犬瘟热病毒RT—PCR检测方法的建立与应用
犬瘟热RT-PCR快速诊断方法的建立
犬瘟热RT-PCR快速诊断方法的建立熊炜;王权;李健;邱璐;蒋静;李春阳;黄忠荣;胡永强【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2009(26)3【摘要】本研究建立了快速诊断犬瘟热感染的RT-PCR方法,并应用该方法对犬瘟热病死犬的脏器及感染犬体表采集样品进行了检测.为确定犬瘟热最佳的隔离检疫周期及采样部位,本研究对一例CDV攻毒犬感染病程收集的口鼻液、粪便、尿液样品进行了对比检测,结果证实粪便、口鼻液等易于获取的样品中CDV病毒滴度较高,并可在发病全程检测到,因此,它们可作为理想的受试样品.【总页数】3页(P38-40)【作者】熊炜;王权;李健;邱璐;蒋静;李春阳;黄忠荣;胡永强【作者单位】上海出入境检验检疫局,上海200135;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,200232;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135;上海出入境检验检疫局,上海200135【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5【相关文献】1.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病RT-PCR快速鉴别诊断方法的建立与临床应用[J], 刘忠华;丁建;余兴龙;李润成;黄泽彬;廖立珊;白霞;李晶;向卫军;汪镇南2.高致病性禽流感RT-PCR快速诊断方法的建立 [J], 彭晓玲;兰玲;马亚珍;成进3.RT-PCR技术快速诊断犬瘟热 [J], 张汇东;朱骞4.猪乙脑RT-PCR快速诊断方法的建立 [J], 冯永胜;江科;衣服德5.Real-time RT-PCR和RT-PCR方法快速检测犬瘟热病毒 [J], 熊炜;王权;李健;蒋静;张强;邱璐;李春阳;黄忠荣;胡永强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬瘟热病毒荧光定量RTPCR检测方法的建立及应用
犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用苏乔1，余绍华¨，苏力3，蔡勤辉3，陈武3，陈虹1，黄晓卉1，罗满林p(1．中山大学附属第一医院，广东广州510080；2．华南农业大学兽医学院，广东广州510642；3．广州动物园，广东广州510070)【摘要l目的建立犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法。
方法根据犬瘟热病毒的核衣壳蛋白(N)基因保守序列，设计特异性引物，建立犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法。
结果与结论试验结果表明，该方法敏感性比普通RT-PCR高出100倍，重复性良好，变异系数在1．01％以下，对犬的常见病原核酸提取物检测均为阴性，证明特异性良好。
对32份临床样本进行检测，27份为阳性，高于普通R T-PCR方法。
试验结果表明该方法可用于犬瘟热感染情况的检测。
l关键词l犬瘟热病毒；核衣壳蛋白(N)基因；荧光定量RT-PCR；建立Establishment and Application of Real-time RT-PCR Method for Detectionof Canine Distemper VirusSu Qiaoi．Yu Shaohuat Su ZL Cai Qinhuit Chen Wu3,ChenHongi．Huang Xiaohui7，Luo Manlin2+仃．砌e Firs t Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Gua ngzh ou510080,China2．College of Veter in ary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou510642,China3．Guangzhou Zoo，Guangzhou510070,China)[Abstract]0bieetive Establish real．time Kr-PCR method for the detection of CDV Methods On the basis of nucleocapsid protein(N)gene conservation sequence of the canine distemper virus(CDV)，a pair of specific研mers was designed to es ta bli sh real．