制药工程基础实验实验
制药工程课程设计
制药工程课程设计制药工程课程设计是一个综合性的、多学科交叉的课程，其中包括了药学、化学、生物学、工程学等多个学科领域。
该课程的目标是培养学生能够设计、开发、研究和优化制药生产过程中的各个环节，以满足社会对药物的需求。
本文将从课程设计的目的、主要内容、教学方法和实验实践等四个方面，对制药工程课程设计进行详细的介绍。
一、课程设计的目的制药工程课程设计是制药工程专业高年级学生的一门必修课程，其主要目的是培养学生能够根据药物生产的要求，运用所学的理论知识，针对特定的药物品种，进行生产工艺流程的设计与优化，制定出合理的生产方案。
此外，还能够对制药生产过程中的质量进行全面的控制，掌握药物生产过程中的技术要求和GMP规范，熟悉常用制药设备的原理和使用方法，了解制药生产过程中的常见问题及解决方法。
二、主要内容制药工程课程设计的主要内容包括以下几个方面：1.生产工艺流程设计。
学生需要根据药物的结构特点和生产要求，设计和优化药物的生产工艺流程，选择合适的生产设备和试剂，并确定出最佳的生产条件。
2.生产过程质量控制。
学生需要了解药物生产过程中的质量控制要求和检测方法，并制定出合理的质量控制计划。
3.制药设备选用。
学生需要了解各种制药设备的原理、特点和使用方法，并根据生产工艺流程的需要选择合适的设备。
4.GMP规范掌握。
学生需要掌握GMP规范的基本要求，并在生产过程中遵循相应的规范和标准。
5.生产过程中的技术要求。
学生需要了解药物生产过程中的技术要求和注意事项，如安全生产、环境保护等。
三、教学方法制药工程课程设计的教学方法主要包括理论教学、案例分析和课程设计等多种形式。
其中，理论教学是基础，通过讲解和讨论，使学生掌握制药工程的基本理论和实践知识；案例分析是提高学生实际应用能力的重要手段，通过剖析具体的药物生产案例，使学生了解药物生产的实际情况和常见问题；课程设计则是培养学生独立思考和实践能力的重要环节，学生需要在教师指导下独立完成一个药物品种的生产工艺流程设计和优化。
阿司匹林实验
阿司匹林实验阿司匹林⽚剂的制备实验Ⅰ阿司匹林的合成【⽬的】1.熟悉酚羟基酰化反应的原理，掌握阿司匹林的制备⽅法。
2.掌握抽滤装置的安装和操作，并学会利⽤重结晶纯化固体有机物。
【原理】【仪器和药品】仪器：电磁搅拌器，温度计,搅拌⼦，三⼝烧瓶，单⼝圆底烧瓶，锥形瓶，球形冷凝管，直形冷凝管，酒精灯，⽯棉⽹，橡⽪管，电⼦天平，胶头滴管，铁架台，量筒，玻璃棒，移液管，烧杯，布⽒漏⽃，真空泵，滤纸，吸虑瓶，烘箱，熔点仪，T 形连接管等。
药品：⽔杨酸，⼄酸酐，98%浓硫酸，饱和碳酸氢钠溶液，浓盐酸，⼄醚，⽯油醚，蒸馏⽔，冰块，1%FeCl3等。
【内容】因最终制备阿司匹林⽚剂时所需阿司匹林原料量过⼤，难以⼀次性合成，故整个合成过程分两批进⾏（如下），操作步骤相同。
1.新蒸⼄酸酐：量取⼄酸酐60mL 放⼊100mL 的圆底烧瓶中进⾏普通蒸馏，收取 137—140℃的馏分备⽤。
COOHOHCOOHO (CH 3CO)2OH+CH 3OCH 3COOH+C+浓硫酸⽔杨酸⼄酸酐⼄酰⽔杨酸80-85℃2.加料：在250mL 三⼝瓶中加⼊34.4g(0.249mol)⽔杨酸、48mL （0.508mol)新蒸⼄酸酐和56滴浓硫酸（约2.8ml ）。
3.酰化反应：振摇三⼝瓶使⽔杨酸全部溶解（如不溶解则需补加⼄酸酐和浓硫酸）。
安装回流装置，在磁⼒搅拌器中加热控制温度在80—85℃，同时保持低速匀速搅拌，反应20min 后⽤1%FeCl3检查，当反应液不再呈现紫⾊时停⽌反应。
反应液稍冷却（50℃以下）后均分成⼏份倒⼊各烧杯中，先⽤100ml 冰⽔⽔解过量的⼄酸酐，冷却⾄室温后，即有⼄酰⽔杨酸结晶析出(若不结晶，可⽤玻璃棒摩擦瓶壁)。
然后再加⼊400mL 冰⽔，将混合物继续在冰⽔浴中冷却使结晶完全。
抽滤，结晶⽤少量冷蒸馏⽔洗涤3次，抽⼲后将粗产物转移⾄表⾯⽫上，⾃然晾⼲得粗产品，称量。
