菏泽市犬瘟热病毒的分离与鉴定
犬瘟热的原因与诊治
《小动物疾病学》课程论文犬瘟热的诊治摘要：随着人们生活水平的提高,越来越多的人加入养宠大军中,但在宠物的日常养殖过程中,常出现各种疾病,本文主要介绍宠物常见传染病犬瘟热的临床症状、诊断和治疗方法。
关键词：犬瘟热诊断治疗犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)引起的，感染肉食兽中的犬科(尤其是幼犬)等的高度接触性、致死性传染病。
CDV大量存在于鼻液、唾液、泪液中，血液、淋巴结、脑脊髓液、肝脏、脾脏、心包液、胸水、腹水中。
本病主要是由于病犬与易感犬的接触，通过飞沫、污染食物等由呼吸道和消化道感染。
一、临床症状犬瘟热的潜伏期随病原来源的不同，长短差异较大。
来源于同种动物的病原，潜伏期一般为3～6天；来源于异种动物的病原，因需要经过一般时间的适应，潜伏期可长达70～90天。
犬在感染后的第四天左右出现体温升高，持续1～2天，轻微厌食，偶见结膜炎。
病犬出现粘液性、脓性鼻涕、附着在两侧鼻孔周围，并常见咳嗽和轻度呼吸困难。
病犬食欲不振，大量饮清水。
初期粪便正常或便秘，不久便发生下痢，粪便呈粘液糊状，恶臭。
眼睑肿胀，出现脓性分泌物，将上下眼睑粘合在一起，出现半睁半闭现象。
在下腹部和腹内侧皮肤上出现米粒大小的红色丘疹或化脓性丘疹，在病的恢复期或一开始发热时就可出现神经症状、痉挛、癫痫发作。
一闭一合，转圈运动或后躯瘫痪。
二、诊断该病病型复杂多样，又常易与沙门氏菌以及犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒等病原混合感染或继发感染，所以临床诊断较为困难。
根据临床症状，病理变化和流行病学资料可作出初步诊断，确诊需通过下述方法检查。
病毒的分离鉴定。
从自然感染病例分离病毒较为困难，将病料接种于雪貂是通常用的分离方法。
发病初期采集淋巴组织；急性病例取胸腺、脾、肺、肝；呈脑炎症状者采集小脑等病料，制成10%乳剂，加适量双抗或微孔滤膜过滤后，腹腔接种1～2周龄或断乳15天的易感幼犬5ml，症状明显，常于发病后2周死亡。
除了上述诊断方法外临床上常用的方法还有包涵体检查、血清学诊断等三、治疗病犬及早大剂量应用犬瘟热高免血清，一般用2～3ml/kg体重，连用3～4天。
犬瘟热和犬细小病毒病的诊治
犬瘟热和犬细小病毒病的诊治作者：刘艳凯来源：《现代畜牧科技》 2015年第6期刘艳凯（河北省唐山市古冶区农林畜牧水产局063100）犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒( CDV)引起的一种高度接触性病毒性传染病。
犬细小病毒病是细小病毒科、细小病毒属成员，由犬细小病毒( CPV)引起的一种急性传染病。
犬瘟热和犬细小病毒病是养犬业重要的传染病，常可引起死亡。
笔者根据近年来的诊治经验，现就犬瘟热和犬细小病毒的鉴别诊断和治疗进行探讨。
1 犬瘟热病例和临床治疗1.1 西施犬病犬3月龄，体重3kg，体温40。
C，精神不振，不食，呕吐，眼睑和上嘴唇分布有针尖大至芝麻大出血点，共13个，便如稀粥，带黏液，用CDV检测试剂盒确诊。
双黄连600mg、氨苄青霉素200万IU、维生素C lg、维生素B。
2g、5%葡萄糖溶液lOOOmL、利巴韦林ImL，静脉注射，每天2次，连用4天，病犬症状减轻，此后病情反复，1个月后死亡。
1.2格力犬病犬4月龄左右，体重21kg，病初鼻端干燥，眼鼻有水样分泌物，精神沉郁，食欲不振，使用CDV试剂盒确诊。
4天后体温达40CC，持续1天，用磺胺药和抗生素治疗，病犬体温趋于正常，症状也有缓和，2天后，体温第二次升高，之后病情反复，经过两个多月的对症治疗，病犬痊愈。
1.3 波恩达猎犬病犬4月龄，体重约lOkg，体温37.5℃，精神高度沉郁，食欲废绝，呕吐，站立无力，喜卧，排粪如喷水，蕃茄汁色，腥臭，呼吸困难，用CDV试剂盒确诊为犬瘟热。
注射血清，皮下注射维生素C 2mL．维生素B。
ImL，利巴韦林ImL，无明显疗效，3天后，病犬表现出嘴角抽动、牙关咬紧、口吐白沫等神经症状，于当日晚上死亡。
1.4 北京犬病犬6月龄，体重9kg，体温39.6℃，精神沉郁，就诊初期体温达40C，眼结膜充血，食欲、精神均正常，经解热抗炎治疗好转后停止治疗。
2~3天后，开始出现胃肠道疾病，而且不时有脓性鼻汁和脓性眼屎，精神时好时坏，体温高，鼻镜龟裂，足垫增厚，用CDV试剂盒确诊为犬瘟热。
犬瘟热的诊断与防治