time RT-PCR method for the det ec ti on of C DV Results and Conclusions The results showed that the sensitivity of this method was l OO times greater than that of IU二PCR．This method has good reproducibility coefficient of v a ri at io n Was less than 1．0 1％．Pathoge ns associated with canine were not amplified by this method which prov ed it s e xc el l en t specificity．For clinical appli ca t io n．27 po si tiv e samples were detected from32clinical samples in the test．This result revealed that real．time Rr．PCR Can be used for the detection of canine distemper infection．[Key words]CDV；r eal-t ime RT-PCR；nucl eoc apsi d protein(N)gene犬瘟热是由犬瘟热病毒(Cani ne distemper virus，CDV)，所致的一种急性高度接触性传染病，能引起犬科、鼬科、浣熊科等多种动物发病，发病率几乎达100％，易继发二次感染‘11。
犬瘟热病毒RT—PCR检测方法的建立及其临床应用
３ 、Ｏ次 ， 定 最 适 反 应体 系 和 反应 条件 。 ５４ 确
１ ２ ４ 特 异 性 和 敏 感 性 鉴 定 ： Ｐ Ｒ 产 物 经 紫 外 分 光 光 度 ． ． 将 Ｃ
计测定 Ｄ ＮＡ 浓 度 ； 时 对 其 做 ６个 １ 同 Ｏ倍 稀 释 度 的 倍 比 稀 释 ， 行 敏 感 性 试 验 。同 时 在 相 同 条 件 下 利 用 已 有 毒 株 和 疫 进
序 列 进行 ｂａ ｔ 析 。 ｌ 分 ｓ
发感 染 ， 床 症 状 表 现 复 杂 ， 临 床 症 状 只 能 作 出 初 步 的 诊 临 靠
断， 只有 将 临 床 症 状 与 实 验 室 检 查 结 合 起 来 才 能 进 行 确 诊 。本 研 究 针 对 Ｃ Ｖ 特 异 保 守 的 Ｆ 基 因 设 计 引 Ｄ
年 代 起 ， 内部 分 省 区 的皮 毛 动 物 饲 养 场 不 断 暴 发 本 病 ， 国 并 逐 渐 在 全 国 范 同 内 流 行 。 犬 瘟 热 病 毒 经 常 与其 他病 毒混 合 感 染 ， 引 起 细 菌 的 继 或
上海 英俊 公 司 测 序 ， 用 Ｄ 应 ＮＡｓ ｒ软 件 将 所 测 序 列 与 登 录 ｔ ａ
取具有犬瘟热病毒病典 型症状 的病 犬病料 包括 血液 、 液 、 尿 唾 液 、 拭 、 分 泌 物 等 ， ２倍 体 积 的 Ｐ Ｓ稀 释 ， 织 匀 浆 ， 鼻 眼 用 Ｂ 组 加 入 １ ５体 积 的 氯 仿 ， 浴 乳 化 ３ ｎｎ ５０ ０ｒｒｉ ／ 冰 ０ｒｉ， ０ ／ ｎ离 心 ａ
明该 方 法可 用 于 为 Ｃ Ｖ 临 床 快 速诊 断 及 流 行 病 学 调 查 。 Ｄ
水貂犬瘟热病毒RT-PCR检测方法建立及应用
Ｇ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｇ ３ ） 。
黏病毒科 （ Ｐ ａ ｒ ａ ｍｙ ｘ ｏ ｖ ｉ ｒ ｉ ｄ ａ ｅ ）麻疹病毒 属 （ Ｍｏ ｒ ｂ ｉ ｌ ｌ ｉ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ） 。形状
１ ． ５ ｍ ｌ离 心 管 中 加 入 ２ ５ ０ ￣ １ １组 织 液 ：加 Ｔ Ｒ Ｉ ｚ ｏ ｌ Ｌ ｓ ０
Ｒ ｅ ａ ｇ ｅ ｎ ｔ ７ ５ ０ ｔ ｘ ｌ ，颠倒 ６ — ８次 ，４ ￣ Ｃ 静止 ５ ｍ ｉ ｎ ；加 ２ ０ ０ ￣ １ 氯仿充 分震荡 ，在 ４ ￣ Ｃ 冰箱 ，静止 ｌ Ｏ ｍｉ ｎ ；４ ℃离 心 １ ２ ０ ０ ０转 １ ５ ｍｉ ｎ ；
Ｒ ｎ ａ ｓ ｅ － Ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｏ ｒ 、Ｄ Ｎ Ａ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ（ Ｄ Ｌ ２ ０ ０ ０ ） ；Ａ ｇ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ琼 脂 糖 ；
１ ０ ０ ０ １ ｘ ｌ ，离 心 ５ ｍｉ ｎ ，弃 上清液 ，干燥 核酸 ；加 ２ ０ ｐ Ａ Ｄ Ｅ Ｐ Ｃ水 溶解一 ２ ０ ℃保存 ，备用 。
１ ． ２ ． ３ Ｃ Ｄ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 的反 转 录