4.重结晶：将粗产品转移⾄500mL 烧杯中，搅拌下加⼊400mL 饱和碳酸氢钠溶液，直⾄⽆⼆氧化碳⽓泡产⽣，抽滤，⽤少量⽔冲洗漏⽃，合并滤液（弃去滤渣）并倒⼊预先盛有将80mL 浓盐酸和160mL ⽔配成的溶液的烧杯中，搅拌均匀，使溶液PH 呈弱酸性，即有⼄酰⽔杨酸沉淀析出。
制药工程专业微生物实验讲义
（怀化学院微生物学课程组）微生物学实验室学生要求为了营造一个安全有效、秩序良好的实验室环境，达到“科学、规范、安全、高效”的目的，特对进入微生物学实验室进行实验的学生作如下要求。
1.按已分好的班级组次，按时参加实验，并完成实验项目。
2.进入实验室前，要求穿戴整齐，需穿好实验服，不能穿人字拖类拖鞋进入实验室。
3.上课前要求上交当堂课程的实验预习报告。
4.要求独立或以小组为单位完成实验项目，实验期间保持实验室安静，不能大声喧哗，并及时记录好实验数据。
5.实验完成后及时对实验结果进行分析并完成实验报告。
6.实验完成后需及时清洗实验器皿，清洁和整理实验台，做好卫生，保持实验室干净整洁。
授课教师：刘卫今、黎晓英（以下实验内容仅供参考，具体内容以相应教材为准）实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1．掌握培养基配制的原理。
2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3．解高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。
二、实验原理1．什么是培养基，一般培养基应具备哪些营养要素？2．培养基有哪些类型，为什么培养不同的微生物需要的培养基不同，培养基为什么要调节pH 值，配制好的培养基为什么要立即灭菌？3．高压蒸汽灭菌的原理是什么？三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖（或蔗糖）、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/LH Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布和玻璃漏斗等。
四、操作步骤(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨l0g，NaCl5g，琼脂15-20g, 水1000mL，pH 7.4～7.61. 称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
制药工程实验考核(1)
实验素养：衣着实验服、试剂归回原位、实验安全与卫生等
熟悉
操作
油相和乳化剂的混合：掌握干胶法制备乳剂的工艺流程及操作关键
重点掌握
操作+口述
加入水相，制备初乳：按油：胶：水为3:1:2比例一次加水，沿同一方向研磨
掌握
操作+口述
加蒸馏水研匀，稀释至全量
熟悉
操作+口述
质检：熟悉如何评价乳剂的质量
（3）硬度（径直的硬度，平放 3-6片）
（4）脆碎度：（总量6.5克，精密称定，于脆碎仪中，转100转后除去粉末，再精密称重片剂的重量。）
【功能与主治】（1）治疗轻至中度代谢性酸中毒（2）作为制酸药，治疗胃酸过多引起的症状
【用法与用量】 口服，一次0.25～2g，每日3次
实验步骤
1.10%淀粉浆的制备 2.湿颗粒的制备 3.压片前处理 4.压片 5.质检
考核点 考核要求 考核方式
实验素养：衣着实验服、试剂归回原位、实验安全与卫生等
熟悉
操作
10%淀粉浆的制备：熟悉煮浆法制备淀粉浆的方法
熟悉
操作+口述
湿颗粒的制备：掌握制软材的方法及操作要点：手握成团，轻压即散
重点掌握
操作+口述
压片前处理：熟悉如何开展整粒、及总混操作
熟悉
操作+口述
压片：1、掌握压片机的基本构造及工作原理 2、掌握压片过程中常见问题的解决方法
3、压片前处理
（1）整粒，称重（采用过筛的方法进行整粒，把干燥过程中结块，粘连的颗粒分散开）
