高效液相色谱法介绍
hplc检测方法
hplc检测方法HPLC检测方法高效液相色谱(HPLC)是一种广泛应用于化学、制药、食品、环境等领域的分析技术。
HPLC检测方法能够对样品中的化合物进行定量和定性分析，具有灵敏度高、分离效果好、选择性强等优点。
下面将介绍HPLC检测方法的原理、步骤、注意事项等方面的内容。
一、原理HPLC检测方法的原理是利用不同化合物的物理化学性质，如分子量、极性、亲水性、亲油性等，在高压力下通过固定在柱子中的固定相进行分离。
样品成分通过柱子后，会在检测器中产生信号，根据不同成分的信号大小进行定量分析。
二、步骤HPLC检测方法的步骤主要包括：样品制备、柱子选择、流动相配置、样品进样、分离、检测等。
1. 样品制备：样品制备是HPLC检测方法的第一步。
样品制备的目的是将复杂的样品进行简化，使其易于分离和检测。
常用的样品制备方法包括提取、纯化、水解、酸解等。
2. 柱子选择：柱子是HPLC检测方法中最重要的部分之一。
柱子的选择应根据不同样品的性质和分离要求进行选择。
常见的柱子类型有反相柱、离子交换柱、凝胶柱等。
3. 流动相配置：流动相是HPLC检测方法中的另一个重要组成部分。
流动相的选择应根据不同样品的性质和柱子类型进行选择。
常用的流动相包括水、有机溶剂、缓冲液等。
4. 样品进样：样品进样是HPLC检测方法中的关键步骤之一。
样品进入柱子前必须经过进样器。
进样器的选择应根据不同样品的性质和进样量进行选择。
5. 分离：分离是HPLC检测方法中最核心的部分之一。
分离的目的是将样品中的成分分离出来。
分离过程中，样品成分会根据不同的化学性质在柱子中进行分离。
6. 检测：检测是HPLC检测方法中的最后一步。
检测器会对柱子中流过的各个成分进行检测，根据不同成分的信号大小进行定量分析。
三、注意事项在进行HPLC检测方法时，需要注意以下几点：1. 样品应尽可能纯净，避免杂质的干扰。
2. 流动相的选择应准确，避免对柱子产生损害。
3. 进样量应适当，过多或过少都会影响检测结果。
硝基苯的测定方法
硝基苯的测定方法硝基苯是一种芳香族化合物，常用于制备化学品和药物。
由于其具有较强的毒性，人们需要对其含量进行监测和测定。
下面将介绍几种硝基苯的测定方法。
1. 高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是一种常用的硝基苯测定方法。
该方法利用液相色谱仪对硝基苯进行分离和定量。
首先，将样品中的硝基苯提取出来，然后通过注射进入液相色谱仪进行分离。
在分离过程中，使用特定的色谱柱和流动相，可以获得硝基苯的峰值。
通过测量峰面积或峰高，可以计算出硝基苯的含量。
2. 气相色谱法（GC）气相色谱法也是一种常用的硝基苯测定方法。
该方法利用气相色谱仪对硝基苯进行分离和定量。
首先，将样品中的硝基苯提取出来，然后通过注射进入气相色谱仪进行分离。
在分离过程中，使用特定的色谱柱和气相流动相，可以获得硝基苯的峰值。
通过测量峰面积或峰高，可以计算出硝基苯的含量。
3. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是一种常用的硝基苯测定方法。
该方法利用硝基苯在紫外或可见光区域的吸收特性进行测定。
首先，将样品中的硝基苯提取出来，然后将其溶解在适当的溶剂中。
接下来，使用紫外-可见分光光度计在特定波长范围内测量样品的吸光度。
通过校准曲线或标准品，可以计算出硝基苯的含量。
4. 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）气相色谱-质谱联用法是一种灵敏度较高的硝基苯测定方法。
该方法结合了气相色谱和质谱技术，可以对硝基苯进行分离和定量，并且可以通过质谱图谱的特征峰来确认硝基苯的存在。
首先，将样品中的硝基苯提取出来，然后通过注射进入气相色谱-质谱联用仪器进行分离和检测。
通过质谱图谱的特征峰来识别和定量硝基苯。
综上所述，高效液相色谱法、气相色谱法、紫外-可见分光光度法和气相色谱-质谱联用法是常用的硝基苯测定方法。
根据实际需求和设备条件，选择适合的方法进行测定可以准确地确定硝基苯的含量。
高效液相色谱法操作步骤
高效液相色谱法操作步骤
高效液相色谱法的操作步骤如下:
1. 过滤流动相并根据需要选择不同的滤膜。
溶剂必须为色谱纯，且溶剂及样品必须过膜（0.45μm）。
超声脱气30分钟以上。
2. 用流动相冲洗金属过滤器，然后将过滤器浸入储液罐的流动相中。
有一段时间没用或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
3. 将储液罐放置在一定的高度，以避免由于搬运和其他操作人员的移动而造成不必要的跌落。
4. 然后按以下顺序依次启动高效液相色谱仪：泵→检测器→高效液相色谱软件→设置软件参数，如分析时间、检测波长、流速等。
5. 启动泵，运行5分钟，主要是为了排除系统中的气泡，结束后关闭所有排气阀。
6. 然后按照预先计划的速度，以固定的速率，如1mL/min左右，运行流动相，走基线，直到基线平稳。
7. 基线平稳后，在软件中设置样品的运行参数，如流速和分析时间等。
分析时间会因样品、流速、柱长等因素变化。
8. 设计走样方法。
