第八章 非线性色谱
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《仪器分析》第八章 液相色谱分析
Si O + SO l2 H C Si Cl
Si Cl
+ R H N 2
Si N R H
热和化学稳定性比酯型好。 热和化学稳定性比酯型好。
Si C l
+ R M X g
Si R
从理论上讲，这种结构具有更好的稳定性， 从理论上讲 ， 这种结构具有更好的稳定性 ， 特别是对于微碱性流动相， 而且R基可以多 特别是对于微碱性流动相 ， 而且 基可以多 次氯化，形成聚烷基键合相， 但是制备困难。 次氯化 ， 形成聚烷基键合相 ， 但是制备困难 。
柱体为直型不锈钢管，内径1～ 柱体为直型不锈钢管，内径 ～6 mm， ， 柱长5～ 柱长 ～40 cm。发展趋势是减小填料 。发展趋势是减小填料 粒度和柱径以提高柱效。 粒度和柱径以提高柱效。 以提高柱效
(7)检测器 检测器
♥ 紫外检测器
70％应用，氘灯，适用于梯度淋洗 对流动相速度变化不敏感 溶剂选择时紫外检测器波长不能小于溶剂的紫外截至波 长；
(5)进样器 进样器
♥ 高压进样阀－用微量注射器将样品注入样品环管（10µL到 2mL）
(6)色谱柱 色谱柱
♥ 色谱系统的心脏 ♥ 优质不锈钢管，内壁光洁平滑 ♥ 接头死体积尽可能小 ♥ 为了保护色谱柱不被污染，有时候需要在分析柱前加一根 短柱，称为卫柱。为了防止由于卫柱而过分增加压力，在 卫柱中使用的颗粒大小约10－30 µm。
3. Si-O-Si-C键型（硅胶和有机硅烷的反应）
R Si O + R SiX H 3 Si O Si R R
目前用得最多的类型。 目前用得最多的类型 。 具有良好的热合 化学稳定性， 能够在pH2~8.5的介质中 化学稳定性 ， 能够在 的介质中 使用。 使用。
Si Cl
+ R H N 2
Si N R H
热和化学稳定性比酯型好。 热和化学稳定性比酯型好。
Si C l
+ R M X g
Si R
从理论上讲，这种结构具有更好的稳定性， 从理论上讲 ， 这种结构具有更好的稳定性 ， 特别是对于微碱性流动相， 而且R基可以多 特别是对于微碱性流动相 ， 而且 基可以多 次氯化，形成聚烷基键合相， 但是制备困难。 次氯化 ， 形成聚烷基键合相 ， 但是制备困难 。
柱体为直型不锈钢管，内径1～ 柱体为直型不锈钢管，内径 ～6 mm， ， 柱长5～ 柱长 ～40 cm。发展趋势是减小填料 。发展趋势是减小填料 粒度和柱径以提高柱效。 粒度和柱径以提高柱效。 以提高柱效
(7)检测器 检测器
♥ 紫外检测器
70％应用，氘灯，适用于梯度淋洗 对流动相速度变化不敏感 溶剂选择时紫外检测器波长不能小于溶剂的紫外截至波 长；
(5)进样器 进样器
♥ 高压进样阀－用微量注射器将样品注入样品环管（10µL到 2mL）
(6)色谱柱 色谱柱
♥ 色谱系统的心脏 ♥ 优质不锈钢管，内壁光洁平滑 ♥ 接头死体积尽可能小 ♥ 为了保护色谱柱不被污染，有时候需要在分析柱前加一根 短柱，称为卫柱。为了防止由于卫柱而过分增加压力，在 卫柱中使用的颗粒大小约10－30 µm。
3. Si-O-Si-C键型（硅胶和有机硅烷的反应）
R Si O + R SiX H 3 Si O Si R R
目前用得最多的类型。 目前用得最多的类型 。 具有良好的热合 化学稳定性， 能够在pH2~8.5的介质中 化学稳定性 ， 能够在 的介质中 使用。 使用。
8 色谱分离技术
a. 死时间(t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大 值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质 不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速 。
柱长 L u 死时间 t 0
b. 保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包
括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的 时间。
色谱峰数——样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
1、对色谱柱分离效果的评价 四种典型情况
① 分离效果差，柱效低，选择性（）
低
② 完全分离，柱效高，峰窄，选择 性（）低 ；
P175表8-1
（二）流动相
推动固定相上待分离的物
质朝着一个方向移动的液 体、气体或超临界流体。 柱色谱中称为洗脱剂，薄 层色谱中称为展开剂。
正相色谱 是指固定相的极性高于流动相的极性。非极性分子或 极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中 流出来。 反相色谱 是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种色谱过 程中，极性大的分子比极性小的分子移动速度快而先 从柱中流出。 分离纯化极性大的分子，采用正相色谱；分离纯化极 性小的有机分子，采用反相色谱。
组分在固定相中的质量 p k 组分在流动相中的质量 q K p / VS V 组分在固定相中的浓度 c S k M k 组分在流动相中浓度 cM q / VM VS
式中VM和VS分别为柱中流动相和固定相的体积，为体积比。
（1）分配系数是组分在两相间分配达到平衡时的浓 度之比，分配比则是组分在两相间的分配总量之比。 （2）分配系数决定于组分和两相的性质，与两相体 积无关。分配比不仅决定于组分和两相的性质，且与两 相体积比有关。 （ 3）对于一给定的色谱体系，组分的分离最终决定 于组分在每相中的相对量，而不是相对浓度，因此分配 比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数。
