酶工程-重点整理总结

第一章绪论

1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。

答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。

2、酶有哪些显著的催化特性？

答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（107~1013倍）；（3）酶催化作用条件温和。

3、简述影响酶催化作用的主要因素。

答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。

第二章微生物发酵产酶

1、试述酶生物合成的基本过程。

答：（1）RNA的生物合成—转录：转录的起始、RNA链的延伸、RNA链合成的终止、RNA前体的加工；（2）蛋白质的生物合成—翻译：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止、蛋白质前体的加工。

2、酶的生物合成有哪几种模式？

答：（1）同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行。（2）延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后酶还可以延续合成一段较长时间。（3）中期合成型：酶在细胞生长一段时间以后才开始，而细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停止。（4）滞后合成型：在细胞生长一段时间或进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累，又称为非生长偶联型。

3、如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？

答：（1）细胞活化与扩大培养；（2）培养基的配制；（3）pH的调节控制；（4）温度的调节控制；（5）溶解氧的调节控制：调节通气量、调节氧分压、调节气液接触时间、调节气液接触面积、改变培养液性质。

4、提高酶产量的措施有哪些？

答：（1）添加诱导物（2）控制阻遏物的浓度（3）添加表面活性剂（4）添加产酶促进剂。

10、简述固定化微生物细胞发酵产酶的特点。

答：①提高产酶率；②可以反复使用或连续使用较长的时间；③基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；④发酵稳定性好；⑤缩短发酵周期，提高设备利用率；⑥产品容易分离纯化；⑦适用于胞外酶等胞外产物的生产。（固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制：①固定化细胞的与培养；②溶解氧的供给；③温度的控制；④培养基组分的控制。）

11、固定化微生物原生质体发酵产酶的特点。

答：①变胞内产物为胞外产物；②提高产酶率；③由于有载体的保护作用，稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间；④易于分离纯化（固定化原生质体发酵产酶的工艺条件极其控制：①渗透压的控制；②防止细胞壁再生；③保证原生质体的浓度。）。

12、*优良的产酶微生物应当具备的条件：①酶的产量高；②产酶稳定性好；③容易培养和管理；④利于酶

的分离纯化；⑤安全可靠、无毒性。

13、*酶的发酵根据微生物培养方式不同：固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物细胞发酵、固定化微生物原生质体发酵。

14、*酶生物合成的调节：分解代谢物阻遏作用、酶生物合成的诱导作用、酶生物合成的反馈阻遏作用。

15、*组成型酶：在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大。适应型酶/调节型酶：在细胞中含量变化大，其合成速率明显受到环境因素的影响。

16、*在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有4种：①结构基因：与多肽链有各自的对应关系。②操纵基因：可以与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。③启动基因：决定酶的合成能否开始，有两个位点，RNA聚合酶结合位点和cAMP-CAP结合位点。④调节基因：可以产生一种阻遏蛋白。结构基因、操纵基因、启动基因一起组成操纵子。

17、*常用的产酶微生物：①细菌：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌：（最广泛）α淀粉酶、蛋白酶、β葡聚糖酶、5’-核苷酸酶和碱性磷酸酶。②放线菌：链霉菌：葡萄糖异构酶。③霉菌：红曲霉可用于生产α淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶；黑曲霉；米曲霉；青酶；木霉；根酶；毛酶。⑤酵母：啤酒酵母；假丝酵母。

18、*培养基：碳源、氮源、无机盐、生长因子。

19、*最适pH：细菌、放线菌6.5~8.0；酵母、霉菌4~6 偏酸；植物细胞5~6.

