HPLC-UV法测定黄芪干燥根中黄芪甲苷的含量

安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２０１４，４２（２２）：７３８１—７３８３责任编辑黄小燕责任校对李岩ＨＰＬＣ—ＵＶ法测定黄芪干燥根中黄芪甲苷的含量姜丽丽１，张传领孙，苏丽娟３，王秀娟１，牛丽丽１，温建勋１（１．内蒙古医科大学分子病理学实验室，内蒙古呼和浩特

０１００５９；２．内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特０１００５９；３．内蒙古医科大学法医鉴定中心，内蒙古呼和浩特０１００５９）

摘要［目的］建立黄芪干根中ＨＰＬＣ—ｕＶ法测定黄芪甲苷的方法，同时比较蒙古黄芪、野生黄芪和膜荚黄芪３种不同来源样本的黄芪甲苷含量。［方法］采用ＨＰＬｃ—ｕＶ法，色谱柱为ＫｒｏｍａｓｉｌＣ．。柱（２５０ｍｍｘ４．６ａｉｍ），流动相为乙腈：水（３２：６８），流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ，检测波

长２０３ａｍ。［结果］黄芪甲苷在０．０５～０．５０

ｍｇ／ｍｌ范围内线性关系良好（ｒ＝０．９９９），平均回收率为９８．２１６％（ＲＳＤ＝２．８５％）；不同来源

黄芪甲苷含量比较结果为野生＞膜荚一蒙古。［结论］建立的ＨＰＬＣ—ｕＶ法测定黄芪甲苷含量相对稳定，方法简便，为今后黄芪干根中

黄芪甲苷含量的测定提供了方法参考。关键词ＨＰＬＣ—ＵＶ；黄芪甲苷；含量；干燥根中图分类号Ｓ５６７文献标识码Ａ文章编号０５１７—６６ｌｌ（２０１４）２２—０７３８１—０３

ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅＩＶｉｎｔｈｅＤｒｙｉｎｇＲｏｏｔｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｐｐｂｙＨＰＬＣ－ＵＶＪＩＡＮＧＬｉ－ｌｉ，ＺＨＡＮＧＣｈｕａｎ－ｌｉｎｇｅｔａｌ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙＬａｂ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＭｅｄｉｃａｌ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ

０１００５９）

Ａｂｓｔｒａｃｔ［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＡｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅＩＶｉｎ

Ａｓｔｒａｇａｈｕｓｐｐ．ｄｒｙｒｏｏｔｂｙＨＰＬＣ—ｕＶ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｏ

ｃｏｍｐａｒｅＡｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅＩＶｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｒｅｅｌｉｆｅｆｏｒｍｓＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｐｐ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＡＫｒｏｍａｓｉｌＣｌ８ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ），ａｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：ｗａｔｅｒ＝３２：６８ｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｆｌｏｗｒａｔｅｌ．０ｍｌ／ｍｉｎａｎｄａＵＶｄｅｔｅｃｔｏｒａｔ２０３Ｂｍｗｅｒｅ

ａｄｏｐｔｅｄ．［Ｒｅｓｅｔ］Ａｓｔｒａｇａｌｏ—

ｓｉｄｅＩＶｈａｓａｌｉｎｅａｒｌｉｍｉｔｏｆ０．０５—０．５ｍｇ／ｍｌ（ｒ＝０．９９９），ａｍｅａｎｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｃｉｐｒｏｆｉｂｒａｔｅｉｓ９８．２１６％（ＲＳＤ＝２．８５％）．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＡｓ—

ｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅＩＶｉｎｗｉｌｄｔｙｐｅｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＡｓｔｒａｇａｌｕｓｐｅｎｄｕｌｉｆｌｏｒｕｓｓｕｂｓｐ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓａｎｄＡｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｕｎｇｅ）．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＴｈｅＨＰＬＣ—ＵＶｍｅｔｈｏｄｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｔａｂｌｅａｎｄｓｉｍｐｌｅ．ＩｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅＩＶｉｎ

Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｓｐｐ．

ＫｅｙｗｏｒｄｓＨＰＬＣ—ＵＶ；ＡｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅＩＶ；Ｃｏｎｔｅｎｔ；Ｄｒｙｒｏｏｔ