9. 在进样和进样后操作的过程中，需要及时调整和监控各项参数。
高效液相色谱法的简介..
3．操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
二. 高效液相色谱法的特点和应用
“三高” “一快” “一广” 高压 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
三.各类高效液相色谱法
液-固吸附色谱 液-液分配色谱
3.1 液-固吸附色谱法
固定相为固体吸附剂,流动相为液体。
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂
分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异，即物质吸附作用的不同来分离的。
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性
3.2 液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相 ：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。正相 与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失较多，较少采 用；
离子交换色谱
离子色谱
排阻色谱
亲和色谱
高效液相色谱固定相和流动相 （－）固定相
1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两 大类：
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受 7.O×108 ～ 1.O×109Pa 的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官 能团，就是键合固定相。 硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基 交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
hplc原理
hplc原理HPLC原理。
高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和分析化合物的重要技术，它在许多领域中得到了广泛的应用，包括医药、化工、环境监测等。
HPLC的原理是基于溶液在固定填料上的吸附、分配、离子交换和排阻等作用，通过不同化合物在填料上的分配系数差异实现其分离。
本文将对HPLC的原理进行详细介绍。
首先，HPLC的工作原理是基于溶液在填料上的吸附分离。
填料是HPLC柱中的固定相，它的选择直接影响到分离效果。
当样品溶液经过填料时，不同化合物会因为其与填料的相互作用力不同而在填料上停留的时间不同，从而实现分离。
这种吸附分离的原理是HPLC分离的基础。
其次，HPLC的原理还涉及到溶液在填料上的分配。
当溶液中的化合物与填料发生相互作用时，会在填料和溶液之间达到动态平衡，不同化合物在填料和溶液之间的分配系数不同，因此会在填料上停留的时间也不同，从而实现分离。
另外，HPLC的原理还包括离子交换作用。
在某些特定的情况下，填料会带有电荷，溶液中的离子化合物会与填料发生离子交换作用，从而实现分离。
最后，HPLC的原理还涉及到排阻作用。
在某些情况下，填料的孔隙大小会对分离产生影响，较大分子无法进入填料的孔隙，从而实现分离。
综上所述，HPLC的原理是基于溶液在填料上的吸附、分配、离子交换和排阻等作用，通过这些作用的差异实现化合物的分离。
因此，HPLC技术在分析化学中得到了广泛的应用，为化合物的分离和分析提供了重要的手段。
总的来说，HPLC的原理是非常复杂的，但通过对填料和溶液之间相互作用的研究，我们可以更好地理解HPLC分离的机理，从而更好地应用HPLC技术进行化合物的分离和分析。
希望本文的介绍能够帮助读者更好地理解HPLC的原理，为实际应用提供参考。
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用(最新整理)
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。
用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。
高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。
与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10µm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。
目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。
下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。