异 丙醇 、无水 乙醇、Ｄ Ｅ Ｐ Ｃ水 、氯仿 、琼脂粉等 。
１ ． １ ． ３ 仪器设备 超净工作 台、台式高速冷冻离心机 、Ｐ Ｃ Ｒ扩增仪 （ Ａ ｌ ｐ ｈ ａ Ｕ ｎ ｉ ｔ Ｂ ｌ ａ ｃ ｋ Ａ ｓ ｓ ｅ ｍ ｂ ｌ ｙ Ｐ Ｃ Ｒ、Ｐ Ｔ Ｃ 一 ２ ０ ０ ） 、４ ２ ℃可调恒温水浴锅 、 高速离心机 、微波 炉 、电子天平 、Ｄ Ｙ Ｙ — ｍ一 ７型、Ｄ Ｙ Ｙ一 １ １ １ — ８ Ｂ核酸电泳仪 、紫外凝胶成像系统 。 １ ． １ ． ４ 检测的组织病 料来 源及病料采集方法 某 新建 貂场 饲养 水貂 １ ６ ０ ０只 ，其 中 ４ ４日龄 断奶 幼貂 ｌ １ ０ ０只 ，２ ０ １ ６ 年 ４月 ２ ３日突然发病 １ ７ ６只，死亡 ｌ １ ４只。 无 菌操作剪 取 １ ． ０ ～ ２ ． ０ ｇ 病 料 ，加 少量灭 菌 Ｐ Ｂ Ｓ ｆ 含青 霉 素 、链 霉素） ，注意边研磨 边加液氮 ，防止 Ｒ Ｎ Ａ被降解 。用 Ｐ Ｂ Ｓ按 １ ： ４稀释成悬液 ，一 ２ ０ ￣ Ｃ 反复冻 融 ３次 ，４ ℃１ ０ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ 离心 １ ０ ｍｉ ｎ ，取上 清，一 ７ ０ ℃保存。
犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用
犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用余绍华;罗满林;苏力;蔡勤辉;陈武;陈虹;黄晓卉;苏乔【期刊名称】《广东畜牧兽医科技》【年(卷),期】2013(038)002【摘要】根据犬瘟热病毒的核衣壳蛋白(N)基因保守序列,设计特异性引物,建立犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法.试验结果表明,该方法敏感性比普通RT-PCR 高出100倍,重复性良好,变异系数在1.01％以下,对犬的常见病原核酸提取物检测均为阴性,证明特异性良好.对32份临床样本进行检测,27份为阳性,高于普通RT-PCR方法.试验结果表明该方法可用于犬瘟热感染情况的检测.【总页数】5页(P35-39)【作者】余绍华;罗满林;苏力;蔡勤辉;陈武;陈虹;黄晓卉;苏乔【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;广州动物园,广东广州510070;广州动物园,广东广州510070;广州动物园,广东广州510070;中山大学附属第一医院,广东广州 510080;中山大学附属第一医院,广东广州 510080;中山大学附属第一医院,广东广州 510080【正文语种】中文【中图分类】S85【相关文献】1.犬瘟热病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 杨井泉;韩猛立;朱艳平;黄新;薄新文2.犬瘟热病毒原液TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立 [J], 魏斌;彭广能;钟志军;田一男;李平;石梅;曹雪峰;肖启程;涂蕊;但佳明;杨亭玉3.TaqMan荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立与初步应用 [J], 吕品;胡传伟;谢之景;杨笃宝;任月4.鉴别犬瘟热病毒强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立 [J], 由丛华;张传美;张洪亮;秦志华;杨海燕;单虎5.PPRV、RVFV、SBV三重普通及实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用研究 [J], 赵文华;李富祥;杨仕标因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬瘟热、犬细小病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
犬瘟热、犬细小病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用犬瘟热（Canine Distemper，CD）和犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是近几年来常见的犬类传染病，二者对犬只的健康构成了严重威胁。
能够准确、快速地检测和诊断这两种病毒感染对于犬只的治疗和控制措施至关重要。
因此，本研究针对犬瘟热和犬细小病毒的检测方法进行了研究和建立。
首先，我们收集并准备了一定数量的狗狗样本，包括鼻拭子、咽拭子等。
然后，我们进行了犬瘟热和犬细小病毒的核酸提取并合并提取物，以便于后续的实验检测。
接下来，我们设计了特异性良好的引物和探针，以便在PCR反应中识别和扩增目标病毒的核酸序列。
