USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。

方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。

寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。

连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。

构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。

通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。

结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。

与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。

结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。

国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。

沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。

本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。

1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。

T4磷酸化酶、T4连接酶、HpaⅠ酶及XhoⅠ酶均购自NEB（New England BioLabs）公司。

琼脂糖购自Biowest公司。

高纯质粒小量提取试剂盒和Tran5α感受态细胞购自北京全式金生物公司。

质粒大提试剂盒（QIAGEN试剂盒）购自QIAGEN 公司。

溴化乙锭（EB）及LB培养基购自上海生工生物工程有限公司。

293T细胞购自中国科学院上海细胞库。

Lipofectamine（脂质体）2000购自Life Technologies公司。

主要仪器包括水浴箱、恒温振荡器、台式离心机、Eppendorf 加样枪和台式冷冻离心机、恒温摇床、电热恒温CO2培养箱、Millipore超纯水系统、Bio-Rad琼脂糖凝胶电泳仪、SynGene凝胶成像系统、Olympus倒置荧光显微镜、-4℃冰箱、-20℃冰箱等。

1.2 方法1.2.1 SiRNA的设计与合成运用Promega、Invitrogen和Dharmaco公司提供的RNA干扰设计工具，并结合RNA干扰设计的原则，寻找19个碱基的靶序列。

将编码SiRNA的DNA 片段设计成发夹结构，发夹结构的两端含限制性内切酶位点HpaⅠ及XhoⅠ。

SiUSP22-1：CACGGACAGTCTCAACAAT，5′-AACTCACGGACAGTCTCAACAATTT-CAAGAGAATTGTTGAGACTGTCCG TGTTTTTTC-3′，3′-TTGAGTGCCTGTCAGAGTTGTTAAAGTTCTCTTA-ACAACTCTGACAGGC ACAAAAAAGAGCT-5′；SiUS-P22-2：GAAGCATATTCACGAGCAT，5′-AACTGAAGCATATTCACGAGCATTTCAAGAGAATGCTCGTGAA-TATGCT TCTTTTTTC-3′，3′-TTGACTTCGTATAAGTG-CTCGTAAAGTTCTCTTACGAGCACTTATACGAA GA-AAAAAGAGCT-5′。

1.2.2 慢病毒载体的构建1.2.2.1 寡核苷酸链的退火反应体系：1 μg/μl正义寡核苷酸链，1 μg/μl反义寡核苷酸，1 μl 20×SSC Buffer，加ddH2O至20 μl。

反应条件：95℃，10 min后自然冷却至室温。

1.2.2.2 寡核苷酸双链5′端的磷酸化因合成的寡核苷酸链的5′端没有被磷酸化，不利于载体的连接，故需要磷酸化。

反应体系：7 μl寡核苷酸双链，2.5 μl 10×T4 PNK Buffer，2.5 μl ATP，0.5 μl T4磷酸化酶，加ddH2O至25 μl。

反应条件：37℃，30 min。

1.2.2.3 将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7载体连接体系：1 μl pLL3.7载体，1 μl寡核苷酸双链，1 μl 10×连接Buffer，1 μl T4连接酶，加ddH2O 至10 μl。

反应条件：室温，30 min。

1.2.2.4 连接产物的转化①冰浴中将50～100 ng连接产物分别加入至50 μl Tran5α感受态细胞中，然后轻轻地旋转使其混合均匀，冰浴时间30 min；②放置42℃的水浴箱中热休克90 s；③快速地将管转移至冰浴中，冰浴时间2 min；④分别加入500 μl LB培养基，混匀，37℃、150 r/min振荡培养40 min；⑤将150 μl菌液涂布于含氨苄青霉素（Amp）（100 μg/ml）的LB平板表面，室温下放置，至液体吸收。

倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。

1.2.2.5 质粒提取及鉴定从平板上面各接挑取6个菌落进行扩增培养，加入含有相应抗生素的3 ml LB培养液中37℃过夜培养，提取其质粒（高纯质粒小量提取试剂盒）。

