Magainin和cecA_mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达
猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达
猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达刘健;陈瑞爱;刘珊珊;朱杰仪;唐明森;罗满林【期刊名称】《华南农业大学学报》【年(卷),期】2011(032)001【摘要】根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经ZeocinTM抗性筛选后获得大量多拷贝重组子,SDSPAGE和Wester-blot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出相对分子质量约为19 000的PoIFN-α特异蛋白,其有效蛋白表达量较高达54.105 mg/L.经Vero-VSV系统测定,PoIFN-α效价达到5.87×107 U/L.试验将PoIFN-α成熟肽全基因密码子进行改造,并实现了其在毕赤酵母菌表达系统中的高效分泌表达.【总页数】5页(P93-97)【作者】刘健;陈瑞爱;刘珊珊;朱杰仪;唐明森;罗满林【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;广东大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴,527439;莱芜市畜牧办公室,动物疫病与预防控制中心,山东莱芜,271100;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;广东大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴,527439【正文语种】中文【中图分类】S852.4【相关文献】1.猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达 [J], 黄志清;胡宏宇;陈小玲;任立明;林爱星;陈永福2.猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N-糖基化分析 [J], 欧阳菁;杨林;龙綮新;王珣章;邢珂;魏平华3.猪IFNα基因在毕赤酵母中的高效分泌表达 [J], 黄海;谢蓓;于瑞嵩;刘惠莉;张德福;曹祥荣;李震4.密码子优化的隔孢伏革菌植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达 [J], 陆益新;王瑞鲲;田永杰;吴倩倩;李湘鸣5.猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达 [J], 葛丽;李震;于瑞嵩;刘惠莉;张德福;周智爱;尹逊和因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组人Hepassocin在毕赤酵母中的分泌型表达、纯化与活性鉴定
2.1 材 料 ............................................................................................................................................. 11
摘 要......................................................................................................................................................3
2.1.1 菌株和质粒 .............................................................................................................................. 11 2.1.2 引物 .......................................................................................................................................... 11 2.1.3 工具酶及相关试剂 .................................................................................................................. 11 2.1.4 主要仪器设备 .......................................................................................................................... 11 2.1.5 层析柱及填料 ..........................................................................................................................12 2.1.6 常用试剂的配制 ......................................................................................................................13
抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达
抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达陈海旭;邹冠玉;屈贤铭;杨胜利【期刊名称】《中国生物化学与分子生物学报》【年(卷),期】2002(18)4【摘要】用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽magainin基因片段 ,合成片段拼接后 ,与pUC19重组 ,获得magainin基因 .Magainin基因与酵母表达载体pPIC3重组 ,构建胞内表达载体pPIC3 Mag ,电击法转化GS115宿主菌 ,经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .阳性克隆用甲醇诱导表达 ,用免疫印迹法确定了产物的正确性 .【总页数】4页(P461-464)【关键词】抗菌肽;Magainin基因;克隆;酶母表达;pPIC3【作者】陈海旭;邹冠玉;屈贤铭;杨胜利【作者单位】中国科学院上海生物工程研究中心【正文语种】中文【中图分类】Q51;Q78【相关文献】1.抗菌肽MagaininⅡ基因的克隆及其在E.coil BLP中的融合表达 [J], 陈晓平;詹冬玲;贾惠文;商雪娇;钱爱东2.抗菌肽Japonicin Ⅱ基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达 [J], 尹佳;詹冬玲;崔敬爱;陈晓平3.华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达 [J], 王乐乐;喻晓蔚;徐岩4.凋亡抑制因子Survivin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达 [J], 王跃华;张青云5.抗菌肽ABP3基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达 [J], 沈俊卿;田昱因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毕赤酵母常用表达载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达
乳糖 是在 哺乳 动 物乳 汁 中发现 的一 种二 糖 ，在 乳 汁 中通 常含 有 ５ 左右 。乳 糖 被 小 肠上 皮 细 胞 的 ％
水 解 酶分解 才 能被 吸 收利用 。小 肠上 皮 细胞半 乳糖
苷酶 的缺乏 可造 成消 化不 良 。如母乳 不 耐受 ， ｊ
又称乳 糖 不耐 受 ，通 常指 由于新 生儿 小肠 粘膜 乳 糖 酶 缺乏 ，导致奶 中乳糖 消化 吸 收障碍 而 引起 的 以腹
Ｂ ｎ （ ９ ９ ３ ） 。 分 析 密 码 子 偏 好 性 。根 据 ａ ｋ ＡＭ ９ ３ ５ 分析 结果 获得 优化 后 的基 因序 列 。同时 ，在基 因 的
最近 ，有研究报道在一种酸性环境中分离到一
种黑 曲 霉 （ ｓｅ ｉｕ ｉｅ，Ａ ｎ ｅ ｖｎ Ｔｅｈ ， Ａｐｒ ｌ ｓｎｇｒ ． ｉ ｒ ａ ｉ ） ｇｌ ｇ ｇ
可 以产 生一 种 耐 酸 性 的 Ｂ半 乳 糖 苷 酶 。该 基 因
被 克 隆并 在 酵 母 中得 到 表 达 。重 组 耐 酸 性 Ｂ半 乳 糖苷 酶具 有 和天 然酶 一样 的 活性 ，具有 相 同 的理化 性 质 ，在 酸 性条 件下 酶活性 稳 定 ，具有 商业 化 的可 能 。为 能使 这种 酶产 业化 ，提 高表 达水 平 ，笔 者根 据 酵母偏 好 性 密 码 子 ，重 新 合 成 编码 耐 酸 性 ８半
酶 活性 。
关键词 ：酸性 ０一 半乳糖苷酶 ；密码子适应指数 ；毕赤酵母 ；分泌表达
中图分 类 号 ：Ｑ ５ ７３ 文 献标 志码 ：Ａ 文章 编 号 ：１ ７ ４ ３ （ ０ ２ ３— １ ３— ４ ６ ３— ９ ９ ２ １ ）０ ０ ５ ０ 乳 糖苷 酶基 因 ，并在 毕赤酵 母 中进行 提高 表达 水平
采用组合策略提高灰色链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达
2021年第47卷第20期(总第440期)15 DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.027258引用格式:彭文坚,张娟,刘松.采用组合策略提高灰色链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达[J].食品与发酵工业,2021,47(20):15-21.PENGWenjian,ZHANGJuan,LIUSong.High-levelproductionofStreptomycesgriseustrypsinbyrecombinant
Pichiapastorisusingacombinedstrategy[J].FoodandFermentationIndustries,2021,47(20):15-21.