目前，宠物饲养量逐年攀升，尤其在大城市，各种名贵犬种更是数不胜数。
然而，犬类的疾病发生率也在增加，且控制难度大，尤其是犬瘟热，成了犬的头号杀手，笔者现就犬瘟热病做一介绍，供广大同仁参考。
犬瘟热，又名犬瘟，主要危害幼犬，病犬以呈现双相发热、鼻炎、严重的消化道障碍和呼吸道炎症等为特征，后期少数病例可发生脑炎，本病对养犬业危害较大。
1病原体病原体是犬瘟热病毒，属于副黏病毒科，麻疹病毒属。
2发病特点本病的潜伏期为3~6d ，主要经呼吸道传播，病犬和带菌犬是主要的传染源。
病犬的鼻涕、泪液、唾液、尿液等分泌物或排泄物中都含有病毒，并向外界排毒，健康犬与病犬直接接触或通过污染的空气、饮水及环境而感染。
本病冬春季节多发，不同品种、年龄、性别的犬均可感染，以2月龄至1岁的幼犬易感性最强，死亡率极高，纯种犬比土种犬易感性高，症状重死亡率也高。
3发病症状病犬表现厌食、精神沉郁、发热和上呼吸道感染的症状。
体温呈双相热型（即病初体温升高达40℃左右，持续1~2d 后降至正常，经2~3d 后，体温再次升高）；第二次体温升高时（少数病例此时死亡）出现呼吸道症状，表现流泪、眼分泌物增加，由液状变成黏脓性，结膜发红。
鼻镜发干，流鼻涕，开始呈浆液性鼻液，后期变成脓性鼻液，呼吸困难。
肠胃型病理可出现呕吐、腹泻、肠套叠，最后脱水、衰竭而死[1]。
神经型犬瘟热，多在发病后期出现症状，表现为癫痫、转圈、共济失调、抽搐等神经症状，预后多不良。
有些病犬还会出现鼻、足垫的表皮角质化，下腹部和股内侧皮肤上有米粒大红点、水肿和化脓性丘疹。
4诊断根据本病发病特点及症状可初步诊断，临床上，宠物医院常用平板快速诊断方法，此方法为免疫层析法（双抗夹心法）定性地检测犬类眼部分泌物、鼻涕、唾液，生殖器及肛门（粪便）和血清中CDV 抗原。
在检测卡判断窗中有结果判断线“T 线”和检测控制线“C 线”。
使用方法用生理盐水沾湿棉签收集狗眼部及结膜分泌物、鼻液、唾液或尿液。
犬瘟热病毒分离株N、H、F蛋白基因的变异分析
犬瘟热病毒分离株N、H、F蛋白基因的变异分析王旭荣;王小辉;张世栋;李世宏;潘虎;严作廷【摘要】通过RT-PCR方法扩增到犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)分离株GS0812-4的N、H、F蛋白基因,然后克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析和抗原表位预测分析.结果表明,GS0812-4分离株的N、H、F蛋白基因与其他分离株相应序列的核苷酸同源性分别为93.2％～97.8％、90.3％～97.3％、93.2％～97.8％,其推定的氨基酸同源性分别为96.6％～98.7％、91.3％～97.9％和96.6％～98.7％;GS0812-4分离株N、H、F蛋白基因与疫苗株相应序列的核苷酸同源性分别为93.1％～93.8％、89.4％～90.5％、93.1％～93.8％,其推定的氨基酸同源性分别为96.4％～97.3％、89.3％～91.3％、96.4％～97.3％.由基因系统发育树可知,GS0812-4与疫苗株处于不同的分支,其中与MKY-KM08的亲缘关系最近,但GS0812-4在N、H、F3个基因系统发育树上与其他同一毒株的亲缘关系远近不同.H、F蛋白的抗原表位预测结果表明,GS0812-4与MKY-KM08和疫苗株的抗原表位均有差异.说明GS0812-4是野毒株,与MKY-KM08属于同一基因型,来源于同一毒株,但两毒株间的H蛋白和F蛋白的抗原表位仍有差异.%The nucleoprotein (N), haemgagglutinin protein (H)and fusion protein (F) genes of canine distemper virus (CDV) isolate GS0812-4were obtained by RT-PCR and sequenced after being cloned directly into the pGEM-T Easy. The sequences of N,H and F genes of GS0812-4 were compared with sequences and antigen epitope of other CDV strains in Gen-Bank by BLAST and DNAStar software. The results showed that the N,H and F of GS0812-4 shared 93. 