一、分类高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：（一）吸附色谱法（adsorptionchromatography）以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。
使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。
在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。
组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。
流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。
（二）液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。
目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。
键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。
按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。
高效液相色谱法
第十五章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC 15.1概述高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquid Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquid Chromatography），是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。
由于其适用范围广，分离速度快，灵敏度高，色谱柱可以反复使用，样品用量少，还可以收集被分离的组分，特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高，高效液相色谱技术得到飞速发展。
高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同，但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。
经过数十年的发展，高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面，都达到了很高的程度，可以和气相色谱法相媲美，并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。
至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。
15.1.1与经典液相色谱法比较经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒，装填在大口径长色谱柱（玻璃）管内，流动相是靠重力作用流经色谱柱的，溶质在固定相的传质速度缓慢，柱入口压力低，分析时间长，因此柱效低，分离能力差，难以解决复杂混合物的分离分析；而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效可比前者高2~3个数量级，从而在短时间内获得高柱效和高分离能力，可以分离上百个组分。
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
含量测定的方法
含量测定的方法含量测定的方法是化学分析中非常基础和重要的一个环节。
它可以用来确定某种物质在另一种物质中所含的量，例如测定药物中的活性成分含量、食品中的营养成分含量等。
下面将介绍几种常见的含量测定方法。
一、滴定法滴定法是一种定量分析方法，也称“容量分析法”。
它基于化学试剂与待测物质发生滴定反应，根据滴定液与待测物质摩尔比例关系，最终确定待测物质的含量。
滴定法广泛用于测定溶液中酸、碱、氧化剂、还原剂等物质的含量。
滴定法的优点是简单易行、快速可靠，但对于样品质量、环境条件等有一定要求。
二、重量法重量法也是一种基础的定量分析方法，它是根据待测物质的质量来确定其含量。
重量法广泛用于测定固体、液体和气体中的物质含量。
在实验中，首先要准确称量待测物质，并通过一系列化学反应后得到反应产物的质量。
最终，通过计算可以得到原物质的含量。
三、分光光度法分光光度法是一种常用的光谱分析方法，它基于物质分子对特定波长的吸收能力不同的特性，来确定待测物质的含量。
分光光度法适用于测定含有色物质和无色物质的溶液中的物质含量。
在实验中，先用一定浓度的标准溶液制备标准曲线，然后用以待测溶液对应的波长对标准曲线进行测定，得出待测溶液中物质的含量。
四、高效液相色谱法高效液相色谱法是一种基于物质在液相中的分离和分析原理的实验方法。
该方法广泛应用于药物、食品、化妆品和环境等领域。
在实验中，先将待测样品进样系统中，然后用高效液相色谱进行分离和检测。
高效液相色谱法的优点是灵敏度高、分离效果好、分析速度快等。