第四章酶的提取与分离纯化

1、细胞破碎的方法主要有哪些？各有何特点？

答：细胞破碎是通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。

特点：①机械破碎法：处理量大，破碎效率高，速度快。②物理破碎法：处理条件比较温和，有利于目标产物的高活力释放回收，但破碎效率低，产物释放速度快，处理时间长，不适合大规模细胞破碎的需要。多局限于实验室规模的小批量使用。③化学破碎法：优点：比机械破碎法的选择性高，胞内产物总释放率低，料液黏度小，有利于后处理。缺点：通透性差，时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过5%，有些化学试剂有毒。④酶促破碎法：优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。

2、试述酶提取的主要方法。

答：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液的过程，也称为酶的抽提。主要影响因素有：温度、pH、提取液的体积。

3、简述酶沉淀分离方法的原理与特点。

答：沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离的技术过程。（最多的是硫酸铵）

特点：①盐析沉淀法：不同浓度的蛋白质浓度产生沉淀所要求的临界浓度不同；蛋白质浓度大时，中性盐极限沉淀低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少，蛋白质溶解损失小；蛋白质浓度低时相反，中性盐极限沉淀高，共沉作用弱，分辨率高，但用盐量增大，蛋白质回收率低。②等电点沉淀法：在溶液的pH等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来；由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全；在实际使用时，等电点沉淀法往往与其他方法一起使用；有时单独使用等电点沉淀法主要是用于粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。③有机溶剂沉淀法：一般比盐析法析出的沉淀易于离心或过滤分离，不含无机盐，分辨率也比较高；但是有机溶剂沉淀法容易引起酶的变性失活，所以必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。

7、酶结晶的主要方法有：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法。

*填空题：常速/低速离心机最大转速8000r/min；高速离心机(1~2.5)*104r/min；超速离心机(2.5~12)*104r/min。

第五章酶分子修饰

1、试述酶分子修饰的概念和作用。

答：通过各种方法使酶分子的结构发生某些变化，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些合理的改变，就有可能提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变酶的底物专一性等，同时通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与催化特性之间的关系。

2、何谓金属离子置换修饰？简述其主要修饰过程和作用。

答：（1）把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。（2）方法：酶的分离纯化、除去原有的金属离子、加入置换离子。（3）作用：①阐明金属离子对酶催化作用的影响；②提高酶的催化效率；③增强酶的稳定性；④改变酶的动力学特性。

3、何谓大分子结合修饰？有何作用？

答：（1）采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法称为大分子结合修饰。（最广泛）（修饰剂的选择、修饰剂的活化、修饰、分离）（2）作用：①通过修饰提高酶的催化效率；②通过修饰可以增强酶的稳定性；③通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性。

6、简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用。

答：定点突变是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术，是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。定点突变技术是氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰的常用方法，也是蛋白质工程的常用技术。（1）主要过程：①新的酶分子结构的设计；②突变基因碱基序列的确定；③突变基因的获得；③新酶的获得。（2）应用：①酪氨酰-tRNA合成酶的修饰是将第51位的苏氨酸由脯氨酸置换，苏氨酸的密码子是ACU、ACC、ACA、ACG，脯氨酸的密码子是CUU、CCC、CCA、CCG，在mRNA 上只需将密码子上的第一个A换成C，在对应的基因上只需将T换成G即可达到置换的目的。②T4溶菌酶的修饰是将第3位以异亮氨酸（密码子为AUU、AUC、AUA，对应基因上的碱基次序为TAA、TAG、TAT）置换成半胱氨酸（密码子为UGU、UGC，对应基因上的碱基次序为ACA、ACG），只需在对应基因的位点上置换两个碱基，由AC置换TA即可。

7、*酶分子的修饰：①金属离子置换修饰；②大分子结合修饰；③侧脸集团修饰：氨基修饰、羧基修饰（碳化二亚胺EDC最普遍，可以在较温和的条件下与酶分子的羧基发生酯化反应，可定量测定酶分子中羧基的数目）、巯基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰；④肽链有限水解修饰；⑤核苷酸链剪切修饰；⑥氨基酸置换修饰：化学修饰法、定点突变技术；⑦核苷酸置换修饰；⑧物理修饰。

8、*酶分子修饰的应用：（1）在酶学研究方面的应用：①酶的活性中心研究；②酶的空间结构研究；③酶的作用机制研究（亲和标记法、差示标记法、氨基酸置换法、核苷酸置换法）。（2）在医药方面的应用：①降低或消除酶抗原性；②增强医药用酶的稳定性。（3）在工业方面的应用：①提高工业用酶的催化效率；②增强工业用酶的稳定性；③改变酶的动力学特性。（4）在抗体酶研究开发方面的应用（抗体酶又称催化性抗体，是一类具有催化功能的抗体）。（5）在核酸类酶人工改造方面的应用。（6）在有机介质酶催化反应中的应用。