在选择PCR方法时，我们考虑到了实时荧光定量PCR的优势。
实时荧光定量PCR（Real-time FluorescentQuantitative PCR）不仅可以定量分析目标病毒的核酸水平，还能在PCR反应过程中实时监测扩增曲线，并且具有高灵敏度和特异性。
因此，我们选择了实时荧光定量PCR作为我们的检测方法。
接下来，我们在合适的实验条件下对PCR体系进行了优化，并进行了反应体系中酶的最佳浓度、模板DNA的最佳用量、引物和探针的最佳浓度等因素的优化试验。
通过不断调整和优化，我们建立了比较稳定和可靠的实时荧光定量PCR检测方法。
为了验证我们建立的检测方法的准确性和可靠性，我们选取了已知感染犬细小病毒和犬瘟热的样本进行了实验检测。
结果显示，我们的实时荧光定量PCR方法可以成功地检测到目标病毒的核酸序列，并且与其他常用检测方法的结果相一致。
在进一步的应用中，我们还测试了一些实际临床样本。
结果显示，我们的实时荧光定量PCR方法不仅可以对犬瘟热和犬细小病毒进行可靠的检测，而且具有高灵敏度和特异性。
因此，我们的方法可以应用于疫情监测、疫苗评估和临床诊断等方面。
总结起来，我们成功地建立了一种犬瘟热和犬细小病毒的实时荧光定量PCR检测方法。
快速诊断犬瘟热疫病一步法的建立与应用
快速诊断犬瘟热疫病一步法的建立与应用施妮莎（苏州市动物卫生监督所，江苏苏州２１５０００）摘 要：犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒（ＣＤＶ）引起的犬和肉食目中许多动物感染的一种高度接触性传染病。
世界各地都有发生，病死率很高，可达３０％～８０％，是当前危害养犬业的重大疫病之一。
设计一段ＰＣＲ的引物快速诊断检测犬瘟热（ＣＤＶ）是目前最常用的方法：针对其保守片段Ｎ蛋白，设计一段引物进行ＲＴ－ＰＣＲ的快速检测，产物的大小在４９１ｂｐ，与犬细小、犬肝炎无意义。
关键词：犬瘟热；ＲＮＡ；ｃＤＮＡ；ＲＴ－ＰＣＲＤＯＩ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０２０．０６．０６６ 引言犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒（ＣＤＶ）引起的犬和肉食目中许多动物感染的一种高度接触性传染病。
世界各地都有发生，病死率很高，可达３０％～８０％，是当前危害养犬业的重大疫病之一［２］。
犬瘟热的感染范围广泛，自然宿主包括犬科动物（犬、狼、豺、狐等）、鼬科动物（貂、臭鼬、黄鼠狼等）、浣熊科动物（浣熊、小熊猫、大熊猫等），还可感染灵长类动物（如日本猕猴），甚至有犬瘟热感染人的病例［１］。
犬瘟热是单负链ＲＮＡ病毒，除病毒分离、病理包涵体检查、血清学检测、盐酸探针、原位杂交等方法外，ＲＴ－ＰＣＲ方法是目前检测犬瘟热最常用的方法［１］。
本实验运用ＲＴ－ＰＣＲ快速检测犬瘟热病毒感染。
实验材料１．１ 病料的来源本实验所使用的病料来源于交易市场，经进口试剂盒检测为阳性样本。
１．２ 主要试剂和材料ＵＮＩＱ柱式Ｔｒｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）；ＥａｓｙＳｃｒｉｐｔＴＭＴｗｏ－ＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；无水乙醇；氯仿；５０倍浓缩ＴＡＥ缓冲液；２％的胶；Ｇｏｌｄｖｉｅｗ，Ｉ型核酸染色剂（Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司）；２％的电泳液；Ｍａｋｅｒ（ＤＬ２０００）；超纯水；灭菌指型管；冰盒。
犬瘟热病毒快速检测方法建立和F基因克隆及序列分析的开题报告
犬瘟热病毒快速检测方法建立和F基因克隆及序列分析的
开题报告
研究背景：
犬瘟热是一种严重传染性疾病，病原体是犬瘟热病毒，可以导致犬只出现呼吸道、消化道、中枢神经系统和免疫系统等多种症状，甚至死亡。
为了及早诊断和治疗犬只
的犬瘟热病毒感染，需要建立一种快速、准确且敏感的检测方法。
F基因是犬瘟热病毒的重要结构蛋白，其在病毒复制和传播中发挥着重要作用。
因此，对F基因进行克隆和序列分析，可以帮助我们更好地了解犬瘟热病毒的生物学
特性和基因表达调控机制等方面的问题。
研究内容：
1、建立犬瘟热病毒快速检测方法
通过文献调研和实验验证，选择合适的探针和引物，对犬瘟热病毒进行PCR扩增，建立一种可靠的病毒快速检测方法，并对其灵敏度和特异性进行检测和验证。
2、进行F基因克隆及序列分析
通过现有犬瘟热病毒序列比对分析，确定F基因的保守区域，再进行PCR扩增
并克隆到表达载体中。
对克隆的F基因进行序列分析，揭示其在病毒复制和传播中的
生物学意义。
研究意义：
本研究将建立一种快速、准确且敏感的犬瘟热病毒检测方法，为及早诊断和治疗犬瘟热病毒感染提供了一种经济有效的手段。
同时，通过对F基因的克隆和序列分析，可以更全面地了解犬瘟热病毒的生物学特性和基因调控机制，为疾病的预防和治疗提
供有力的科学依据。