8色谱分析法共35页
2.利用文献保留值定性
在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据， 可用来进行定性鉴定。
(二) 色谱定量方法
在一定条件下，待测组分的质量与其在检测器的响应 信号(色谱峰面积)成正比：
即：mi = fi ·Ai ——色谱法定量的依据
A = 1.064 h·W1/2 fi ——校正因子
常用定量方法
➢ 在化学惰性的固体微粒(用来支撑固定液的，称为载体) 表面，涂上一层高沸点有机化合物的液膜（固定液）
➢ 各组分的分离是基于各组分在固定相中吸附能力的不同 ➢ 反复的溶解、挥发过程
★载体：硅藻土 ★固定液的选择原则：
(1)非极性试样，用非极性固定液； (2)极性试样，使用极性固定液； (3)极性与非极性的混合物，一般选用极性固定液； (4)能形成氢键的试样，选用极性或形成氢键的固定液； (5)复杂的多组分混合试样,常用两种或两种以上的混合固定液
(c) 若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：
ci%
Ai AS
常数
基线：没有试样进入检 测器时，记录仪记录的是 一条直线，这条直线称为 基线
色谱峰：每一个被分离的组分对应一个色谱峰。色谱峰对称、 均匀分布，峰面积与组分量成正比
峰高h：色谱峰顶到基线的垂直距离
峰宽W：峰两侧拐点处所做切线与峰底相交两点间的距离。峰 高一半处的峰宽叫半峰宽（W ½h）
死时间t0：从进样到空 气峰所对应的时间，实际 上是流动相流经色谱柱所 需要的时间
峰高一半处的峰宽叫高一半处的峰宽叫半峰宽保留时间保留时间ttrr从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间历的时间称为此组分的保留时间称为此组分的保留时间调整保留时间调整保留时间t扣除死时间后的保留时间扣除死时间后的保留时间tt00标准偏差标准偏差ss06070607倍峰高处的一半倍峰高处的一半死时间死时间tt00气峰所对应的时间实际气峰所对应的时间实际上是流动相流经色谱柱所上是流动相流经色谱柱所需要的时间需要的时间色谱流出曲线的意义
在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据， 可用来进行定性鉴定。
(二) 色谱定量方法
在一定条件下，待测组分的质量与其在检测器的响应 信号(色谱峰面积)成正比：
即：mi = fi ·Ai ——色谱法定量的依据
A = 1.064 h·W1/2 fi ——校正因子
常用定量方法
➢ 在化学惰性的固体微粒(用来支撑固定液的，称为载体) 表面，涂上一层高沸点有机化合物的液膜（固定液）
➢ 各组分的分离是基于各组分在固定相中吸附能力的不同 ➢ 反复的溶解、挥发过程
★载体：硅藻土 ★固定液的选择原则：
(1)非极性试样，用非极性固定液； (2)极性试样，使用极性固定液； (3)极性与非极性的混合物，一般选用极性固定液； (4)能形成氢键的试样，选用极性或形成氢键的固定液； (5)复杂的多组分混合试样,常用两种或两种以上的混合固定液
(c) 若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：
ci%
Ai AS
常数
基线：没有试样进入检 测器时，记录仪记录的是 一条直线，这条直线称为 基线
色谱峰：每一个被分离的组分对应一个色谱峰。色谱峰对称、 均匀分布，峰面积与组分量成正比
峰高h：色谱峰顶到基线的垂直距离
峰宽W：峰两侧拐点处所做切线与峰底相交两点间的距离。峰 高一半处的峰宽叫半峰宽（W ½h）
死时间t0：从进样到空 气峰所对应的时间，实际 上是流动相流经色谱柱所 需要的时间
峰高一半处的峰宽叫高一半处的峰宽叫半峰宽保留时间保留时间ttrr从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间历的时间称为此组分的保留时间称为此组分的保留时间调整保留时间调整保留时间t扣除死时间后的保留时间扣除死时间后的保留时间tt00标准偏差标准偏差ss06070607倍峰高处的一半倍峰高处的一半死时间死时间tt00气峰所对应的时间实际气峰所对应的时间实际上是流动相流经色谱柱所上是流动相流经色谱柱所需要的时间需要的时间色谱流出曲线的意义
色谱理论
按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂 为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。
(3)其他色谱方法
薄层色谱和纸色谱： 比较简单的色谱方法 凝胶色谱法：测聚合物分子 量分布。 超临界色谱: CO2流动相。 高效毛细管电泳:
九十年代快速发展、特别
适合生物试样分析分离的高 效分析仪器。
气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量；
分配比与保留值的关系
t r t0 t V k t0 t0 V0
' r
' r
色谱流出曲线的意义：
色谱峰数代表样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据；
色谱峰高或面积——定量依据；
色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；
色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 3. 分配比可以由实验测得。
容量因子与分配系数的关系
MS VS M V c V K k S S s S Mm M S cm Vm Vm Vm
式中β为相比。