五、电化学法电化学法是一种利用电极反应来确定物质含量的分析方法，主要有电位滴定法、极谱法、恒电流伏安法等。
电化学法适用于测定金属、无机离子、有机分子等物质的含量。
在实验中，先通过电位、电流、电荷等测量值来推算样品的含量。
总体而言，不同的含量测定方法适用于不同类型的待测样品和测量目的。
在选择测定方法时，需要结合具体实验要求和条件来选取最适合的测定方法，对于保证实验数据的准确性和可靠性非常重要。
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按流动相和固定相的相对极性分:
正相色谱(Normal Phase Chromatography) 固定相的极性大于流动相 反相色谱(Reversed Phase Chromatography) 固定相的极性小于流动相
按分离过程的机理分:
吸附色谱(Absorption
Chromatography) Chromatography)
名词术语及基本参数
色谱峰(Peak): 色谱柱流出组分通过检测器 时产生的响应信号 色谱峰高h：峰顶点至峰底的垂直距离 色谱峰面积S：峰与基线所围的面积 色谱峰底宽W ：由色谱峰的两边拐点做切 线，与峰底相交两点间的距离 半高峰宽W h/2 ：色谱峰高一半处的峰宽
名词术语及基本参数
1<k’<10
分离度方程: 选择因子项
分离度与α的关系
分离度方程: 柱效项
分离度与N的关系
不对称度与拖尾因子
速率理论
1956年，Van Deemter提出，样品峰在色谱柱内的展宽原因
A 项 + B 项 + C 项
H a ( dp )
A项 B项 C项
b µ
c ( dp ) 2 µ
色谱动力学
------研究物质在色谱过程中运动的科学
解释色谱流出曲线的形状，探求影响色谱区带（样品 带）扩张的原因，为高效能色谱柱系统提供理论上的 指导以及为色谱分析奠定理论基础。
名词术语及基本参数
名词术语及基本参数
色谱峰(Peak): 色谱柱流出组分通过检测器时产 生的响应信号 色谱峰高h：峰顶点至峰底的垂直距离 色谱峰面积S：峰与基线所围的面积 色谱峰底宽W ：由色谱峰的两边拐点做切线，与 峰底相交两点间的距离 半高峰宽W h/2 ：色谱峰高一半处的峰宽
F
问题：粒径太小会 带来什么新的问 题？
涡流扩散（多通道效应）
起始
填充床
最后
A = 2dp dp 粒径, 填充因子
纵向扩散项 （分子扩散项）
B= 2rDM
扩散系数与温度成正比，与分 子量平方根成反比，与流动相 粘度成反比。
纵向扩散 示意图
F 柱内谱带形状 S L 相应的响应信号
性质 气体 液体
扩散系数 (cm2s-1) 10-1 10-5
密度 (gcm-2) 10-3 1
粘度 （gcm-1s-1） 10-4 10-2
雷诺准数 10 100
传质阻力项
包括：固定相传质阻力项，移动流动相传质阻力项， 滞留流动相传质阻力项
传质阻力
Van Deemter 曲线与塔板数和流速的关系
最佳线速度与流速
毛细管电色谱(Capillary
Electrochromatography)
毛细管液相色谱和毛细管电泳的结合。以填充柱为分离介质、用电压与高压泵 双重驱动力来进行分离，它集毛细管液相色谱和毛细管电泳的优势于一身。
色谱仪的结构和流程
色谱柱 高压泵 检测器 色谱工作站
进样器
色谱理论基础
色谱理论研究色谱过程中分子运动的规律，探讨 微观分子运动与色谱分离的内在联系。它包括三个 基本理论问题：
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专业提供的产品与技术服务主要如下： 1、环糊精类手性柱及其填料（SCDP、MCDP、SDMP、MDMP等）； 2、多糖衍生物类手性柱及其填料（OD、OJ、AD、AS、IC、IB、IA等） 3、蛋白质类手性柱（BSA、HSA等）及特种专用柱（氯吡格雷专用柱等） 4、常规色谱柱及其填料（C18、C8、氰基、氨基、苯基、二醇基、纯硅胶 等）； 5、手性化合物定制合成、手性分离提纯、手性对照品制备等； 6、天然产物制备提纯、杂质制备、绝对构型认定等； 7、LC、HPLC色谱制备提纯服务，SFC、SMB公斤级制备提纯服务； 8、仪器租赁。
什么样的高压输液泵才是优良的呢？
• • • • •
恒流：准确度与精密度 耐高压 时间流速程序 系统死体积小 惰性表面
并联式双柱塞泵
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双柱塞往复泵结构
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高效液相色谱法
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在广州有2000多平方米的实验室，3000多万 的实验设备，主要产品是手性色谱柱、常规 色谱柱及其相关的填料，专业提供分析测试 、制备纯化、方法开发等相关的技术合作服 务
亲和色谱(Affinity
体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography) GPC(Gel Permeation Chromatography)