第六章酶、细胞、原生质体固定化

1、举例说明常用的固定化方法。

答：（1）酶的固定化方法：①吸附法（纳米级颗粒，活性炭）；②包埋法（琼脂糖、海藻酸钠）：凝胶包埋法、半透膜包埋法；③结合法（选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方式。）离子键结合法、共价键结合法（重氮法、EDC是一个氨基和羧基在中性条件下有效结合形成肽键、叠氮法、溴化氰法、烷基化法）④交联法（与结合法区别：有两个功能基团）（戊二醛是很重要的交联剂，也是很重要的细胞固定化剂，有两个交联基醛基，两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基反应，形成希夫碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。）（由于交联反应条件较为激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大）⑤热处理法。（2）细胞固定化的方法：①吸附法；②包埋法（动物细胞吸附：微载体是指颗粒细小的固定化载体，中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成）。（3）原生质体固定化方法：吸附和包埋（常用凝胶包埋法：琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法、海藻酸钙凝胶固定化法、角

叉菜胶固定化法、光交联树脂固定化法）。（固定化原生质体可用于氨基酸的生产和胞内酶的生产）

2、何谓固定化酶？固定化酶的特性与游离酶比较有哪些改变？

答：固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有提高酶的催化效率、增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。固定化酶的特性：①稳定性：热稳定性提高；保存稳定性提高、保存时间较长；对蛋白酶的抵抗性增强、不易被蛋白酶水解；对变性剂的耐受性提高。②最适温度：有些与游离酶差不多，有些变化较大。③最适pH变化（因为有些基团消失）。④底物特异性（其变化与底物分子质量大小有关）。

第七章酶非水相催化

1、简述酶非水相催化的概念与特点。

答：酶在非水介质中的催化作用称为酶的非水相催化。酶的非水相催化是通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改进酶的催化特性。主要内容包括有机介质中的酶催化、气相介质中的酶催化、超临界流体介质中的酶催化和离子液介质中的酶催化。

2、酶在有机介质中与在水溶液中的特性有何改变？

答：酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响。在以下方面表现出与水相介质中不同的催化特性：①底物专一性；

②对映体选择性；③区域选择性（基因选择性）；④键选择性；⑤热稳定性；⑥pH特性（通常接近或相同）。

3、什么是必需水和水活度？水对非水相中酶的特性有何影响？

答：水对有机介质中酶催化的影响：（1）水对酶分子空间构象的影响：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。必需水与酶分子的结构和性质有密切关系，是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的。（2）水对酶催化反应速度的影响：在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。（3）水活度：在有机介质体系中，酶的催化活性会随着结合水量的增加而提高。水活度（Aw）是指体系中水的逸度与纯水逸度之比。通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响。

4、有机溶剂对酶催化有何影响？

答：有机溶剂对酶催化的影响：（1）有机溶剂对酶结构与功能的影响：在水溶液中酶分子均一的溶解于水中，可以较好的保持器完整的空间结构，在有机溶液中，酶分子（修饰后可溶于有机溶剂的除外）不能直接溶解，悬浮在你溶剂中进行催化反应，包括①有机溶剂对酶分子表面结构的影响；②有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响。（降低结合能力）（2）有机溶剂对酶活性的影响：有些极性较强的有机溶剂会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起酶的变性失活。（3）有机溶剂对底物和产物的影响：有机溶剂与水的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。

5、如何控制有机介质中酶催化反应的条件？（有机介质中酶催化反应的条件及其控制）

答：①有机介质中酶催化反应的类型：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应②酶的选择：注意酶浓度、催化反应速度大小、酶的稳定性、底物专一性、对映体选择性、区域选择性、键选择性③底物的选择和浓度控制④有机溶剂的选择⑤水含量的控制⑥温度控制⑦pH控制。6、*有机介质反应体系：微水介质体系、与水溶性有机溶剂组成的均一体系、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系、正胶束体系、反胶束体系。