填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。
容量因子越大，保留时间越长。 VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积； VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积；
第八章 色谱分析基础
fundamental of chromatograph analysis
第一节 色谱法概述 generalization of chromatograph analysis
一、 色谱法的特点、分类和应用 characteristic ,classification application of chromatograph 二、气相色谱分离过程
(3)其他色谱方法
薄层色谱和纸色谱： 比较简单的色谱方法 凝胶色谱法：测聚合物分子 量分布。 超临界色谱: CO2流动相。 高效毛细管电泳:
九十年代快速发展、特别
适合生物试样分析分离的高 效分析仪器。
气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量；
分配比与保留值的关系
t r t0 t V k t0 t0 V0
' r
' r
色谱流出曲线的意义：
色谱峰数代表样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据；
色谱峰高或面积——定量依据；
色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；
色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 3. 分配比可以由实验测得。
容量因子与分配系数的关系
MS VS M V c V K k S S s S Mm M S cm Vm Vm Vm
式中β为相比。
填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。
容量因子越大，保留时间越长。 VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积； VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积；
第八章 色谱分析基础
fundamental of chromatograph analysis
第一节 色谱法概述 generalization of chromatograph analysis
一、 色谱法的特点、分类和应用 characteristic ,classification application of chromatograph 二、气相色谱分离过程
第八章色谱分离
离
显 色
计 算 比 移 值
36
纸的准备
一般纸色谱法使用的滤纸应具备以下条件： （1） 滤纸中应不含有水或有机溶剂能溶解的杂质。 （2） 滤纸被溶剂浸润时，不应有机械折痕和损伤。 即应具有一定的强度。 （3） 滤纸对溶剂的渗透速度应适当，渗透速度太 快时易引起斑点拖尾，影响分离效果，速度太慢时， 耗费时间太长。 （4） 纸质应均一，厚薄均匀，特别是定量实验中 这点更是重要。
33
纸色谱装置图
比移值
层 析 纸
溶剂前沿 y
R f1
x1 y
x2 x1 起始线
R f2
x2 y
（原点）
Rf
x y
层析缸
展开剂
与标样比较可定性鉴定
34
注意： ❖ 在进行分析工作时，可使用各组分相应的标
准样品同时作对照实验。 ❖ 影响因素：主要是展开剂、滤纸质量、温度
等实验条件。
35
展
点
开
样
分
23
展距对结果的影响
展距对结果的影响，硅胶HPTLC 分离洋甘菊油， a）3 cm、b）5 cm、c）7 cm、d）9 cm。 24
6、显色
❖ 展开后的薄板晾干溶剂后可采取若干方 法对板上的组分进行定位。
❖ （1）光学检测：对于无色样品，可采用 带荧光剂的吸附剂做薄板，展开后在紫 外光（254nm或365nm）下显暗色斑 点。优点是方便、不破坏被检测物质。
43
柱色谱
✓ 吸附柱色谱的工作原理： • 在色谱柱中填入表面积很大、经过活化的多孔 性粉状固体吸附剂（硅胶、氧化铝）。 • 分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同 时被吸附在柱的上端。 • 当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不 同，往下洗脱的速度也不同，即溶质在柱中自 上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色 带。 • 再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上 分别洗出收集。
第八章气相色谱法
间之差值，即组分在固定相中滞留的时间
tR' tR tm （8—4）
保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极 大点时所消耗的流动相的体积
V t F
R
R
O
（8—5）
死体积Vm：不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流 动相的体积，又指色谱柱中未被固定相所占据的空
隙体积，即色谱柱的流动相体积（包括色谱仪中的
• TCD→选H2，He（u 大，粘度
小）
• FID→选N2（u 小，粘度大）
4.2柱温的选择
K，（t t ）减小，
T
R2
R1
分离度变差
T 延长分析时间
❖原则：
1）在能保证R的前提下，尽量使用低柱温 2）根据样品沸点情况选择合适柱温
柱温应低于组分沸点50~1000C 宽沸程样品应采用程序升温
