R2（CD45表达较低，SSC小）在NAD/CD34PE散点图中再设定造血干/祖细胞门R3（核酸含量高、CD34高表达）和荧光微球（Beads）门R4，最后结果再根据TruCOUNT管内含定量的荧光微球（Beads）作为内参结合R1+R2+R3中的造血干细胞/祖细胞数量和标本用量，即可换算成每微升标本中造血干细胞的绝对数量。[4] 该技术具有一下几个方面的优势。首先,采用核酸染料/CD34PE/CD45PerCP三色分析。实验使用核酸染料设定阈值,不受散射光、抗体荧光等参数影响,这样就保证了所有CD34+造血干细胞(包括CD45dim/-的细胞)都包括在分析数据中。ProCOUNT试剂盒采用Ⅲ类CD34单克隆抗体(抗-HPCA-2),藻红蛋白(PE)标记,使之具有最大信噪比;对于经蛋白酶处理的浓缩样本,亦能保证造血干细胞鉴定的可靠性。第二,与双平台方法相比较,ProCOUNT方法为单平台方法,只使用流式细胞仪进行绝对计数,标本处理为溶血免洗法,从而不会导致细胞丢失,使结果更加准确,易于标准化,室间结果也具有较好的可比性。同时,单平台方法也避免了在造血干细胞计数过程中应该报告占白细胞的百分比,还是应该报告CD34+细胞占有核细胞的百分比的争议[12],直接报告每微升血中造血干细胞的绝对数量。第三,在ProCOUNT法中采用了TruCOUNT绝对计数管(即预先加有已知准确数量的标准荧光微球)做定量分析,从而避免了血细胞计数可能带来的误差,这种TruCONT方法采用的是每微升样本中已知数量的参照微粒,使细胞的绝对计数与流式细胞仪上获取的细胞量无关,故结果更加可靠。 虽然，FCM测定CD34+细胞是检测HPC数量的参考方法，但FCM法需特殊仪器，操作技术要求高，价格昂贵，结果的重复性欠佳，促使人们追求更经济、快捷、简便的方法。[8]