第八章酶定向进化

突变基因的高通量筛选技术主要有哪些？各有什么特点？

1、*酶基因的随机突变：易错PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术。

第九章酶反应器

1、试述酶反应器的主要类型和特点。

第十章酶的应用

1、举例说明酶在疾病诊断、疾病治疗和药物制造方面的应用。

答：（1）诊断：①根据体内酶活性变化诊断：酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、转氨酶（肝炎）、乳酸脱氢酶、乳酸脱氢酶同工酶、葡萄糖磷酸异构酶、胆碱酯酶、端粒酶（癌变）。②用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病：葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶＋过氧化物酶（糖尿病）、尿素酶（肾）、胆固醇氧化酶（高血脂）、谷氨酰胺酶（肝炎）、DNA聚合酶（癌基因）、酶标免疫检测法检测抗原、抗体。（2）治疗：蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶、溶菌酶（抗菌消炎）、超氧化物歧化酶、L-天冬酰胺酶、尿激酶（是一种具有溶解血栓功能的碱性蛋白酶，抗血栓）、纳豆激酶（溶解血栓）、豆豉纤溶酶、凝血酶、组织纤溶酶原激活剂、乳糖酶、核酸类酶。（3）制药：青霉素酰化酶制造半合成抗生素、β-酪氨酸酶制造多巴、核苷磷酸化酶制造阿糖腺苷、无色杆菌蛋白酶制造人胰岛素、多核苷酸磷酸化酶生产聚肌胞、β-D-葡萄糖苷酶制造抗肿瘤人参皂苷。

2、酶在食品保鲜和食品生产方面有哪些重要应用？

答：（糖化酶：用于淀粉糖化、制造葡萄糖、果葡糖）（1）保鲜：①食品除氧保鲜；②蛋类制品脱糖保鲜；

③食品灭菌保鲜。（2）生产：①淀粉类食品生产：葡萄糖、果葡糖浆、饴糖、麦芽糖、糊精、麦芽糊精、环状糊精；②蛋白质类食品生产：水解蛋白、氨基酸、明胶、干酪、低乳糖奶；③果蔬食品生产：柑橘制品去除苦味、柑橘罐头防止白色浑浊、果蔬制品脱色、果汁生产；④食品添加剂生产方面：酸味剂、食品增味剂、甜味剂、乳化剂；⑤改善食品的品质和风味。

3、举例说明酶在轻工、化工、生产方面的应用。

答：（1）原料处理方面：发酵原料的处理、纺织原料的处理、制浆及造纸原料的处理（用木质素酶）、生丝的脱胶处理、羊毛的除垢处理、皮革的脱毛处理、烟草原料的处理、甜菜糖蜜的处理、植物油的脱胶处理。（2）制造方面：酶法生产L-氨基酸、酶法生产有机酸、酶法制造化工原料。（3）加酶增强产品的使用效果：加酶洗涤剂、加酶牙膏牙粉漱口水、加酶饲料、加酶护肤品。

4、举例说明酶在环境保护方面的应用及其意义。

答：（1）环境监测方面：利用胆碱酯酶检测有机磷农药污染、利用乳酸脱氢酶的同工酶检测重金属污染、通过β-葡聚糖苷酸酶检测大肠杆菌污染、利用亚硝酸还原酶检测水中亚硝酸盐浓度。（2）废水处理方面：活性污泥。（3）可生物降解材料开发方面：利用脂肪酶的有机介质催化合成聚酯类物质、聚糖类物质，利用蛋白酶或脂肪酶合成多肽类或酰胺类物质。

5、酶在生物技术领域有哪些重要用途？

答：（1）除去细胞壁方面：在胞内物质的提取、原生质体的制备时。去除细菌、酵母、霉菌、植物细胞壁。（2）在大分子切割方面：限制性内切核酸酶、DNA外切核酸酶、碱性磷酸酶、核酸酶、自我剪切酶、RNA 剪切酶。（3）在分子拼接方面：DNA连接酶、DNA聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶、逆转录酶、蛋白酶、脂肪酶和酯酶、自我剪接酶。