✓ 程序升温好处：
理论塔板数N——组分流过色谱柱时，在两相间 进行平衡分配的总次数
nL 理H
理
（8—12）
n(tR)2 5.5(4tR )2 1(6tR )2
理
Y
W
12
b
（8—13）
H L （8—14）有效ຫໍສະໝຸດ n有效续前
讨论n：理
L，n理
1 H理
L一定， H理 n理 ，柱效，分离能力 ；
H理一定， Ln理 ，但柱压和分析时
（2）非极性和极性组分——选极性固定液， 基本按沸点顺序出柱
（3）强极性组分——选极性固定液 按极性顺序出柱，极性强的后出柱
（4）氢键型组分——极性或者氢键型固定液
3.气相色谱分析的理论基础
3.1气相色谱流出曲线及有关术语
➢流出曲线：电信号强度随时间变化曲线
tR' tR tm （8—4）
保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极 大点时所消耗的流动相的体积
V t F
R
R
O
（8—5）
死体积Vm：不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流 动相的体积，又指色谱柱中未被固定相所占据的空
隙体积，即色谱柱的流动相体积（包括色谱仪中的
• TCD→选H2，He（u 大，粘度
小）
• FID→选N2（u 小，粘度大）
4.2柱温的选择
K，（t t ）减小，
T
R2
R1
分离度变差
T 延长分析时间
❖原则：
1）在能保证R的前提下，尽量使用低柱温 2）根据样品沸点情况选择合适柱温
柱温应低于组分沸点50~1000C 宽沸程样品应采用程序升温
✓ 程序升温好处：
理论塔板数N——组分流过色谱柱时，在两相间 进行平衡分配的总次数
nL 理H
理
（8—12）
n(tR)2 5.5(4tR )2 1(6tR )2
理
Y
W
12
b
（8—13）
H L （8—14）有效ຫໍສະໝຸດ n有效续前
讨论n：理
L，n理
1 H理
L一定， H理 n理 ，柱效，分离能力 ；
H理一定， Ln理 ，但柱压和分析时
（2）非极性和极性组分——选极性固定液， 基本按沸点顺序出柱
（3）强极性组分——选极性固定液 按极性顺序出柱，极性强的后出柱
（4）氢键型组分——极性或者氢键型固定液
3.气相色谱分析的理论基础
3.1气相色谱流出曲线及有关术语
➢流出曲线：电信号强度随时间变化曲线
《仪器分析》第八章液相色谱分析
保留值主要取决于官能团类型和数目。各类物 质的保留值顺序：
饱和烃<烯烃<芳烃有机卤化物<硫化物<醚<硝基化合物 <腈<酯 醛酮<醇胺<酰胺<羧酸<磺酸
《仪器分析》第八章液相色谱分析
4 化学键合相色谱法
（1）化学键合相
硅胶表面的硅羟基，能与合适的化合物反应。 1）消除或者掩盖了表面吸附活性点，使表面性质均匀，缓 和不可逆吸附，提高峰对称性。 2）耐溶剂冲洗，没有固定液流失。 3）改变键合的有机分子的结构和官能团类型，能改变固定 相的分离选择性。 4）固定液稳定性高，配用高灵敏度检测器，可以降低最低 检出量。
《仪器分析》第八章液相色谱分析
荧光检测器－灵敏度比紫外高2个数量级
高灵敏度、高选择 性；
对多环芳烃，维 生素B、黄曲霉素、卟 啉类化合物、农药、 药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
《仪器分析》第八章液相色谱分析
示差折光检测器 通用型，灵敏度低，温度影响大，不能用于梯
度淋洗；偏转式、反射式和干涉型三种；
0.1~1
102 ～103 10-3 ～10-2
梯度淋洗
能
不能
能
流速敏感性
不敏感
不敏感
不敏感
温度敏感性
低
敏感
低
安培
选择性 104
0.01~1 不能 敏感 敏感
《仪器分析》第八章液相色谱分析
3 液-固色谱法
（1）原理
• 吸附能力大小
与吸附剂比表面积、物理化学性质、组分分子结构、流 动相性质有关。
• 组分、溶剂竞争吸附活性中心 • 分离非离子型、不溶于水的几何异构体
《仪器分析》第八章液相色谱分析
饱和烃<烯烃<芳烃有机卤化物<硫化物<醚<硝基化合物 <腈<酯 醛酮<醇胺<酰胺<羧酸<磺酸
《仪器分析》第八章液相色谱分析
4 化学键合相色谱法
（1）化学键合相
硅胶表面的硅羟基，能与合适的化合物反应。 1）消除或者掩盖了表面吸附活性点，使表面性质均匀，缓 和不可逆吸附，提高峰对称性。 2）耐溶剂冲洗，没有固定液流失。 3）改变键合的有机分子的结构和官能团类型，能改变固定 相的分离选择性。 4）固定液稳定性高，配用高灵敏度检测器，可以降低最低 检出量。
《仪器分析》第八章液相色谱分析
荧光检测器－灵敏度比紫外高2个数量级
高灵敏度、高选择 性；
对多环芳烃，维 生素B、黄曲霉素、卟 啉类化合物、农药、 药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
《仪器分析》第八章液相色谱分析
示差折光检测器 通用型，灵敏度低，温度影响大，不能用于梯
度淋洗；偏转式、反射式和干涉型三种；
0.1~1
102 ～103 10-3 ～10-2
梯度淋洗
能
不能
能
流速敏感性
不敏感
不敏感
不敏感
温度敏感性
低
敏感
低
安培
选择性 104
0.01~1 不能 敏感 敏感
《仪器分析》第八章液相色谱分析
3 液-固色谱法
（1）原理
• 吸附能力大小
与吸附剂比表面积、物理化学性质、组分分子结构、流 动相性质有关。
• 组分、溶剂竞争吸附活性中心 • 分离非离子型、不溶于水的几何异构体
《仪器分析》第八章液相色谱分析
超快光学 第08章 非线性二阶效应
Most materials have inversion symmetry, so you just don’t see SHG— or any other even-order nonlinear-optical effect—every day.