提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，鉴定正确的质粒送中美泰和公司测序。

测序正确的质粒经大提（QIAGEN试剂盒）后保存于-20℃冰箱。

1.2.3 慢病毒载体的包装、浓缩及滴度测定1.2.3.1 慢病毒的包装①转染前24 h，用胰酶消化对数生长期的293T细胞，传代到10 cm细胞培养皿中，在37℃、5%CO2的培养箱内进行培养。

培养24 h 后待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。

细胞状态对于病毒包装很重要，需保证良好的细胞状态及较少的传代次数。

②转染前将细胞培养基更换成无血清培养基，再将稀释后的DNA（pLV-gene载体10 μg，pGag/Pol载体5 μg、pRev载体5 μg、pVSV-G载体5 μg）与稀释后的Lipofectamine 2000混合，慢慢地颠倒以使相互混匀，但不要震荡，然后在室温下培育20 min，以形成DNA和Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。

③将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至培养293T细胞的培养液中，充分混匀，放置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养。

培养6 h后吸去含有转染混合物的培养基，在每瓶细胞培养液中加入含10%血清的培养基10 ml，再放置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内继续培养48 h。

1.2.3.2 病毒的收获和浓缩①收集转染后48 h以及72 h的293T细胞上清液。

在4℃，4000×g下离心10 min，以除去细胞碎片。

在0.45 μm过滤器上过滤上清液于50 ml的离心管中。

②将病毒粗提液样品加入过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子，在5000×g离心，达到需要的病毒浓缩体积（通常需要10～15 min）。

离心结束后过滤杯中即为病毒浓缩液。

将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，可在4℃下保存1周，或在-80℃冰箱中长期保存。

1.2.3.3 慢病毒滴度测定①在测定滴度的前一天，将293T细胞铺于96孔板中，每个孔加入约4×104个细胞，体积为100 μl。

然后根据病毒的预期滴度，准备6～10个无菌的Ep管，在每个Ep管中加入90 μl的无血清培养基。

②吸取待测定的病毒原液10 μl加入第一个管中，记为1E+1 μl；充分混匀后，取10 μl加入第二个管中，记为1E+0 μl。

以此类推，重复相同的操作直至最后一个管。

③选取所需的细胞孔，吸去90 μl的培养基，丢弃，加入90 μl稀释好的病毒溶液，放于培养箱中培养。

④培养24 h后，加入完全培养基100 μl，4 d后，通过荧光显微镜拍照观察其荧光表达情况。

⑤根据荧光图片中GFP表达情况，如在观察到荧光表达的最后一个浓度1E-4 μl组中看到有5个带荧光的细胞，则说明该孔中至少有5个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，就是5/（1E-4）=5×104，单位为TU/μl，也就等于5×107 TU/ml。

2 结果2.1 慢病毒表达载体质粒的酶切鉴定及测序提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，进行凝膠电泳形成一条约7.6 kb的DNA条带（图1），与预期结果相符。

鉴定正确的质粒被送至北京中美泰和公司测序，测序结果显示含有与先前设计相同的干扰序列，表明USP22慢病毒表达载体质粒构建成功。

测序结果如下。

2.2 慢病毒载体的包装以及滴度的测定慢病毒转染293T细胞后，通过孔稀释法来测定其滴度。

在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，观察到的荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少（图2）。

通过图2中GFP的表达情况，可以观察到最后一个浓度为1E-4 μl组的孔中有4个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有4个病毒颗粒感染了细胞，那么该病毒的滴度就观察到的荧光细胞数除以病毒原液量，测定滴度为4×104 TU/μl （4×107 TU/ml），适合感染目的细胞。

3 讨论RNAi作为一种简单有效的替代基因敲除的方法，其特异性及很好的表达抑制效果成为基因功能研究的有力手段[9-10]。

慢病毒载体是在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系[11]。

慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞质中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。

整合后的DNA转录mRNA，回到细胞质中，表达目的蛋白；或产生RNAi干扰。

慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂[12]。

USP22属于泛素水解酶家族定位于人17号染色体，由14个外显子组成，编码525个氨基酸，USP22在肿瘤组织如肝癌和宫颈癌中异常地高表达，而在正常组织中呈现弱表达[13]。