（2）用适量细粒与薄荷油拌匀，再与全部颗粒拌匀，加入干粒重的4%干淀粉，0.5％硬脂酸镁混匀，密闭15-20分钟。
药剂学实验
按 表 3-1 所 列 处 方 用量 配 制 五 种 含 不 同 HLB值混合乳化剂的液体石蜡乳（吐温80 和司盘80的HLB值分别为15和4.3）。 2．制法 按上表中各处方用量，分别将液 体石蜡、吐温80和司盘80加入具塞量筒中， 上下振摇20次，加蒸馏水至30ml，振摇 30次后，静置，经5、10、30、60分钟 后，分别测量其水层高度，记录于表3-2， 并判定哪一处方较稳定。
实验三 乳剂的制备及鉴别
小量制备乳剂时，可采用在乳钵中研磨或瓶中 振摇等方法；大量生产乳剂时，采用搅拌机、乳 匀机和胶体磨来制得。由于用一种乳化剂时往往 难以达到这种要求，故通常将两种以上的乳化剂 混合使用。Griffin和Davies提出寻找混合乳化 剂的HLB值和测定被乳化的油所需HLB值的方法 来选择乳化剂。HLB值是指表面活性剂分子中亲 水亲油基团对水和油的综合亲和力。每种乳化剂 都有其固定的HLB值，一般8～18为适合制备 O/W型乳剂，3～8为适合制备W/O型乳剂。被 乳化的油所需的HLB值与乳化剂的HLB值越接近 乳剂越稳定。
实验三 乳剂的制备及鉴别
一、目的和要求 1. 掌握乳剂的一般制备方法及乳剂类 型的鉴别。 2. 比较不同乳剂及乳化方法制备乳剂 的分散相粒度及其稳定性。 3．掌握油乳化HLB值的测定方法。
实验三 乳剂的制备及鉴别
二、基本概念和实验原理 乳剂（也称乳浊液）是指两种互不相溶 的液体混合，其中一种液体以液滴的形式 分散在另一种液体中形成的非均相分散体 系。分散的液滴称为分散相、内相或不连 续相，一般直径在0.1-100m；包在液滴 外面的液相称为分散介质、外相或连续相。
实验一 溶液型液体药剂的制备
高分子溶液剂系指高分子化合物溶解于溶 剂中形成的均匀分散的液体药剂。以水为 溶剂时，称为亲水性高分子溶液，又称为 亲水胶体溶液或称胶浆剂。以非水溶剂制 成的称为非水性高分子溶液剂。亲水性高 分子溶液在药剂中应用较多，如混悬剂中 的助悬剂、乳剂中的乳化剂、片剂的包衣 材料、血浆代用品、微囊、缓释制剂等都 涉及高分子溶液。
制药工程 药物化学实验讲义
THE EXPERIMENTS OF MEDICINAL CHEMISTRY （供药学、药剂、制药工程用）实验一 苯佐卡因（Benzocaine ）的合成苯佐卡因为局部麻醉药，外用为撒布剂，用于手术后创伤止痛、溃疡痛、一般性痒等。
化学结构式化学名 对氨基苯甲酸乙酯性 状 白色结晶性粉末，味微苦而麻，熔点88～90℃，易溶于乙醇，极微溶于水。
实验目的通过苯佐卡因的合成，了解药物合成的基本过程，掌握酯化反应和还原反应的原理及基本操作。
实验原理（主要合成路线） 1.还原反应2.酯化反应NH 2COOC 2H 5NO 2COOHSn COOHNH 2COOHNH 2.HClNH 3.H 2OCOONH 4NH 2CH 3COOH NH 2COOHCH 3COONH 4SnCl 4NH 3.H 2OSn(OH)NH 4ClNH 2COOHC H OH H 2SO 4COOC 2H 5NH 2.H 2SO 4COOC 2H 5NH 2Na CO实验步骤1.对氨基苯甲酸的制备（还原）称取4g对硝基苯甲酸、9g锡粉加入到100ml三颈瓶中，装上回流冷凝管和滴液漏斗，从漏斗中分批加入20ml浓盐酸，边加料边搅拌，反应立即开始（如有必要可用温火加热至反应发生）。
必要时可再微热片刻以保持反应正常进行，反应液中锡粉逐渐减少。
当反应接近终点时（约30分钟），反应液呈透明状，稍冷，将反应液倾入250ml烧杯中，加少量水消除留存的锡块固体。
反应液冷至室温时，慢慢滴加浓氨水，边滴加边搅拌，使溶液刚好呈碱性。
抽滤除去析出的Sn(OH)沉淀，用少量水洗涤沉淀，合并滤4液和洗液（若总体积超过550ml，可在水浴上浓缩）。