Phase-matching in second-harmonic generation
l
n(l0
)
-
n(l0
/
2)
-
1 2
l
n(l0
/
2)
Now this term yields only secondorder terms and so can be
But the process is phase-matched at l0
neglected.
Dk (l )
4 l l0
n(l0 )
4 4 1 4 l
First:
l
l0
1
l
/
l0
l0
1
l0
When the input wavelength changes by l, the
second-harmonic wavelength changes by only l/2.
x x Dk(l)
4 l0
1
l l0
n(l0
)
r
k k cos zˆ - k sin xˆ
r
k k cos zˆ k sin xˆ
x z
But:
ksig
r rr
kpol k k 2 k con(w) cos
Dropping the “o” and “e” subscripts for generality.
Phase-matching in second-harmonic generation
l
n(l0
)
-
n(l0
/
2)
-
1 2
l
n(l0
/
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Now this term yields only secondorder terms and so can be
But the process is phase-matched at l0
neglected.
Dk (l )
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n(l0 )
4 4 1 4 l
First:
l
l0
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l0
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1
l0
When the input wavelength changes by l, the
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x x Dk(l)
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k k cos zˆ k sin xˆ
x z
But:
ksig
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kpol k k 2 k con(w) cos
Dropping the “o” and “e” subscripts for generality.
生物工程下游技术-第八章色谱分离技术
▪ 方法：使用细长的色谱柱；使用不同梯度的缓冲 液；选择合适的展层剂。
（八）正相色谱与反相色谱
▪ 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性。 非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动 速度快，先从柱中流出来。
▪ 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性， 在这种色谱过程中，极性大的分子比极性小的分 子移动速度快而先从柱中流出。
（三）薄层色谱操作
1、制板 ▪ 玻璃板洗净，硅胶调成糊，均匀摊在玻璃上，晾
干。用前烘干。 用以涂布薄层用的载板有玻璃板、铝箔及塑料
板，对薄层板的要求是：需要有一定的机械强度 及化学惰性，且厚度均匀、表面平整，因此玻璃 板是最常用的。载板可以有不同规格，但最大不 得超过20×20，玻璃板在使用前必须洗净、干燥 备用。玻板除另有规定外，用5cm×20cm， 10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑、 平整，洗净后不附水珠，晾干。
它可使分离时间缩短，分辨能力增加，提高 最小检出量和精度。
（五）流速及控制
▪ 洗脱液的流速会影响色谱的分辨率，在整 个分离过程中，要保持一个稳定的流速。 此流速要经过反复实验来确定。
▪ 流速过高，使色谱峰加宽，降低分辨率。
▪ 流速可通过调节操作压力来调节。
（六）分部收集
▪ 要将各组分分离，必须将溶液在洗脱液中 已经分离的各组分分部收集。
（三）薄层色谱操作
2、点样 ▪ 微量进样器在距底边1.5-2.0cm处点样，
直径小于3mm。 ▪ 定性：内径为0.5mm管口平整的普通毛细
