应用MLST系统进行中国幽门螺杆菌的分子流行病学探究

第三军医大学硕士学位论文应用ＭＬＳＴ系统进行中国幽门螺杆菌的分子流行病学研究

摘要目的：幽门螺杆菌（肌№Ｄ施ｃ纪，＿ｐｙｆＤ一，ＨｐｙｆＤ“）是一种螺旋状、微需氧、革兰阴性杆菌，属于螺杆菌属，定植于人胃黏膜表面。人类是其唯一的天然宿主，现已证实Ｈｐ），幻一

感染与慢性胃炎、消化性溃疡和胃黏膜相关组织淋巴瘤（ＭＡＬＴ）的发生密切相关。幽门螺杆菌的致病性主要体现在毒力因子和机体的遗传易感性两个方面。人类对Ｈｐｙ幻ｒｆ

普遍易感，但感染后的症状轻重各不相同，表现出明显的致病性差异，轻者可长期无症

状携带，重者可引起慢性胃炎、溃疡甚至胃部肿瘤。其原因与菌株型别的毒力强弱相关，和宿主的遗传易感性有紧密的相关性，从而导致了Ｈｐ），幻订的感染致病存在人种、

地域、环境卫生、营养等显著差异性。近年来发展较快的分子生物学技术为细菌的分型提供了强大的工具，分型结果可达到基因水平。多位点序列分型（Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ，ＭＬＳＴ）具有很高的分辨能力，既适用于流行病学研究，也可用于分子进化学的研究．因此，本研究拟应用ＭＬＳＴ系统对不同地区分离的Ｈｐｙ励一菌株进行基因水平的分型，确定不同地区感染Ｈｐｙ励厂ｆ的主要类型，并与国际流行克隆株进行比较，了解它们的遗传背景和可能的来源，使得流行病学研究可以从表型特征的鉴别深入到基因特征的鉴定，探索基因在核酸水平的变化过程。方法：１．收集４个不同地区（北京、重庆、广州、上海）的幽门螺杆菌感染患者的临床分离株。在患者进行胃镜检查时取胃窦部的活检组织，标本在含５％兔全血的ＢＨＩ培养基上培养４ｄ．阳性菌株置于一７０℃条件保存。２．复苏保存的Ｈｐｙ励一菌液，传代培养后提取细菌基因组ＤＮＡ，采用天成公司的细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒进行操作。３．根据文献筛选幽门螺杆菌的８个看家基因作为ＭＬＳＴ的目的基因，分别为鲫岿，咖，ｍＭｆｙ，即日，ｆ印Ｃ，Ｍ比Ｊ，１，以ｃＡ，即忍Ｃ。分别扩增８个基因的内部核酸序列片段，从３９８ｂｐ～６２７ｂｐ。获得的ＰＣＲ扩增产物均进行核酸纯化和ＤＮＡ序列分析。将ＤＮＡ序列信

７第三军医大学硕士学位论文息进行ＭＬＳＴ分析，得到菌株的等位基因图谱。确定Ｈｐｙ肠一临床分离株的序列分型（ＳｅｑｕｅｎｃｅＴｙｐｅ，ＳＴ），并与国际菌株进行比较。应用ＢＵＲＳＴ（ＢａｓｅｄＵｐｏｎＲｅｌａｔｅｄ

ＳｅｑｕｅｎｃｅＴｙｐｅｓ）运算规则将菌株归为各个谱系组（ｃｌｏｎａｌｃｏｍｐｌｅｘ），应用ＳＴＡＲＴ程序计算相关系数（ｉｎｄｅｘｏｆａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，厶）并进行系统进化树的构建。４．针对ｖ以ｃＡ基因信号区及中间区序列设计引物，检测Ｈｐｙ如ｒｆ的等位基因，１，日ｃＡｓｌａ、ｖ口ｃＡｓｌｂ、ｖ以ｃＡｓ２、ｖ以ｃＡｍ１、ｖ以ｃＡｍ２。确定菌株所属的ｖ以ｃＡ基因亚型。结果：１．ＰｃＲ扩增所筛选的Ｈｐ），励一的８个管家基因的核心核酸片段，对４０株日．ｐｙ励以临床分离株进行ＭＬＳＴ分析，８个基因座位多态性位点从ａｔｐＡ的１．７７％到ｍｕｔＹ的３．８６％不等。一共获得了３８个ＳＴｓ序列型，均为在幽门螺杆菌ＭＬＳＴ数据库中未报道的。２．菌株核酸序列的ＳＴ型结果按类平均数聚类方法（ＵＰＧＭＡ）绘制进化树，得到的样本菌株树形聚类图，显示了菌株的亲缘关系，可将４０株ＨｐｙｆＤ订菌株大致分为三大类。３．ｖ口ｃＡ基因分型结果，ｖ口ｃＡｓｌａ阳性为３３株（８２．５％），ｖ以丛ｓｌｂ阳性为７株（１７．５％），

ｖ口ｃＡｍ２阳性为３９株（９７．５％），未发现Ｊ２型菌株，其中标准株ＮＣＴＣｌｌ６３７和１１６３８的结果为ｖ口ｃＡｓ１“ｍ１型。结论：１．首次应用ＭＬｓＴ的方法对中国４个大城市的ＨｐｙＺＤ一临床分离株进行了研究，本实验中等位基因的多样性与Ｈｐｙ胁一ＭＬＳＴ数据库中之前的研究结果差异不大。所得到的ＳＴｓ序列型，不属于原有的谱系。同时Ｓｉｎ９１ｅｔｏｎ序列型在本实验中占了大部分（９５％），与其它基因型相比它们代表了遗传距离较远的基因型。２．对幽门螺杆菌菌株进行了ｖ口ｃＡ基因分型，结果以ｓ１“ｍ２型为主，消化性溃疡组与慢性胃炎组之间ｓｌａ型有显著性差异，而ｍ２型差异无显著性。提示可能从消化性溃疡患者胃粘膜标本中分离出ｖ以ｃＡｊＪｆ口型的可能性高于其他慢性胃炎的患者，而１，口ｃＡｍ１、

ｍ２型则与Ｈｐｙ胁一相关胃部疾病的相关性不大。

３．由于样本量的限制，ｖ日甜基因分型结果与ＭＬＳＴ序列型之间未发现明确关联，但是可以相信随着ＨｐｙｆＤ—ＭＬＳＴ数据的增加，可以更加明确基因型间的遗传相关性。

关键词：幽门螺杆菌；多位点序列分析；ｖ以ｃＡ基因；管家基因；序列型第三军医大学硕士学位论文ＧｅｎｅｔｉｃＤｉＶｅｒｓｉｔｙａｎｄｙ口（’ＡａＵｅｌｅｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｉｎ

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