黄芪为常用的中药材之一，始载于《神农本草经》，我国历版药典均有收载。黄芪是豆科植物蒙古黄芪［Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｒｎｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．ｖａｔ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ（Ｂｇｅ．）Ｈｓｉａｏ］或膜荚黄芪［Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｒｍｚ＇ｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．］的干燥根，味甘性微温，具有补气固表、利尿脱毒、排脓、敛疮生肌之功效¨１。黄芪中主要成分为皂苷类、黄酮类、多糖类等，其中的黄芪甲苷是黄芪药材中的重要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、清除自由基、增强免疫力、降糖和改善心血管疾病等作用嵋。４。。黄芪甲苷的含量是评价黄芪及其制剂质量的重要指标，且许多中成药也以黄芪甲苷作为该品种的指示成分，在《中国药典》中黄芪甲苷被作为黄芪质量检测的标志物。笔者在前人研究’５“ｏ的基础上，试用ＨＰＬＣ—ｕＶ法测定黄芪干燥根中的黄芪甲苷含量，同时对野生、膜荚、蒙古３种不同来源的黄芪样本进行了黄芪甲苷含量比较。ｌ材料与方法１．１材料与试剂１．１．１材料。人工栽培样本为２年生的来自内蒙古兴和、达茂旗、赤峰（蒙古黄芪）、兴安盟（膜荚黄芪）的黄芪干燥根以及来自甘肃的黄芪干根切片（成品）；野生黄芪为采自内蒙古武川县的多年生黄芪。１．１．２试剂。黄芪甲苷对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：１１０７８１—２００６１３），Ｄ１０１型大孔吸附树脂（购自沧州宝吸附材料有限公司），色谱级甲醇、色谱级乙腈、水饱和基金项目作者简介收稿日期内蒙古自然科学基金资助（２０１２ＭＳ０５２９）。姜丽丽（１９７８一），女，内蒙古呼伦贝尔人，实验师，硕士，从事药用植物分子生物学研究。＋通讯作者，助理研究员，博士，从事药用植物学研究。２０１４．０６－３０正丁醇、氨水溶液、去离子纯水、无水乙醇。１．１．３仪器及耗材。ＴＬ－２０１０高通量组织研磨仪、旋转蒸发仪（ＲＶｌ０）、岛津高效液相色谱仪（ＬＣ．２０Ａ型，紫外检测器）、电子天平、水浴锅、超声波清洗器、索式提取器、玻璃层析柱、圆底烧瓶、分液漏斗、０．４５仙ｍ虑器等。１．２试验方法１．２．１黄芪甲苷的制备。研磨后精密称取４ｇ黄芪粉末于

索式提取器中，按药典…的方法提取，用５ＩＴｌｌ色谱级甲醇定

容，最后用０．４５“ｍ滤器过滤于棕色样品瓶中，４℃保存备用。１．２．２对照品溶液制备。精密称取黄芪甲苷０．００２５ｇ，加

甲醇定容至５ｒ１１ｌ容量瓶中，摇匀。用０．４５“ｍ滤器过滤后，

转至棕色瓶中４℃保存。１．２．３色谱条件与系统适用性。色谱柱为ＫｒｏｍａｉｌＣ。。柱

（２５０ｎｑ／ｎ×４．６ｍｍ），流动相为乙腈一水（３２：６８），流速为１．０

ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长为２０３ｍｍ，柱温箱３５℃。１．２．４测定法。自动进样器吸取对照溶液和供试品溶液各

２０斗ｌ上样，进入高效液相色谱仪，测定，记录色谱峰面积，以外标一点法计算含量。１．２．５方法学的建立。从线性范围、精密度、稳定性、重复性、回收率５个方面对ＨＰＬＣ—ＵＶ法测定黄芪甲苷含量进行方法学考察。１．２．６样品含量测定。用上述建立的方法，对不同地区及

来源的黄芪样品进行甲苷含量测定，进一步比较其含量差异。２结果与分析２．１线性范围精密称取黄芪甲苷标准品，适量，加甲醇制成对照品溶液（相当于每１ｒｎｌ含０．５ｍｇ黄芪甲苷），精密

万方数据７３８２安徽农业科学２０１４定量取１．０、２．０、４．０、６．０、８．０ｍ１分别置于１０ｒｎｌ量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。取上述溶液各２０斗ｌ，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以黄芪甲苷峰面积为纵坐标Ｙ、溶液浓度为横坐标Ｘ，得到回归方程为Ｙ＝２Ｘ１０６Ｘ一５９４０，Ｒ２＝