管。 ▪ 定量：微量注射剂。 ▪ 点样直径不超过5mm，点样距离一般为
1~1.5cm即可。
3、展开
▪ 吹干样点，竖直放入层析缸中。展开剂要 接触到吸附剂下沿，但不接触样点。盖上 盖子，展开。待展开剂上行到一定高度， 取出板，画出展开剂前沿线。
（八）正相色谱与反相色谱
▪ 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性。 非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动 速度快，先从柱中流出来。
▪ 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性， 在这种色谱过程中，极性大的分子比极性小的分 子移动速度快而先从柱中流出。
（三）薄层色谱操作
1、制板 ▪ 玻璃板洗净，硅胶调成糊，均匀摊在玻璃上，晾
干。用前烘干。 用以涂布薄层用的载板有玻璃板、铝箔及塑料
板，对薄层板的要求是：需要有一定的机械强度 及化学惰性，且厚度均匀、表面平整，因此玻璃 板是最常用的。载板可以有不同规格，但最大不 得超过20×20，玻璃板在使用前必须洗净、干燥 备用。玻板除另有规定外，用5cm×20cm， 10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑、 平整，洗净后不附水珠，晾干。
它可使分离时间缩短，分辨能力增加，提高 最小检出量和精度。
（五）流速及控制
▪ 洗脱液的流速会影响色谱的分辨率，在整 个分离过程中，要保持一个稳定的流速。 此流速要经过反复实验来确定。
▪ 流速过高，使色谱峰加宽，降低分辨率。
▪ 流速可通过调节操作压力来调节。
（六）分部收集
▪ 要将各组分分离，必须将溶液在洗脱液中 已经分离的各组分分部收集。
（三）薄层色谱操作
2、点样 ▪ 微量进样器在距底边1.5-2.0cm处点样，
直径小于3mm。 ▪ 定性：内径为0.5mm管口平整的普通毛细
管。 ▪ 定量：微量注射剂。 ▪ 点样直径不超过5mm，点样距离一般为
1~1.5cm即可。
3、展开
▪ 吹干样点，竖直放入层析缸中。展开剂要 接触到吸附剂下沿，但不接触样点。盖上 盖子，展开。待展开剂上行到一定高度， 取出板，画出展开剂前沿线。
色谱部分思考题和答案解析
3．决定开管柱毛细管气相色谱与高效液相色谱的柱内效应的因素有何区别？ 【问题分析】柱内效应指：影响色谱峰扩展及分离的因素，Van Deemter 方程的表 观形式为：
B Cu u 分子扩散项，由于分子在液体中扩撒系数比色相中小得多，故在 HPLC 中，此项可 H A
以忽略不计。 毛细管色谱柱不装填料，阻力小，管径小，气流单途径通过柱子，消除了组分在柱 子中的涡流扩散。固定液直径涂在管壁上，总柱内壁面积较大，涂层很薄，则气相和液 相传质阻力大大降低。 【参考答案】开管 GC 中无涡流扩散项，柱内效应主要由分子扩散决定，HPLC 中 分子扩散可以忽略，柱内效应主要由涡流扩散和传质阻力决定。
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期末考试考研复习备考
huashengxueyuanbgs@
量大的强碱型阴离子交换树脂，洗脱液中高电导的 H＋被抑制柱反应生成低电导的水， 最后检测的是流出液中的 M 和 OH 的电导。 阴离子分析：分离柱采用低容量强碱型阴离子交换柱，常用 NaHCO3 和 Na2CO3 混 合液作流动相，串联在分析柱后面的抑制柱则采用高容量的强酸型阳离子交换柱。 14．非抑制型离子色谱法是一种什么样的色谱模型？该方法是如何减少本体电导的干 扰？ 【参考答案】非抑制型离子交换色谱（单柱法） ：使用交换容量更低(0.007～0.04 mmol/g 干树脂)的分离柱，以低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，不需抑 制柱的一种离子交换色谱法。 消除本体电导干扰的措施：用更低交换容量（交换容量在 0.007~0.04 mmol/g）的离 子交换树脂为固定相,用更低浓度和电导率的洗脱液。 15．衡量离子交换剂对离子的亲和能力大小的基本参数是什么？在稀溶液中，离子交换 剂对离子的亲和能力有什么规律？ 【参考答案】衡量离子交换剂对离子的亲和能力大小的基本参数为离子交换选择性 系数，对一价离子交换的选择性系数：
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Cs
线形
凸形
凹形
Sig
Cm 峰形
tR
tR
m
图8. 分布等温线类型及对色谱峰形和保留时间的影响