2% to 97. 8% ,90. 3% to 97. 3%,93. 2% to 97.8% of nucleotide homology, and 96. 6% to 98. 7%,91. 3% to 97.9% and 96.6% to 98.7% ofamino acid identity with that of referenced strains, respectively. However, The N, H and F genes of the GS0812-4 shared only 93.1% to 93. 8%,89. 4% to 90. 5% and 93.1% to 93. 8% of nucleotide homology, and 96.4% to 97. 3% ,89. 3% to 91.3% and 96. 4% to 97. 3% of amino acid homology with that of vaccine strains, respectively. Phylogenetic tree showed thatGS0812-4 was different from the vaccine strain of the branch, it had a recent genetic relationship and MKY-KM08. But GS0812-4 compared with other strains of different genetic distance relationships. H, F protein epitope prediction results showed that GS0812-4 epitope was different from and MKY-KM08 and vaccine strains. Results showed that GS0812-4 was the wild strain, and the GS0812-4 strain was MKY-KM08 belonged to the same genotype, derived from the same strain, but there were still differences between epitopes.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(038)008【总页数】7页(P71-77)【关键词】犬瘟热病毒;H蛋白;H蛋白;F蛋白;变异分析【作者】王旭荣;王小辉;张世栋;李世宏;潘虎;严作廷【作者单位】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院临床兽医学研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院临床兽医学研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院临床兽医学研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院临床兽医学研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院临床兽医学研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院临床兽医学研究中心,甘肃兰州 730050【正文语种】中文【中图分类】Q78犬瘟热（canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）感染引起的急性高度接触性传染病，在非免疫动物中发病率和致死率很高。
犬细小病毒病的诊治与防控措施
犬细小病毒病的诊治与防控措施
犬细小病毒病，又称犬瘟热，是一种由犬细小病毒引起的犬类传染病，主要通过空气飞沫或直接接触传播。
该病具有较高的病死率，并对犬群健康造成严重威胁。
以下是关于犬细小病毒病的诊治与防控措施的一些内容。
诊断：
1. 临床症状：患犬出现高热、呕吐、腹泻、食欲不振、鼻流泪液、呼吸困难等症状。
2. 实验室检查：通过病毒抗原检测或RNA检测，如酶联免疫吸附试验（ELISA）或聚合酶链式反应（PCR）等，可以确定病毒感染。
治疗：
1. 对症治疗：给予患犬足够的休息和营养，保持体内水平稳定，纠正电解质紊乱，控制并预防继发感染。
