放线菌和霉菌的形态观察

实验4 放线菌和霉菌的形态观察
实验时间：20 18年4月18日星期三第789节实验地点：13- 133
1. 实验目的
学习并掌握观察放线菌形态的基本方法，并观察放线菌的形态特征
学习并掌握观察四类常见霉菌形态的基本方法，并观察其形态特征
2. 实验原理
放线菌原理
放线菌是由不同长短、纤细的菌丝所形成的单细胞的菌丝体。

菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝(或称基内菌丝，简称基丝)和生长在培养基以上的气生菌丝。

有些气生菌丝分化成孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等，孢子常呈圆形、椭圆形或杆状。

能否产生气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为放线菌分类鉴定的重要依据。

放线菌的菌落形态特征为: 形成干燥、不透明、表面呈致密丝绒状，上有一层彩色“干粉”的菌落。

菌落与培养基连接紧密，难以挑取，菌落正反面颜色不一致，在菌落边缘的琼脂平板上有变形的现象，有泥腥味。

霉菌原理
霉菌是一类可产生菌丝体的真核微生物的统称。

霉菌的菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，菌落与培养基间连接紧密，不易挑取，菌落正反面，边缘与中心的颜色、构造通常不一致，有霉味。

霉菌的菌丝体分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。

霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

菌丝的孢子较大，在低倍镜下即可清晰观察到有隔或无隔菌丝和孢子及巨大的孢子囊。

霉菌菌丝和孢子的宽度通常比放线菌粗的多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍。

霉菌菌丝较粗大，细胞容易收缩变形，而且孢子很容易飞散、所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。

此染色液制成的霉菌标本片特点是: (a) 细胞不变形: (b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间; (c) 溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。

霉菌的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态常作为分类的重要依据。

3. 材料仪器
1、菌种: 放线菌划线平板28C,3-5 天后培养物;产黄青霉，黑曲霉，黑根霉，等斜面或平板划线菌种28C培养2~3 天。

2、染料和试剂: 0.1%乳酸石炭酸棉蓝染色液，石炭酸复红染色液，吕氏碱性美蓝染液，无菌水等。

3、器材: 显微镜，载玻片，镊子，接种环，玻璃刮，玻璃纸，细口滴管，剪刀，培养皿，圆形滤纸片等。

4. 方法步骤
(一) 放线菌形态观察
1、水封片观察
(1)取一套高氏1号平板，将菌种划线方法接种，把灭菌过的盖玻片斜插在培养基中，一半露出，在28"C下培养5~7d 备用。

(2) 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，将上述长有菌丝的盖玻片取出，把一面的培养基擦净。

然后把长菌丝一面朝下，盖住染色液，制成水封片，用高倍镜观察其气生丝、孢子丝和孢子。

2、玻璃纸法观察
(1)取一套高氏1号平板，将一张适中的玻璃纸平铺在平板上，用无菌玻璃刮展平，然后
用接种环取一环斜面种在玻璃纸上划线接种，或用玻璃刮涂布接种，倒置放入28C下培养5~7d,此时可见到玻璃纸表面长出菌丝和孢子的颜色便可取材观察。

(2)取一块干净的载玻片，滴加一滴水，用剪刀从长菌的玻璃纸边缘处剪下一小块，上下方向不变，移至载玻片的水滴上以其底部接触水面。

使其展平，不要有气泡，不要加盖玻片便可直接在显微镜下观察。

先用低倍镜观察菌丝的立体生长状况，再用高倍镜仔细观察。

注意区分放线菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝。

3、影印法观察
用涂布法或划线法培养出单个菌落，然后用小刀小心地刮一个菌落，翻过压印在载玻片中央，小心地移开菌落，载玻片中央就留下菌落印痕。

在火焰下固定，滴一滴石炭酸复红染色, 水洗后晾干，在高倍镜或油镜下观察。

(二) 霉菌形态观察
霉菌的载玻片湿室培养
(1)湿室用具准备在培养皿底铺一张圆形滤纸片，载玻片和盖玻片和玻棒，外用纸包扎，经121C湿热灭菌30min后，置60C烘箱烘干，备用。

(2) 接种在超净工作台内，将两条玻棒放入平皿内适当位置，放上载玻片，然后用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。

接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。

(3) 加培养基用无菌细口滴管吸取少量融化约50度的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，其直径约为0.5cm (滴加量一般以1/2 小滴为宜)。