3、吸附等温线的意义 ⑴预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱的色 谱峰图。凸形——拖尾，凹形——伸舌。 ⑵为物质的非线性色谱分离选择最佳条件。 ⑶反映被分离分子与固相表面的作用，有利于研究 分子构形和吸附状态。 ⑷建立分子结构-吸附之间的定量关系，便于以分 子结构预测吸附性能。由于分子的总吸附能是分 子中各原子/基团吸附能的总和，测定出一定条 件下各原子/基团吸附能，就可从组成结构推测 其吸附行为。
一般情况下选择f/F=（d/D）2，这样这个公式就 成了T=t*（L/l） 进样量按V=v*（D2*L/d2*l）放大 V：制备进样体积 v：分析进样体积 实际工作中还要考虑系统滞留体积引起的梯度 延迟，由于制备的流速比较大，梯度延迟比较 小。系统滞留体积需要自己去准确测量
以硅胶为基体固定相分离Lyz、 第一步 细颗粒（3-5um）短柱（5cm）摸索条件。 快速易操作。 第二步粗颗粒填料 廉价便于高压高速洗脱 第三步细颗粒（3-5um）均匀填料 细颗粒柱效高， 适合最终纯化。
条件放大进样量、流速以及梯度条件等，最后在
一般情况下，制备色谱的分离度 ()应大于 1.25 ，
制备色谱中进行适当的调整。
从分析放大到制备，首先要保证分析柱和制备柱 的填料一致，其他的外部条件也要保持一致， 然后按这个公式放大 T=t*（L/l）*（D/d）2*（f/F） T：制备柱上的梯度时间 t：分析柱上的梯度时间 L：制备柱长度 l：分析柱长度 D：制备柱直径 d：分析柱直径 f：分析柱流量 F：制备柱的流量
4、高灵敏度在线检测 HPLC均带检测装置。 5、快速分离 带有加压系统，是分离速度加快，时间缩短。 6、连续自动化 计算机技术的植入，使HPLC实现连续进样、洗 脱、收集，且高度自动化。 二、线性色谱与非线性色谱 线性与非线性是数学函数的概念，描述自变量和 应变量之间的关系。 在色谱学上，如果流动相与固定相中的样品浓度 Cm与Cs之间呈线性关系，此时的色谱分配过 程就是线性色谱。
D=H· L/2t0 对色谱峰图的影响 ①线性等温线 溶质谱带移动速度不随浓度变化，整个谱 带以恒定速度移动，谱带形状只与进样函数相关。 ②凸形等温线 溶质在低浓度区移动慢，高浓度区移动快， 前沿陡峭后沿拖尾，浓度越大拖尾越严重。 ③凹形等温线 溶质在低浓度区移动快，高浓度区移动慢， 前沿平坦后沿陡峭，即“伸舌”状。 ④S形等温线 溶质在低浓度区移动快，随浓度增加速度 减慢，到一定浓度范围内不同浓度的分子做等速移动， 浓度再增加，速度又加快。为卷“浪状”峰图。
4、吸附等温线测定 有动态法和静态法 静态法 将系列不同浓度（C）的溶质分别加入一 定量固相吸附剂，平衡后分别计算溶质在吸附 剂上的浓度（q），将q对相平衡的C作图，即 可得到溶质的吸附等温线。方法简便、耗时、 准确度不高且消耗样品多。 有动态法 又有前沿分析（FA）、特征点前沿分 析（FACP）、特征点洗脱（ECP）、平台洗 脱（EP），其中前沿分析可以得到高精度吸 附等温线。
⑴反相填料 填料为非极性官能团，为烷烃，长链 烷烃填料适合分离小肽，短链烷烃填料适合分离 多肽/蛋白质。 ⑵疏水作用填料 疏水作用比反相填料弱，用于分 离在聚醚固定相上不保留的强亲水蛋白质。 ⑶离子交换填料 有强/弱阳离子，强/弱阴离子四 种填料。 ⑷体积排斥填料 不能用于高pH流动相，无法完全 惰性。 ⑸亲和填料 选择性强，种类少。 书P151，列出了部分填料及特性。
合适的置换剂需满足如下要求： ①凸形吸附等温线②在流动相中易溶③不与溶质及 流动相起化学反应④易于从固定相表面洗脱。 四、色谱系统的生物相容性 色谱仪的制备材料对生物分子分离纯化有一定的 影响。用金属（316号不锈钢）制成的色谱柱不 耐高盐，具表面吸附作用。 目前，采用了一些改进方法，如改用其他金属、 316钢表面亲水高分子材料处理、用工程塑料等， 提高分离效率。
第三节 非线性色谱的实验方法
一、固定相及色谱柱 1、固定相 粗/细的颗粒大孔径填料。 ①一类是使用最多的微粒硅胶；
②另一类是使用较少的高分子（树脂）微球： 优点是强度大、化学惰性、使用pH范围大(pH=1～ 14)。
缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶， 这种固定相要占所有柱填料的80％。蛋白质30-100nm， 核酸大于50nm。 常见填料：
HPLC拆分氧氟沙星（氟哌酸）
国内使用外消旋的 OFLOXCIN, 而日本已开发左旋氧 氟沙星（LEVOFLOXCIN）,商品名Cravit。
S-(-)-OFL
R-(+)-OFL
O F
H2 N
COOH
Cu2+
COOH
N N O
N
H3C
CH3
用 6mmol/L l-phen+CuSO4+15%CH3OH (pH3.5) ， Shim-Park PREP ODS (20mm×25cm),4.6mL/min,293nm,0.5ml15g/L(±)OFL