凝胶渗透色谱:固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂
GFC(Gel Filtration Chromatography) 凝胶过滤色谱:固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液
分离度方程式
分离度方程式描述了分离度与选择因子,柱效和容量因子
之间的关系； 它是评价一张色谱图以及如何解决、开发和优化分离 方法的依据。
1 1 R N 4 1
柱效
选择因子
容量因子
分离度方程: 容量因子项
分离度与k的关系
色谱分离基本原理
基于混合物中各组分在不同的两相中相互作用 （溶解,分配,吸附等）存在差异，使得它们在 色谱柱中停留时间不同而完成分离。
两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary
Phase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂
液相色谱法的分类
璃管,再加入石油醚淋洗,结果色素中各组份互相分离形成 各种不同颜色的谱带
Tswett用希腊语chroma和graphe描述他的实验方法，
即现在的Chromatography(色谱法)
色谱法创始人－Tswett
色谱方法发展历史
1903年，色谱方法提出 1906年，正式命名 1944年，纸色谱 1949年，薄层色谱 50-60年代，GC发展时期 1956年， Van Deemter，速率理论 70年代，HPLC为代表的现代色谱 1975年，离子色谱出现 80年代，SFC （超临界流体色谱）发展 82年，毛细管电泳，毛细管电色谱出现 90年代，毛细管电色谱仪商品化 2004年，UPLC商品化
根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离. 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同
分配色谱(Partition
离子交换色谱(Ion
Exchange Chromatography) Chromatography )
依据离子型化合物中各离子组份同离子交换剂上带电荷基团进行可逆 离子交换能力的差别而实现分离。 依据生物分子与基体上键连的配位体间存在的特异性亲和作用能力的 差别，实现对具有生物活性的生物分子的分离。
涡流扩散/粒子间通道. 取决于颗粒大小. 分子的轴向扩散. 反比于流速. 传质阻力. 正比于流速和颗粒度的平方.
多路径效应（multipath effect）或涡流效应（eddy
diffusion）
在填充柱中，填料之间的间 隙，即是流动相的通道。填料 的粒径、形状以及填充柱紧密 程度的不均匀性，都会产生多 路径效应。这可以用相同的溶 质分子在流经柱床内不同通道 时所走的途径的长短来解释， 也可以理解为携带溶质的流动 相与填料颗粒碰撞时产生的涡 流效应所带来的影响。
HPLC 仪器原理
HPLC的基本流程
HPLC仪器基本组成
流动相储存和输送设备 进样系统 柱系统 检测器 数据采集处理系统
1. 溶剂输送---高压输液泵
功能：高压输液泵是液相色谱分离过程的动力装 置，它将流动相连续不断地送进柱系统，使样品 在色谱柱中完成分离过程。 主要部件：柱塞杆、单向阀、密封圈
(1)色谱过程热力学——高选择性色谱分离 的理论基础； ⑵ 色谱过程动力学——高效色谱分离的理 论基础； ⑶ 色谱分离条件的选择——多元混合物分 离的优化理论。
色谱过程热力学
---色谱保留作用 ● 分布平衡 ● 分配系数与柱温的关系 ● 分配系数与保留体积的关系 ● 分布等温线和等温线方程 ● 容量因子和分离因子
单向阀
柱塞杆
密封圈
梯度洗脱
梯度洗脱：在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连 续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度 相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。 梯度洗脱分类： 一类是外梯度（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合后（使用 比例阀），用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按 电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。几元梯度 及需要几台泵。
容量因子(k ): 保留能力的量度
溶质在固定相的量 ns k 溶质在流动相的量 nm
固定相、流动相性质 与温度有关 与色谱柱床结构有关
选择因子( )
理论塔板数---柱效
理论塔板数（柱效）是衡量色谱柱分离效率 高低的指标。
分 离 度
分离度：等于相邻组分色谱峰保留值之差与色谱峰平均峰底之比。 分离度R等于1时两个色谱峰得到基本分离；R等于1.5时，两峰得到 完全（基线）分离。在定量分析中，要对色谱峰进行积分时，最少 要达到R为1，如果达到R>1.5，保证积分中基本没有误差。