０．９９９（ｎ＝５），结果表明，在０．０５—０．５０ｍｇ／ｍｌ，范围内，黄芪甲苷对照品浓度与色谱峰面积值呈良好的线性关系（图１）。黄芪甲苷浓度Ⅳ嘞恤图１黄芪甲苷标准曲线２．２精密度考察取黄芪甲苷对照品溶液（０．５ｍｇ／ｍ１）２０山注入液相色谱仪，连续测定６次，其色谱峰面积分别为７４８５７５、７４４８１９、７４９９６６、７４３２３９、７４０９１２、７４９２０４，相对标准偏差ＲＳＤ为０．４８％，表明该测定方法精密度非常好。２．３稳定性考察取样品（产地达茂旗），按含量测定中供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，分别在放置０、２、４、６、８、１０、１２ｈ时，按以上色谱条件及测定法测定，结果发现其光谱峰面积分别为２７６７５２、２６９９０７、２７０５５４、２７６９１ｌ、２７８４２６、２６６７１５、２５６１６７，相对标准偏差为２．８７％，可见供试品溶液在１２ｈ内基本稳定。２．４重复性考察取同一批次样品（甘肃）４份，分别按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，再按以上色谱条件及测定法测定，并计算每份样品中黄芪甲苷的含量。结果发现，４份样品的光谱峰面积平均为１２２３７４，ＲＳＤ＝２．９３％，表明该方法重复良好。

２．５回收率考察精密量取同一批号已知含量（０．５５２ｍｇ／ｍ１）的供试品溶液，分别与等量黄芪甲苷对照品溶液（０．０１、０．５０、１．１０ｍｇ／ｍ１）混合，制备高、中、低３种浓度的供试品溶液，每浓度平行操作３份，并按上述色谱条件及测定法测定，计算回收率。由表１可见，回收率在９１％～１０１％的范围内，平均回收率为９８．２１６％（ＲＳＤ＝２．８５％，ｎ＝９），回收率和测定误差均符合含量测定要求。２．６样品含量检测经测定，达茂、兴河、甘肃不同产地黄芪的黄芪甲苷含量分别为０．３６１、０．１４３、０．１６１ｍｇ／ｇ，蒙古、膜荚、野生不同来源黄芪的黄芪甲苷含量分别为０．２０３、０．２２１、０．４１０ｍｇ／ｇ，比较其差异性（图２）发现，黄芪甲苷含量不同产地的测定结果是达茂＞甘肃＞兴河，不同来源的测定结果是野生黄芪＞膜荚黄芪一蒙古黄芪。

表１回收率试验结果。。。甲苷测得量甲苷加入量回收率平均回收ＲＳＤ骊芎ｍｇ／ｒａｍｇ／ｍｌ％率∥％％

ｌ０．２５７０．２８１９１．６３２２０．２７５０．２８１９７．９５６３０．２８３０．２８１１００．６３６４０．５１４Ｏ．５２６９７．８０９５０．５２１０．５２６９９．０４９９８．２１６２．８５０６Ｏ．５１５０．５２６９７．９０３７Ｏ．８２１０．８２６９９．３７１８Ｏ．８１００．８２６９８．０３４９０．８３９０．８２６１０１．５５０

时间Ⅳｍｉｎ时间Ⅳｍｉｎ图２标准品（ａ）和不同来源样品（ｂ）色谱图２．７层析与未层析的比较该试验对同一样品（甘肃）进行繁琐，背景干扰多，误差较大；后者空白吸收值高，受时间因

了通过Ｄ１０１大孔吸附树脂柱层析与不层析的比较，结果发现层析峰面积为１１８６０６，未层析峰面积为６４５２８，且层析后样品甲苷含量值高于未层析，其与标品的重叠对比如图３所示。３结论与讨论关于黄芪甲苷的检测方法有很多，但各自有其不同的缺点，如已有的薄层扫描法和香草醛一硫酸比色法，前者操作素干扰大，均难以准确测定。近年来用高效液相色谱法检测药材中成分含量成为一种主流，如《药典》中用的液相色谱法，用蒸发光散射器（ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ）对黄芪甲苷含量检测做了详细论述，但蒸发光散射器在使用过程中与紫外检测器（ｕＶ）相比，蒸发光散射器和高效液相色谱连接时需要信号转换，转换器价格昂贵、使用不便，还需要配置高压氮气或空气，且试验中产生废气有害；而紫外检测法则不仅灵敏度高、