(4) 加盖玻片在培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将无菌盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压，使盖玻片和载玻片之间的距离相当接近，但不能压扁，否则不透气，
(5) 加保湿剂每皿加入大约3mL.20%的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润湿，以保持皿内湿度，皿盖上注明菌名、组别和接种日期。

将制成的载政片漫室置28度恒温箱培养3~5d. 2、黑根霉假根的培养
将融化的PDA 培养基，倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的1/2。

冷凝后，用按神
环沾取根霉孢子，在平板表面划线接种。

然后将平皿倒置，在皿盖内放一无菌载玻片，
于28度培养2~3d 后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，
并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构。

3、镜检观察
湿室培养霉菌镜检玻片从培养16-20h 开始，通过连续观察，可了解抱子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。

将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等等霉菌的形态，重点观察菌丝是否有分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢子囊孢子。

绘图。

(2) 粘片观察取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，打开霉菌平板培养物，取一段透明胶带粘取菌体，粘面朝下，放在染液上，镜检。

(3) 假根观察将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖上的载玻片标本。

在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。

只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢子囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。

5. 实验结果
放线菌显微观察图
曲霉分生孢子头显微观察图根霉显微观察图
青霉的分生孢子头显微观察图
6. 结论
显微镜观察下放线菌形态较小难以区分各结构；可以清晰观察到根霉的假根、匍匐菌丝、孢子囊、孢子梗；曲霉分生孢子头的顶囊清晰可见，分生孢子可见，一轮小梗与二轮小梗较难区分；青霉分生孢子头形如扫帚状，可观察到分生孢子、带状分枝小梗和分生孢子梗。

7. 实验总结（含实验体会、关键步骤、注意事项等）
1.粘片观察霉菌形态时要注意不能有气泡，否则影响观察。

2.影印法观察放线菌形态时，要小心移动菌落，否则会破坏放线菌结构。

3.显微镜观察时，应先使用低倍镜，必要时再使用高倍镜。

8. 思考题
(1)在显微镜下，如何区别营养菌丝和气生菌丝？
气生菌丝直生或分枝丝状，较基内菌丝粗，是指从基质伸向空气中的菌丝体。

菌类的菌丝体多是匍匐在基质上，或是贯通基质而伸长的，为了孢子的形成而生长气生菌丝。

在一定条件下，水生菌类也可以生长气生菌丝。

真菌和放线菌的营养菌丝发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝称为气生菌丝。

它叠生于营养菌丝上，以致可以覆盖整个菌落表面。

在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，直形或弯曲，有的产生色素。

在固体培养基上霉菌的菌丝分化为营养菌丝和气生菌丝。

营养菌丝深入到培养基内吸收养料；气生菌丝向空中生长，有些气生菌丝发育到一定阶段分化成繁殖菌丝，产生孢子。

(2) 在自然界和实际应用中放线菌有什么作用？霉菌对人类生活和生产能产生哪些积极作用和消极作用？
在自然界和实际应用中放线菌的作用有：
①放线菌是大多数抗生素的产生菌，还是许多酶、维生素等的产生菌。

②近年来筛选出的许多新的生化药物多数是放线菌的次生代谢产物，包括抗癌剂、酶抑制剂、抗寄生虫剂、免疫抑制剂和农用杀虫（杀菌）剂等。

③放线菌对非豆科植物的共生固氮具有重大作用。

④放线菌在石油脱蜡和污水处理中也有重要应用。

由于放线菌有极强的分解纤维素、石蜡、角蛋白、琼脂和橡胶等能力，故它们在环境保护、提高土壤肥沃力和自然界物质循环中起着重大作用。

霉菌对人类生活和生产中产生的积极作用为：
①工业上的有机酸、酶制剂、抗生素、维生素、生物碱等的发酵生产
②进行生物防治，污水处理和生物测定
③食品制造方面，如酱油的酿造和干酪的制造
④在基础理论研究方面，霉菌是良好的实验材料
消极作用有：
①可引起工农业产品的霉变，如食品、纺织品、皮革、木材、纸张、光学仪器、电工器材和照相材料等。

②是植物最主要的病原菌，引起各种植物的传染性病害，如马铃薯晚疫病、稻瘟病和小麦锈病等。

③引起动物和人体传染病，如皮肤癣症等；另有少部分霉菌可产生毒性很强的真菌毒素，如黄曲霉毒素等。