2. 支持疗法：根据犬的具体情况，可使用抗菌药物、抗病毒药物、解热药物、抗炎药物等进行治疗。
3. 免疫治疗：可根据犬的免疫状态，给予相应的疫苗接种来提高犬的免疫力。
防控措施：
1. 疫苗接种：及时给犬类注射疫苗，建立免疫防线。
常见的犬细小病毒疫苗包括一价疫苗和复合疫苗，可以根据兽医建议选择适当的疫苗。
2. 隔离措施：对于已经感染或疑似感染病毒的犬只，应立即进行隔离，避免传播给其他健康犬只。
3. 环境消毒：对于病毒感染的环境，要进行彻底的消毒，以破坏病毒的生存环境。
4. 健康管理：定期对犬只进行体检，保持犬只的健康状态，提高整体免疫力。
5. 个体防护：饲养者应与犬只保持良好的个人卫生习惯，如勤洗手、避免与病犬直接接触等。
对于犬细小病毒病的诊治与防控措施，应早期确诊、及时治疗，并采取综合措施进行防控。
通过疫苗接种、隔离措施、环境消毒、健康管理和个体防护等手段，可以有效预防和控制犬细小病毒的传播。
犬瘟热与犬细小病毒病的区别诊断与治疗
治 疗 方 法 可 以 提 高其 治愈 率 。治疗 犬 瘟 热 特 异 性 疗 法 中 ． 生 物 药
品 多 选 用 犬 瘟 热 单 克 隆 抗 体 或 犬 五 联 高 免 血 清 ．早 期 可 以注 射
种 传 染 病 ，犬 瘟 热 与 犬 细 小 病 毒 病 病 例 占就 诊 病 例 的 比 率 为
地 塞米松等 ， 控制病犬 呕吐可以用山莨菪碱 （ ６ ５ ４ — ２ ） 、 爱茂尔 ， 胃
３症 状 学 诊 断
３ ． １ 犬 瘟 热 特 征诊 断 是 脓 眼 屎 、 脓 鼻涕 、 咳嗽 、 嘴 角抽动 、 胃
肠炎 、 脚垫角化 、 高烧 ３ ９ ． ５ ℃～ ４ １ ℃。 ３ ． ２细 小 病 毒 特 征 诊 断 是 呕 吐 、 腹 泻频繁 ． 腹 泻 严 重 犬 出 现 咖啡 色 或 蕃 茄 酱 色 样 的血 便 ， 并 有 特 殊 的腥 臭 味 。
症 状 为特 征
利 巴韦林 、 双黄连 、 清开灵 、 炎虎宁 、 胸 腺 肽 或 干 扰 素 等 。退 热 选 用 柴胡 、 地 塞 米 松 和 赖 氨 匹林 等 ， 同时 可 以应 用 安 宫 牛 黄 丸 或 紫 雪丹 ， 在 临 床 上 也 有 不 错 的 降 温 效果 。助 消 化 多选 用 吗 丁 啉 、 多 酶 片和 乳 酶 生 。 止 咳平 喘选 用 氨 茶 碱 、 止 咳糖 浆 等 并 配合 雾 化 疗
用 已沾 湿 生 理 盐 水 的 棉 签 收 集 犬 眼 分 泌 物 （ 或结膜 ） 、 鼻涕 、
由于 这 两 种 传 染 病 发 病 率 与致 死 率非 常 高 ． 且无特效疗法，
故 应 及 时采 取 综 合 性 的 防 治 措 施 ，早 发 现早 治 疗 。 在 治 疗 的 同 时， 要加强饲养管理， 改善饲养条件， 经常消毒犬舍及用具， 可 提 高治愈率， 减 少 死 亡 率 。 凡在 治疗 有 明显 好 转 时 ， 不 应 中断 ， 应 该
犬瘟热知识介绍
【犬瘟热】(canine distemper）犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种急性、高度接触性传染病。
本病以呈现典型的双相热型，上呼吸道、肺及胃肠道的卡他性炎症，非化脓性脑膜-脊髓炎为特征。
【易感动物】犬瘟热病毒可感染的犬科、鼬鼠科及部分浣熊科动物。
【流行季节】犬瘟热病毒感染一年四季都可发生，无地区性。
【临床症状】犬瘟热病毒感染犬后呈现典型的双相热型，上呼吸道、肺及胃肠道的卡他性炎症，非化脓性脑膜-脊髓炎为特征。
双相热型：患病犬体温39.5~41℃，约持续2d以后下降到常温。
此时病犬感觉良好，食欲恢复，2~3d后再次发热持续数周之久。
上呼吸道、肺及胃肠道的卡他性炎症：患病犬双相热后，其鼻镜、眼睑干燥甚至龟裂，同时伴有厌食，常有呕吐和肺炎症状。
严重病例发生腹泻，水样粪便（恶臭，混有黏液和血液）。
神经症状：犬瘟热的神经临诊症状视病毒侵害中枢神经系统的部位不同而有差异，一般呈现癫痫、转圈，共济失调、反射异常，颈部强直、肌肉痉挛等症状。
但是，咬肌反复节律性的颤动是本病常见的神经临诊症状。
【诊断】依据患病动物临床症状、RT-PCR鉴定、病理学变化和血清学试验结果综合判定。
【治疗】目前采用以下几种方案用于犬瘟热病毒的治疗，当出现明显临诊症状时，多预后不良。
静脉输液：患病动物可以经过静脉输液来纠正脱水及重建离子与酸碱平衡。
