分子生物学技术

载体构建

通过载体构建的方法可将目的基因构建在真核/原核表达系统中，然后运送至受体细胞中，在该细胞中实现目的基因的过表达、KD等。我们公司拥有丰富的载体资源，包含慢病毒载体、腺病毒载体、逆病毒载体以及多种过表达载体、Knock down等，能够实现含目的基因的病毒包装及过表达、KD等。

载体架构流程图

GST pull-down

1.技术简介

GST pull-down实验是一个有效验证酵母双杂交系统的体外试验技术。将靶蛋白质-GST融合蛋白质亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白质亲和的支撑物，充当一种\“诱饵蛋白质\”，目的蛋白质溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的\“捕获蛋白质(目的蛋白质)\”，洗脱结合物通过SDS-PAGE 电泳分离，最后经western blot，从而证实两种蛋白质间的相互作用；\“诱饵蛋白质\”和\“捕获蛋白质\”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白质、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

2.实验原理

利用重组技术将PES1蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合表达，融合蛋白通过GST与琼脂糖微球上结合的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，如果PES1与NPM1之间有直接相互作用，当结合了PES1蛋白的GTH微球的与含有NPM1蛋白的细胞裂解液混合孵育，再通过离心富集GST微球，得到的样品中可以检测到NPM1。

3.实验目的

在体外检测NPM1(nucleophosmin )与Pes1(pescadillo)之间的直接相互作用，确定PES1与NPM1相互作用的结构域。

4. 实验流程

5.技术服务

1）验证两种蛋白质间相互作用

2）验证目的蛋白与细胞裂解物蛋白互作

免疫共沉淀IP/CoIP

1.技术简介

免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）是研究细胞内蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。

2.免疫共沉淀原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质A的抗体去结合并沉淀A蛋白，那么与A在体内结合的蛋白质B也能同时沉淀下来，两种蛋白通过Protein A或G形成复合物“蛋白B—蛋白A—抗A蛋白抗体—Protein A/G”，上述复合物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳被分开，最后以免疫印迹WB或质谱检测目的蛋白。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质可能的新关联蛋白。

3.技术优点

1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；

2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；

3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

4.操作步骤

1）免疫沉淀操作步骤

2）免疫共沉淀操作步骤

蛋白质印迹法

1.技术简介

蛋白质免疫印迹试验即Western Blot,它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

2.技术优势

（1）高效蛋白提取液进行高质量蛋白的提取，同时高效的蛋白酶抑制剂有效防止蛋白的降解及去磷酸化等作用；

（2）拥有多年的Western Blot检测经验，为客户提供专业的技术服务。

（3）为客户设置预实验，根据客户样品具体情况摸索最适上样量和抗体最适稀释度。

3.技术流程

一）WB--蛋白抽提

1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取：

弃培养液—>PBS清洗—>裂解30min—>移至离心管，离心—> 取上清，于－20℃保存

2. 组织中总蛋白的提取：

组织剪碎—>加裂解液，打匀浆—>裂解30min—>转移至离心管，离心—>取上清，于－20℃保存

3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

培养液离心—>弃上清，PBS洗涤，离心—>弃上清—>裂解液冰上裂解30min—>离心—>取上清，于－20℃保存

二）WB--蛋白定量(BCA法)

BCA法测定蛋白浓度，在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA 与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

1.技术优势：

1).准确灵敏, 线性范围广，BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000ug/ml。

2).快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。

3).经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。

4).不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。

5).检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

2.实验流程：

提取总蛋白—>稀释—>制备标准曲线—>BCA反应—>测定OD值—>换算

三）凝胶制备

1. 配胶：根据所要检测的蛋白选择合适的浓度的分离胶。

2. 封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，封胶后切记，勿动;待胶凝后将封胶液倒掉，灌入浓缩胶。

3. 待浓缩胶凝固拔除梳子。（10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉。）技术优势：高分辨率聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAGE）把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度。

四）上样电泳

1.上样前将胶板下的气泡赶走。

2.所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。

3.以初始为80V时的电压进行稳压电泳，当样品跑出浓缩胶改120V电压电泳。

4.在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

五）湿转法转膜

1．电泳结束前20分钟开始准备：滤纸、PVDF膜及冰块。

2．取胶

3．转膜：过程中驱赶气泡。

六）封闭及杂交

1．封闭：将膜从电转槽中取出，PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。根据蛋白性质选择合适的PBST或TTBS配制成5%脱脂奶粉封闭液。

2．结合一抗：根据相应一抗选择合适的稀释浓度

3．洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，室温轻摇一小时。

5．洗涤二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

6. 显影

7. 结果分析