向滤液中小心地滴加冰醋酸，有白色固体析出。
再滴加少量冰醋酸，有更多的固体析出。
用蓝色石蕊试纸检验到呈酸性为止。
在冷水浴上冷却，过滤得白色固体，晾干后称重，计算产率。
2．对氨基苯甲酸乙酯的制备（酯化）将自制的2g对氨基苯甲酸放入干燥的100ml圆底瓶中，加入20ml无水乙醇和2.5ml 浓硫酸。
制药工程系学生实训报告
一、引言随着我国医药产业的快速发展，制药工程专业的学生需要具备扎实的理论基础和实践技能。
为了提高学生的综合素质，培养适应社会需求的专业人才，我校制药工程系组织开展了为期两周的实训活动。
以下是我在实训过程中的所见、所闻、所感。
二、实训内容与过程1. 实训内容本次实训主要包括以下几个方面：（1）制药工艺流程参观：参观生产车间，了解药品生产的基本工艺流程。
（2）制药设备操作：学习制药设备的基本操作，如粉碎、混合、制粒、干燥、包装等。
（3）制药原料与辅料识别：认识各种制药原料和辅料，了解其性质、用途及质量要求。
（4）药品检验：学习药品检验的基本方法，如重量法、滴定法、色谱法等。
（5）实验室操作：掌握实验室基本操作，如玻璃仪器洗涤、溶液配制、实验记录等。
2. 实训过程（1）制药工艺流程参观在参观过程中，我们了解了药品生产的基本工艺流程，包括原料处理、合成反应、分离纯化、制剂加工、质量检验等环节。
通过实地观察，我们对制药工艺有了更直观的认识。
（2）制药设备操作实训期间，我们学习了粉碎、混合、制粒、干燥、包装等设备的基本操作。
在专业老师的指导下，我们亲自动手操作，熟悉了设备的使用方法，提高了实践技能。
（3）制药原料与辅料识别在实训过程中，我们认识了许多制药原料和辅料，了解了它们的性质、用途及质量要求。
这为我们今后从事制药工作打下了坚实的基础。
（4）药品检验实训期间，我们学习了药品检验的基本方法，如重量法、滴定法、色谱法等。
通过实际操作，我们掌握了这些方法的应用，提高了药品检验能力。
（5）实验室操作在实验室操作实训中，我们学习了玻璃仪器洗涤、溶液配制、实验记录等基本技能。
通过实践，我们提高了实验操作的规范性，为今后从事科研工作奠定了基础。
三、实训收获与体会1. 提高实践技能通过本次实训，我们不仅了解了药品生产的基本工艺流程，还掌握了制药设备操作、原料与辅料识别、药品检验、实验室操作等实践技能，为今后从事制药工作打下了坚实的基础。
对制药工程专业实验教学的思考与探索
光谱 、 旋光仪等手段在第一学年时已贯穿在无机和有机化学实
验 教学 中 。 ２ 以培 养 学 生动 手 能 力为 中心 开展 实 验教 学
制药工程专业实验课一般在第三 、 四学年开设 。如果沿用
基础实验教学方法 ， 势必会让学生觉得枯燥无 味 ， 甚至产生厌
烦情绪。因此要在培养学生 动手能力 的同时， 提高学生对专业
在 实验教 学中 ， 我们在专业 实验中强化综合实验 ， 弱化验 证性实验 ， 寓验证性 实验于综合实验 中。如上述药 物制造过程 中的 ３个方面 ， 就可以相互交叉 、 相互渗透。学生在制剂生产实
验 中使用的原料就可 能是原料药生产实验 中所 制备的药物或 中间体 ， 原料药生产实验 中制备 的每个药物或中间体必须进行
目标 。 药 物 的 制造 过 程 中 ， 涉 及 到 原 料药 生 产 、 在 会 制剂 生 产 和
药物 的有效性评价等环节翻 根据这一规律 ， 。 我们对专业实验教
学 内容 进 行 了设兴趣 。 ２３ 开展 多衅体仿真实验 ． 上述实验装置 固定 ， 主要是通过变换实验对象 、 条件来设
制 药工程专业是一个化 学 、药学 和工程学交叉的工科专
业， 以培养药 品制造工程技术人 才为 目标 。制药工程专业应着
要采用化学法 ， 使用频率最高的是色谱法。针对这一现状 ， 我们 将色谱法对药物的有效性评价作为主要教学内容。 其他如红外
重培养学 生运用化学 、 药学、 工程学 、 管理学及相关学科理论知 识和技术 手段解决药品生产过程 中的工程技术 问题 ， 实现药 品