2、前沿分析 样品溶液连续不断进入色谱柱，直至流出组分与 输入组分完全一样，所以不可能将各组分完全分 开。适宜于浓缩痕量组分或测定新吸附等温线。 3、置换展开 与分析色谱不同的是，样品进入色谱柱后，用与 固定相作用力极强的流动相通入色谱柱，以替代 结合在固定相表面的溶质分子。 特点是各组分浓度不但不降低还会提高，起到浓 缩效果；单位柱长的固定相利用率高。 缺点是不容易找到合适置换剂；需要合适的2相 体系；每次置换展开结束，要将置换剂清洗干净。
第四节 非线性色谱在分离纯化蛋白质中的应用
制备色谱条件选择一般应参考薄层色谱条件、快 速柱色谱初分条件、分析柱色谱或小规模柱分离 探索分离条件，再扩大到同类型的制备柱分离。
如对复杂样品或未知样品的提取和纯化，通常采用
分析柱探索分离条件，然后按规模放大分离。在 根据制备规模选择色谱柱，然后分析色谱的优化
Ka、kb分别为吸附和洗脱常数。 2、吸附平衡动力学 色谱分离是个由不平衡到平衡，周而复始的连续 过程。方程式如下 dQ/dt=Ka（Q0-Q）－ Kd· Q； Q为t时间点固定相上溶质的浓度；Q0溶质在固定 相上的饱和浓度；Ka、kb分别为吸附和洗脱常 数。 3、色谱基本物料平衡方程 如果柱子足够长传质过程服从一级动力学方程， 则轴向扩散系数D与理论塔片高度H、柱长L及 死时间t0的关系如下
所以等温线随浓度增加而增加。 ⑷S形 为凸形和凹形等温线的叠加产物，表明被 吸附分子间有很强的作用力，能进一步吸附其 他分子，而溶质分子与固相作用弱，或与表面 覆盖无关。又分正S形和反S形等温线。随着溶 质浓度增加，被固相表面吸附的分子稳定后又 吸附其他分子，形成反S形等温线；溶质与固相 表面吸附力弱，但被吸附分子与未吸附分子作 用强，则易形成正S形等温线。 ⑸阶梯形 表明被吸附分子在固相表面随液相中溶 质浓度增加会发生吸附取向改变或吸附状态的 改变。每一阶梯代表一种吸附状态。 下面是等温线与色谱峰图
二、色谱柱及填充技术 色谱柱对分离纯化影响极大，设计时必须注意： 1、长度 过短不能达到分离效果，过长不容易填 充均匀且柱效也不再提高。 2、柱径 增加柱径可使增加样品负载，也可增加柱 效。 柱的填充方法有干法和湿法。 二、样品溶解和进样方法 非线性色谱样品溶液的制备是实验关键。对蛋白质 而言，一般溶解度有限，常加入其他试剂助溶， 如5-60%甲醇，4-8M尿素或0.01%SDS等。
第八章 非线性色谱原理及其在蛋白 分离纯化中的应用
韶关学院生命科学院
第一节 概述
生物制品的分离纯化对产品质量具有重要的意义。 传统方法由于效率低，费时，劳动强度的等原 因，已经不使应现代生物技术发展的要求。 色谱技术自1903年俄国植物学家Michael Tswett 发现并命名以来，不断改进，在生物产品的制 备中使用日臻。1950s出现气相色谱，1960s制 成了自动化的色谱仪，使色谱方法在制备和分 析领域得到更广泛的应用。
一、色谱法的基本特点 1、分离效率高 理论踏板的高度仅相当1-2个固定相的高度。 HPLC的色谱柱短到3-20cm，就能分离多达几 十种分子。 2、应用面广 从无机物到有机物，小分子到大分子，热敏感到 热不敏感的分子均适用。特别适宜用于生物样 品的纯化与复性。 3、操作参数多 按固定相、流动相及洗脱液组成性质不同，色谱 有许多种的分类和亚类，适用于各种分子分离。
第二节 非线性色谱（non-linear chromatography）的理论基础
非线性色谱理论是研究样品在固定相与流动相中的 浓度处于非线性关系状态下，各种实验参数对色 谱分离过程的影响，建立起柱参数、溶质性质及 操作条件之间的定量关系式。 一、吸附过程及吸附等温线 吸附是常发生在2相界面上的现象。原因是处于界 面上的分子/原子与其内部的分子/原子具有不同 的能量和性质，产生一种不平衡的倾向，这种差 异就造成了吸附现象。
第五节色谱新技术 1、高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography ,HSCCC) 连续逆流液液萃取: 不用固态载体的液相分 配色谱技术 工作原理：一种独特的流体动力学现象 一种连续的实用分离制备技术 HSCCC是由美国国立卫生院Ito 博士研制开发 的一种独特的不用固态载体的液相分配色谱 技术。
1、吸附分类 ⑴化学吸附 吸附热大，不可逆 ⑵物理吸附 吸附热小，可逆 非线性色谱理想的吸附是物理吸附，要避免化学吸 附。
2、吸附等温线：一定温度下2相界面上的吸附过 程达到平衡时物质分子在2相中的浓度间关系。 HPLC常见的等温线：凸形、凹形、S形、H形和 阶梯形等5种，需用不同的数学模型描述 。 ⑴凸形 见于液-固系统中的多数小分子化合物。反 映溶质在固相表面吸附达饱和时生成单分子层。 浓度继续增加，等温线曲率渐减，最后为0。达 到饱和。 ⑵ H形 是凸形等温线的特例，反映一类容易被吸 附且容易达到饱和的物质的吸附状态。 ⑶凹形 适用于低浓度下，已吸附的分子又能吸附 液相中的分子，形成多分析吸附层的物质。