病犬及早用血清（每千克体重皮下或肌肉注射1-3ml)、球蛋白、抗菌药物、皮质激素类药物、免疫增强剂、维生素和对症支持疗法（如输液、脱敏、退热、镇静、止痛、收敛及循环兴奋剂等)进行治疗，配合良好的护理，对早期病犬可获一定疗效。
【预防】目前，常用犬瘟热病毒疫苗来预防本病。
犬用的疫苗有甲醛灭活疫苗、雪貂传代的减弱活毒疫苗、用不同组合方式制成的犬瘟热和传染性肝炎的二价苗和麻疹疫苗。
我国目前用于预防本病的疫苗有单价苗（鸡胚细胞弱毒冻干苗）、三联苗（犬瘟热、犬传染性肝炎和犬细小病毒病)、五联苗（犬瘟热、犬传染性肝炎、犬细小病毒病、犬副流感和狂犬病）。
狐源犬瘟热病毒泰安株(CDV-FOX-TA)的分离与鉴定
关键词： 狐狸； 犬瘟 热病毒 ： 分离； 鉴定 中图分类号 ：８５ ２ ￥６ ． ３；８ ２ ６ ５ ￥５ ．５ 文献标识码 ： Ａ
Ｉｏ ａ ｉｎ ｎ ｄｅ ｉ ｃ ｔｏ ｆＣａ ｎ ｓｅ ｐ ｒ ｖ ｒ ｓｆ ｏ ｏ ｓ ｌ ｔｏ ａ ｄ ｉ ｎｔｆ ａ ｉｎ ｏ ｎｉ ｅ ｄｉｔｍ ｅ ｉｕ ｒ ｍ ｆ ｘ ｉ
Ｙ ＮＧＤ ．ａ Ｌ ．ｉ 一，Ｈ ｈ ａ．ｅ ，Ｉ ｕ ＸＥ Ｚ ｉｉｇ ， Ａ ｉｅ ，Ｒ Ｎ Ｙ ｅ ， ａ— ｎ Ａ ｕｂｏ ． ＶＰｎ Ｕ Ｃ ｕ ｎｗ ｉ ＪＡＹ ｎ ， Ｉ ｈ－ｎＨ Ｃ Ｏ Ｄ． ｉ ｊ ｆ。 Ｅ ｕ４ ＨＵ Ｈ ｉａｇ ｆ （ ． ｎｍａ ＳｉｎｅａｄＴｃ ｎｌｇ ｎｔ ｌ， ｈｎ ｏｇＡ ｒ ｕｔｒｌ ｎｖｒｉ ，ｈｎｏ ｇＴ ｉｎ７ ０ ８ Ｃ ｉ ；． ｉ ｎｎ ｎ ｙＥ ｉ Ｉ— １Ａ ｉ ｌ ｅｃ ｎ ｅｈ ｏ ｙＩｓｔ ｅ Ｓ ａｄｎ ｇｃ ｌ ａ Ｕ ｉ ｓｙ Ｓａ ｄｎ ａａ １１ ， ｈｎ ２ Ｌａ ｉｇＥ ｔ —ｘ ｎ ｃ ｏ ｉ ｕ ｉ ｕ ｅ ｔ ’ ａ ｏ ｒ ｔ
Ｋｅ ｒ ｓ ｆ ｘ ｃ ｉ ｅ ｄ ｓｅ ｅ ｒｖ ｒ ｓ ｉｏａ ｏ ｉ ｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ：ｏ ； ａ ｎ ｉｔｍｐ ｉｕ ；ｓ ｌ ｔ ｎ； ｎｉ ａｉ ｎ ｉ ｄ ｉ ｆ ｏ
犬瘟热（ ａｉ ｉｅ ｐｒ Ｄ 是 由副粘病毒科 Ｃｎ ｅｄ ｔ ｅ， ） ｎ ｓｍ Ｃ 麻疹病毒属 的犬瘟热病毒 （ ａｉ ｉｅ ｐｒ ｉ ｓ Ｃ ｎ ｅｄ ｔ ｅ ｖ ｕ ， ｎ ｓｍ ｒ Ｃ Ｖ 引起的一种急性、 Ｄ） 高度接触性、 致死性传染病。 Ｃ Ｖ不但可 以感染犬 、 Ｄ 狐狸、 狼 、 貉、 雪貂、 狮等 虎、 动物， 而且 大熊猫 、 小熊猫 ¨ 等 国宝动物 ， 以及海 豚、 海豹 等海洋动 物也可感染 ， 当前对养犬 是 业、 毛皮动物养殖业和野生动物保护危害最大的疫 病之一。随着生态环境的变化与动物和病毒的进 化 ，Ｄ Ｃ Ｖ的自然感染宿 主也不断扩大 ， 甚至有报道 人也可以感染 。笔者在 流行病 学调查过程 中成 ｊ 功从一批发病狐血液 中分离到 １ 株病毒 ， 经鉴定为 １ Ｃ Ｖ强毒株 ， 株 Ｄ 命名 为 Ｃ Ｖ Ｆ ＸＴ 现将 情况 报 Ｄ —Ｏ —Ａ，
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菏泽市犬瘟热病毒的分离与鉴定 万双秀 （菏泽学院制药工程系，山东菏泽２７４０００）
摘要：通过采集本市３家宠物医院２０只死亡犬的肝脏、脾脏、淋巴结及脑组织，一进行病毒的分离培养、理化 性质的测定、病毒毒力测定、及动物回归试验，确定了该病毒可以通过ｖｅｒｏ细胞进行培养增殖，有囊膜，耐酸碱， 对温度敏感，ＴＣＩＤ５０为１０５．８３２，最后通过动物实验确定了该病毒为犬瘟热病毒，对犬类具有高度致病性。 关键词：犬瘟热病毒；分离；鉴定 中图分类号：￥８５６２．６５９．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５—９４４Ｘ（２０１３）１１－００７５—０５
Ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｈｅｚｅ Ｗａｎ Ｓｈｕａｎｇｘｉｕ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｉｖｅｒｓ，ｓｐｌｅｅｎｓ，ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｆｒｏｍ ２０ ｄｅａｄ ｄｏｇｓ ａｔ ｔｈｒｅｅ ｐｅｔ ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ｉｎ Ｈｅｚｅ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗａｓ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｈｙｓｉｃ—ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔ，ｖｉｒｕｓ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｓｔ．Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｇｒｏｗ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ ｉｎ ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ，ｈａｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｄ ｗａｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｌｋａｌｉ ａｎｄ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ＴＣＩＤ５０ ｗａｓ １０５．８３２．Ｔｈｅ ａｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｈｉ曲ｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ． Ｋｅｖ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
犬瘟热是由犬瘟热病毒（ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＣＤＶ）引起犬科动物的一种高度接触性、 致死性的传染病，该病毒属于副黏病毒科麻疹病毒 属，该病的发病率高达１００％，死亡率在３０％一８０％ 之间，有“毁灭性传染病”之称，严重影响养犬业 的发展，并对多种毛皮动物以及珍稀动物熊猫、虎 等的生命安全构成威胁，甚至与人亚急性硬化性全 脑炎（ＳＳＰＥ）和多发性硬化症（Ｍｓ）可能存在 联系［１－３］。 该病自报道以来范围不断扩大，鉴于此，我国 许多省市都做过关于犬瘟热流行病学的调查，并根 据实际情况提出了相应的防制措施。为更好地了解 菏泽市的犬瘟热流行情况，于２０１１年对菏泽市的 ３家兽医门诊就诊的病犬的犬瘟热流行情况进行了 调查分析。 １材料与方法 １．１ 试验材料 病料来源于菏泽市畜牧局兽医站动物门诊、牡 丹区畜牧局兽医站动物门诊、专家动物门诊，经 诊断试纸确诊为感染犬瘟热死亡的犬，采集２０只 死亡犬的肝脏、脾脏、淋巴结及脑组织并保存于
．８０℃的超低温冰箱。 １．２试验动物 未接种犬瘟热疫苗的１－２月龄健康幼犬８只， ２．３月龄幼犬１６只，购自当地农户。 １．３病毒分离培养 取保存于一８０℃冰箱中的感染犬瘟热幼犬的肝 脏、淋巴结、脾脏和脑，剪碎，加入双抗，研磨后 与Ｈａｎｋｓ缓冲液以１：１０混合，反复冻融三次，４℃ ５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，再放入离心机 以１２０００ｒ／ｍｉｎ于４℃离心２０ｍｉｎ。取上清液过滤后 接种于Ｖｅｒｏ细胞培养，３７￣Ｃ ｌｈ后倾去组织悬液， 并加入维持液培养观察，同时设正常对照［４］。 将出现稳定病变的病毒培养液、ＣＤＶ阳性血 清和无血清培养物进行双向琼脂扩散试验，同时设 置对照组，并将出现稳定病变的病毒以终点稀释法
＿ 将病毒液（第４代）按照１０～、１０～、１０～、１０～、 １０～、１０～、ｌ０。稀释接种于２４孔板，每个梯度重 复３孔，收集病变的细胞孔培养液，冻融三次后再 接种细胞作扩大培养。 １．４病毒理化试验 将初步培养纯化的病毒液接种于Ｖｅｒｏ细胞， 第１０天收获病毒液，冻融三次后，４℃以１２０００ｆｆ ｒａｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液置一８Ｏ℃冰箱保存 ］。 １．４．１病毒囊膜试验 取２个５ｍＬ离心管，分别加入ｌｍＬ病毒液， 其中一管加入０．４ｍＬ氯仿，另一管对照，加入等 体积的ＤＭＥＭ，震荡１０ｍｉｎ使管内液体充分混匀， 然后于４℃以１２０００ｆｆｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上层液体 接种于细胞后３７￣Ｃ培养并观察。 １．４．２病毒核酸型试验 以１００ ｌａ Ｌ每孔的量将病毒液接种于长成单层 细胞的９６孔板中，两小时后吸出病毒液，加入按１： ４０、ｌ：５０、ｈ ２００和ｌ：１２０稀释的ＢＤＵＲ（５０ｇｇ／ ｍＬ，使用ＤＭＥＭ稀释）２０ １１ Ｌ每孔，每个梯度２ 个重复，同时设对照组。 １．４．３病毒酸碱敏感试验 将病毒液的ｐＨ调至９．０后在３７℃下作用２ｈ， 再用０．５％ＨＣ１调节ｐＨ至７．２左右，每孔加入 １００ Ｌ的ＤＭＥＭ（２％ＦＢＳ，ｐＨ７．４）作ｌ０倍梯度 稀释，每个梯度进行３孔重复，在３７℃下培养并 观察细胞病变确定病毒的耐碱特性。 将病毒液用０．５％ＨＣ１调ｐＨ至４．５，３７℃作用 ２ｈ后，再用１．４％ＮａＨＣＯ 调ｐＨ到７．２左右，其 余操作同上，确定病毒的耐酸特性。 １．４．４病毒温度敏感性试验 将病毒液稀释至１０～，５６￣Ｃ下作用３０ｍｉｎ后， 接种新长满单层细胞的９６孔板，每个梯度１２孔， 并在３７￣Ｃ下培养观察，同时设对照组。 １．４．５血凝试验 将病毒液做倍比稀释至１：６４０后分别吸取 ２５ Ｌ滴加于９６孔Ｖ型板中，依次加入２５ ｕ Ｌ生 理盐水和５０ ｕ Ｌ １％鸡红细胞混匀，于４℃和３７℃ 下作用１．２ｈ后观察血凝性，并设对照孔。按同样 的方法，观察病毒对绵羊和兔子红细胞的血凝性。 ＿ 结果判定标准： ＋＋＋＋：为１００％凝集，红细胞均匀铺于孔底， 呈伞状或荷叶状卷边。 ＋＋＋：为７５％凝集，与上基本相同，但是边缘 有少量的红细胞小凝块。 ＋＋：为５０％凝集，红细胞呈圆盘状沉于孔底， 周围有明显的小凝块。 ＋：为２５％凝集，红细胞沉于孔底，周围有少 量的小凝块。 一：为不凝集，红细胞沉于孔底，呈圆点状。 １．５病毒毒力测定 １．５．１半数感染量（ＴＣＩＤ 。）试验 在经胰酶消化后长满的单层Ｖｅｒｏ细胞中加入 含ＩＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ充分吹打，放置于３７￣Ｃ培养， 取１００ｔＪ．Ｌ经１０倍梯度稀释的病毒液加入上述长 成的单层细胞中，并设定对照，在３７￣Ｃ吸附１ｈ后 补足营养液并培养。逐日观察记录病变至１０ ｄ， 用Ｒｅｅｄ—Ｍｕｅｃｈ统计法计算分离病毒的ＴＣＩＤ 按 照同样的方法计算接毒细胞在２ｄ、４ｄ、７ｄ、９ｄ和 １２ｄ的ＴＣＩＤ５ｏ。 １．５．２病毒微量中和试验 将灭活的阳性血清作１：２、ｌ：４、１：８、１： １６、１：３２和１：６４进行６个梯度稀释，加入少 量含ｌ０％ＦＢＳ的未接毒细胞在３７℃下作用１ｈ， 以１２０００ｒ／ｍｉｎ在４℃下离心２０ｍｉｎ，取上清与 ２００ＴＣＩＤ 。病毒液等量混合，在３７℃作用１ｈ，以 １２０００ｒ／ｍｉｎ在４℃下离心５ｍｉｎ取上清，最后将上 清接种于单层细胞中，每个血清梯度４个重复，并 设置对照组，３７￣Ｃ培养观察，并计算出血清中和效 价。 １．５．３动物回归试验 选１—２月龄未免疫经诊断为犬瘟热阴性的 健康幼犬８只，分为４组，每组２只，隔离饲 养。第ｌ一３组为试验组，分别注射滴度为１×１０ ＴＣＩＤ５ｏ、３×１０ ＴＣＩＤ５ｏ、６×１０ ＴＣＩＤ５ｏ病毒液 ｌｍＬ，第４组为对照组。接毒后每目测体温２次并 观察临床症状，出现症状并死亡后立即采集肺脏、 肝脏和脾脏，浸泡于１０％的甲醛中，用于病理切片， 同时取膀胱粘膜上皮细胞，自然干燥后用甲醇固定 于接种后４—６ｄ出现体温升高，在第一次发热后 ６—８ｄ再次出现体温升高，与田克恭、遇秀玲报道 的一致。而本次试验通过犬出现食欲废绝、鼻卡他、 体温呈双相热、腹泻，眼、鼻出现脓性分泌物，剖 检见病犬肺尖出血、肝脏肿大、淋巴结肿大、腹腔 有积液、肠系膜充血脱落、脾脏边缘出血梗死等病 变，病理切片还观察到了肺脏、肝脏和脾脏的明显 病变均显示了典型的临床症状。 ３．４免疫学及血清学试验 本试验显示接种５×１０ 。ＴＣＩＤ ｍＬ的活 毒抗原的抗体水平略高于接种５×１０ 。ＴＣＩＤ 。／ ｍＬ的活毒抗原，但差异不明显（Ｐ＞０．０５），免 疫后四周抗体滴度仅达到０．３；而接种１×１０ ＴＣＩＤ如／ｍＬ的灭活抗原能刺激动物产生有效的 免疫应答反应，抗体水平在动物二免后迅速升 高，在免疫后四周抗体滴度达到Ｏ．４９，之后趋 于稳定；接种活毒抗原５×１０ ＴＣＩＤ ／ｍＬ较 ５×１０ 一ＴＣＩＤ 。／ｍＬ抗体水平略高，但差异不明 显（Ｐ＞０．０５），这和乔贵林等的报道相一致［９】， 所以本试验认为活毒抗原对动物的保护力与病毒 粒子的量呈正相关。 ４结论 ４．１ 从病料中分离得到１株犬瘟热病毒株，该毒 株能在Ｖｅｒｏ细胞上复制，ＴＣＩＤ 可达到ｌ０ ， 并引起病变，该毒株的形态、培养和理化特性均 符合犬瘟热病毒特点，是一株犬瘟热病毒，命名 为ＣＤＶ 。ＣＤＶ 对犬具有强致病性，经腹腔接种 ６×１０ ＴＣＩＤ ０／ＩＩ１Ｌ的活毒，成功复制出典型的犬 瘟热临床病症。 ４．２ 比较灭活毒与活毒的免疫原性发现，灭活 抗原比活毒抗原具有更好的免疫原性。活毒抗原 ５×１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ和５×１０ ～ＴＣＩＤ５０／ｍＬ，２ｍＬ／ 次，经腿部肌肉一次免疫，差异不明显（Ｐ＞０．０５）， 并且ＯＤ值最高仅达０．３，免疫效果低于１×１０ 。 ＴＣＩＤ５ １Ｌ的灭活抗原。采用１×１０ ＴＣＩＤ 加＝１Ｌ 的灭活抗原，２ｍＬ／次，经腿部肌肉两次免疫，可 产生较高的抗体水平，其ＯＤ值达Ｏ．４９，高效价的 抗体水平可至少维持三周，并能成功抵抗５×１０ ｌｍＬ剂量活毒的攻毒。
参考文献： 【１】Ｍｅｅ Ａ Ｐ，Ｄｉｘｏｎ Ｊ Ａ，Ｈｏｙｌａｎｄ Ｊ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎ １００％ｏｆ Ｐａｇｅｔ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｂｏｎｅ，ｌ９９８，２３（２）：１７１．１７５． ［２］Ａｐｐｅｌ Ｍ Ｊ Ｇ．Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｅｐｉｚｏｏｔｉｃ ｉｎ ｌｉｏｎｓ，ｔｉｇｅｒｓ， ａｎｄ ｌｅｏｐａｒｄｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９４，６ （３）：２７７．２８８． ［３】ＭｃＣａｒｔｈｙ Ａ Ｊ，Ｓｈａｗ Ｍ Ａ，Ｇｏｏｄｍａｎ Ｓ Ｊ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｉｎ ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ，２００７，２７４（１６２９）：３１６５—３１７４． 【４］刘彩玉，王吉贵，袁道莉，等．犬瘟热病毒反转录环介导等 温扩增诊断方法的建立［Ｊ］Ｉ中国兽医科学，２０１０，４０（４）：３６８— ３７２． ［５】Ｐｒｉｎｇｌｅ Ｃ Ｒ．Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ一１ ９９９：Ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ，ｕｐｄａｔｅｄ ｔｏ ｉｎｃｌｕｄｅ ｔｈｅ ｎｅｗ ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｒａｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇｌ９９８［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，１９９９，１４４ （２）：４２１—４２９． ［６】Ｓｅｋｕｌｉｎ Ｋ，Ｈａｆｎｅｒ－Ｍａｒｘ Ａ，Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊｅｋ Ｊ，ｅｔ ａ１． Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｉｎ Ｂａｖａｒｉａｎ ｗｉｌｄｌｉｆｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｊ，２０１１，１８７（３）：３９９—４０１． ［７］Ｃｏｎｆｅｒ Ａ Ｗ，Ｋａｈｎ Ｄ Ｅ，Ｋｏｅｓｔｎｅｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏ，１ ９７５，１ １ （４）：８３５．８４４． ［８】田克恭，遏秀玲，吴娜，等．犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴 定［Ｊ］．畜牧兽医学报，１９９８，２９（２／：１５１－１５４． 【９】乔贵林，夏咸柱，王度林，等．犬瘟热弱毒疫苗免疫犬 抗体消长规律及影响因素［Ｊ］冲国兽医学报，１９９７，１７（５）： ４４０．４４３．