【 杨 晋． ２ 】 制药工程本科专业课程体 系建设 的探索叨． 城市建设 ，（ ９ ２０ ， １
（ ）７ ９ ２ ：－ ．
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1 实验一、培养基的配置与微生物的接种培养实验 （一）实验目的：通过实验，使学生了解和掌握培养基的配置、消毒方法和接种与培养技术。了解微生物对营养物质的需求，不同微生物的生长差异。 （二）实验原理：微生物必须在含有所需要的营养元素的培养基上才能生长，不同种类的微生物有它所适宜生长的培养基，细菌和真菌的培养基不同，在长期的实践中形成了有些著名的培养基配方和配置方法。微生物的培养过程中要防止其他微生物的存在和生长，因此在接种和培养过程中要进行灭菌和消毒，防止杂菌的干扰。灭菌方式中广泛使用的是蒸汽灭菌，即湿热灭菌。是热灭菌的好处是灭菌效果好，因蛋白质在含水时易变性，另外蒸汽穿透力大，含能量高。使用蒸汽灭菌器要注意排气完全，否则达不到灭菌温度。表1表示排空气程度与实际温度的关系。 表1蒸汽灭菌其中空气排除程度与器内温度的关系 空气排除程度 表压力（kPa） 灭菌器内的实际温度（℃） 完全排除 98.07 121 排除2/3 98.07 115 排除1/3 98.07 112 排除1/3 98.07 109 完全未排除 98.07 100 蒸汽灭菌器的压力有的以1b/in2（磅/英寸2）、kg/cm2表示，现统一以帕（Pa）或千帕（kPa）表示，它们与温度的关系如表4-2。 表2 蒸汽压力与温度的关系 蒸汽压力 相应温度 （℃） kPa Lb/in2 Kg/cm
2
34.47 5 0.352 107.7 68.95 10 0.703 115.5 103.42 15 1.055 121.6 137.90 20 1.406 126.6 172.37 25 1.756 130.5 206.84 30 2.109 134.4 表3 糖在不同温度下热灭菌的破坏情况 分析方法 糖名 （10%糖液） 灭菌方法 103.42kPa (121℃) 68.95~82.74kPa (115.6~118℃) 55.16~68.95kPa (113~115.6℃) 100℃
15min 20min 20min 30min 含量% 破坏 % 含量 % 破坏 % 含量 % 破坏 % 含量% 破坏 % 旋光法 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 蔗糖
76.0 67.9 94.0 87.7 24.0 32.1 16.0 12.3 81.8 85.7 84.7 97.7 18.2 14.3 15.3 2.3 99.4 95.3 86.5 98.7 0. 6 1. 4.7 2. 13.5 3. 1.3 92.0 81.9 78.8 96.3 8.0 18.1 21.2 3.7 表4 一些微生物杀死的温度与时间 微生物 热死时间 微生物 热死时间 2
温度 ℃ 时间 min 温度 ℃ 时间 min 脆弱假单胞菌 氯针假单胞菌 荧光假单胞菌 赛氏杆菌（低温性） 海产弧菌（低温性） 鼠伤寒沙门氏菌 50 60 53 30 25 55 35 10 25 30 80 10* 伤寒沙门氏菌 桑夫顿伯格沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 结核杆菌 产气肠细菌
60 63 60 61 47 50 5 6*
7 5~30 30 60 *指活菌数减少一个对数级即90%被杀死所需的时间。 蒸汽灭菌适用范围很广，但主要是培养基的灭菌。在培养基灭菌中最需注意不要过多破坏营养，特别是糖类。糖类在湿热灭菌时破坏情况见表3。
（三）实验材料 1. 大肠杆菌、红豆杉内生真菌。 2. 生化培养箱。 3. 超静工作台 3.接种环或无菌牙签。 4.酒精灯。 5.无菌培养皿。 6.肉汤培养基 牛肉膏 0.5g 水 100ml 蛋白胨 1.0g PH 7.2 NaCl 0.5g 加入1.2％琼脂，即为固体完全培养基（CM）。
7.PDA培养基：PDA）： 马铃薯煮汁 100毫升 蔗糖 2克 琼脂 1.5克 PH值 5.5～6.0
制法：先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮后切成小薄片，称20克，加水100毫升，煮沸20分钟后过滤，其滤汁为马铃薯煮汁。然后加琼脂和蔗糖煮溶，后补足水分至100毫升，装培养皿灭菌备用。
（四）操作步骤 1按上述要求配置2种培养基，分别装入培养皿； 2放入高压锅中蒸汽灭菌20min。 3待培养基冷却凝固后，在两种培养基上分别接种大肠杆菌和红豆杉内生真菌。37℃培养。 4 2天后检查生长情况。 3
（五）实验结果与讨论 1．如何保证灭菌效果？ 2 不同种类的微生物菌落形态有何差异？ 3 如何为微生物选择合适的培养基？
实验二、微生物的显微镜观察 （一）实验目的：通过实验使学生了解显微镜的结构和使用方法，了解和掌握微生物的染色技术。 （二）实验原理： （三）实验材料 1. 菌种 大肠杆菌，红豆杉内生真菌。 2. 染色液 草酸铵结晶紫染液；蕃红液。 3. 器具 显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，载玻片。 （四）操作步骤 1. 将固定好的涂片加滴结晶紫1min，若干了，还要补加染料。 2. 用缓冲流水去染料。 3. 加蕃红液复染30s。 4. 用缓冲流水冲去。 5. 用洗水纸吸干，直接用显微镜观察，先用低倍镜观察，然后用油浸镜观察，作图。
（五）染色操作步骤及注意点 染色法可以看到染色操作包括制片、固定、染色、媒染、脱色、复染、水洗、干燥等步骤，每一步都具有其操作要点和注意点，若不当心，可能就得不到满意的结果。 1. 制片 制片要采用干净的载波片，并注意接种环的无菌操作。做斜面菌体片时，要防止菌体和水混和不均匀有团结现象，注意菌体量适中。 2. 固定 涂片后最好先在室温下自然干燥，然后固定。固定的目的是：（1）杀死微生物，固定其细胞结构；（2）保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，因而可以防止标本被冲洗掉；（3）改变菌体对染料的通透性，一般使死细胞原生质染色。 固定常用高温。手执载波片一侧，标本面朝上，在火焰外层快速来回通过3～4次。共约3～4s，要求玻面温度不超过60℃，此时以手背皮肤接触不觉过烫为度，放置待冷后染色。由于热固定改变细胞的内部结构及外形，所以研究菌体细胞结构时常采用化学固定法。 常用的化学固定剂有：95％酒精、酒精和醚1：1的混和液、丙酮、1～2％锇酸溶液。适用于固定丝状菌的固定液介绍两种：（1）铬酸-醋酸-锇酸液：铬酸1g，冰醋酸1g，1％锇酸1ml。（2）铬酸-醋酸-福尔马林液：1％铬酸80ml，冰醋酸5ml，福尔马林15ml。 锇酸能很快固定细菌细胞而不改变其结构，因此用它来固定微生物细胞很方便。 3. 媒染与染色 标本固定以后，滴加染色液，使整个标本固定在染色液中。染色时间视标本与染色的性质而定，有时还需加热。一般染色时间为1～3min。 如作复合染色，要在染色前作媒染处理。媒染剂与染料能形成不溶性的化合物，它能增加染料和细胞的亲和力（表3-2）。媒染一般在固定后进行，但也可结合固定或染色同时进行。 5. 水洗与干燥 染色时间一到，就应用细小的缓流水将多余染料从标本上洗去，但不会将细胞所吸附的染料洗去。洗净后，将标本置桌上风干，也可用吸水纸轻轻吸去水分。有时也可微微加热，待干后再镜检。 6. 标本玻片的封藏 标本镜检后，有时需要长期保存，这是应将标本封存。常用的制 4
片粘着胶是加拿大胶，其制法是：混和等量的干加拿大胶和碳酸氢钠在乳钵内磨碎，加入等量二甲苯，制成透明溶液，约一星期后过滤，并微热，使溶液具适当稠度。保存在暗处，并外涂黑色。将此液滴加到标本中，上盖清洁盖玻片，压平，待干，保存。用此种中和性的加拿大胶保藏标本，较不易褪色。 （六）实验现象与分析
实验3- 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、实验目的：掌握聚丙烯酰胺凝胶的配置，电泳仪的使用，蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的原理与方法。 二、原理 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳按其电泳装置和凝胶的形状可分为垂直管型盘状电泳和垂直板型电泳。二者的操作原理和操作方式基本相同，不同的是前者在圆玻璃管内将凝胶做成圆柱状，后者在两块平板玻璃之间将凝胶做成平板状。 聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶的组成系统可分成四种： （1）连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的pH值和相同的缓冲液。 （2）不连续凝胶电泳：采用二层或三层性质不同的凝胶（即：样品胶、浓缩胶和分离胶）重叠起来，使用两种不同的pH值和不同的缓冲液。 （3）梯度凝胶电泳：采用梯度混合装置，使制得的凝胶由上至下孔径逐渐减小（即凝胶浓度由上至下逐渐增高）。梯度凝胶电泳主要适宜于测定球蛋白的相对分子质量。 （4）SDS-凝胶电泳：在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS（十二烷基硫酸钠Sodium Ddecyi Sul- fate）。 A.聚丙烯酰胺凝胶的制备原理 聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acrylamiae）和交联剂N，N一甲叉双丙烯酰胺（N，N-methylene bisacrylamide，简称 BIS）在催化剂的作用下聚合而成的。 所用的催化剂有两种：①用过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED）作为化学聚合催化剂。在TEMED或其他叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基。氧的自由基又使丙烯酰胺形成自由基，从而引发聚合作用。②用核黄素（vitb2）作为光聚合的催化剂。光聚合可用日光、日光灯或电灯作为光源。在痕量的氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基再被氧氧化形成自由基，从而引发聚合作用。 在聚丙烯酰胺凝胶制备时，改变单体丙烯酰胺的浓度可使凝胶网状结构中网眼的孔径改变。因此可根据被分离物质的相对分子质量大小选择适当的浓度。交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺的浓度对孔径也有一些影响。当丙烯酰胺的总浓度不变时交联剂的浓度占5％，则凝胶孔径最小；高于或低于5％，孔径都相对变大。一般使用时交联剂与单体浓度之比为2～5：100。 B.不连续电泳中样品压缩成层的原理 不连续电泳使用二层或三层不同孔径的凝胶，使用不同的pH和缓冲液，能使稀样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。 不连续电泳的凝胶由上至下可分为： （1）样品胶：为大孔径凝胶，在pH6.7～6.8的Tirs-HCl缓冲液中聚合而成，含有欲分离的样品。有时可不用这一层样品胶，而直接将样品液加入10％甘油或5％～20％蔗糖后，加在浓缩胶的表面。 （2）浓缩胶：在pH6.7～6.8的Tris-HCl缓冲液中聚合而成的大孔径凝胶。除了不含样品外，其他与样品胶相同。样品就是在浓缩胶中浓缩，按迁移率的不同，在浓缩胶与分离胶