采用组合策略提高灰色链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达
彭文坚1,2,张娟2,刘松1,2∗1(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学),江苏无锡,214122)2(江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122)摘 要 胰蛋白酶是一种重要的工业酶,广泛应用于皮革加工、食品加工和医药等领域。该研究从菌株改造及发酵条件优化两方面提高了灰色链霉菌胰蛋白酶(Streptomycesgriseustrypsin,SGT)在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的发酵产量。首先,分析了4种分子伴侣(Cne1、Bmh2、Ssa4和Vhb)和2种转录因子(Yap1、Aft1)对SGT在P.pastorisGS115中表达的影响。摇瓶发酵结果显示,与转录因子Aft1共表达时SGT酶活力较对照菌提高了19.71%,达到217.30U/mL;其他转录因子或分子伴侣的共表达降低了SGT产量。其次,确定了菌株PP-SGTm/Aft1的最适生长pH和最适诱导pH分别为5.5和6.5。最后,优化了PP-SGTm/Aft1在5L罐中诱导产酶过程中流加混合碳源(甲醇-山梨醇)的比例。结果显示,当补加的m(甲醇)∶m(山梨醇)=20∶0.5时,5L罐SGT酶活力达到了2667.24U/mL(144h),较仅流加甲醇酶活力提高了20.1%。研究结果将为SGT工业化发酵生产提供重要基础数据。关键词 胰蛋白酶;毕赤酵母;分子伴侣;转录因子;发酵优化;混合碳源
毕赤酵母对甲醇胁迫的响应及其对蛋白表达的影响
ｇｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ５５００００）
迫，例如代谢产物、不适温度、ｐＨ 和离子强度等胁迫，这些胁
迫可能会显著影响细胞的生理特性，包括蛋白合成和分泌表
达能力，该问题已经受到越来越多的科研工作者的关注。 毕
赤酵母是甲基营养型酵母，能以甲醇作为唯一碳源和能源，
同时，甲醇也是诱导毕赤酵母外源蛋白表达最常用的诱导
物，但甲醇本身对宿主也会产生胁迫效应。 因此，若要获得
物饥饿等［２０］ 都会激发此通路。 ＵＰＲ 下游靶基因功能涵盖大
在细胞质中被甲醛脱氢酶（ ＦＬＤ１） 催化为甲酸，接着被甲酸
等，对细胞生理特性影响也十分广泛，有些效应并不与蛋白
被醇氧化酶（ＡＯＸ１ 和 ＡＯＸ２）转化为甲醛和过氧化氢。 甲醛
脱氢酶转化为二氧化碳和水，并释放能量；或是甲醛在二羟
丙酮合成酶（ＤＡＳ１）作用下与 ５－磷酸木酮糖合成 ３－磷酸甘
Ｌｉ 等［１５］ 研究发现，在甲醇诱导阶段，毕赤酵母能量代谢途径
普遍下调。
２．３ 诱发氧化胁迫响应（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ） 毕赤酵
母需要提高过氧化物酶水平来抵御甲醇的毒害作用［１６］ 。 在
部分新生肽合成、折叠、翻译后修饰、运输途径和 ＥＲＡＤ 途径
表达有直接的关联。
ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ） ［１０］ 均 能 获 得 理 想 的 表 达 水 平。
Ｖａｎｚ 等［１１］ 报道，诱导表达乙肝表面抗原（ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ
杂合抗菌肽CecA-Mag的人工合成及其在Pichia pastoris中的分泌表达
杂合抗菌肽CecA-Mag的人工合成及其在Pichia pastoris中的分泌表达王秀青;苏春霞;周斌;曹瑞兵;陈溥言【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2007(47)1【摘要】根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA,CA)N端第1～7个氨基酸残基,马盖宁(magainin,M)N端第2-12个氨基酸残基,以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1～7)-M(2～12)基因,同载体pPICZα-A连接后转化Pichiapastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1.9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达,抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G-菌及G+菌均有较好的抑菌活性.初步抑菌活性测定,显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性.酸稳定实验显示pH为3.2时仍具有相当高的活性.热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性.这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景.【总页数】4页(P75-78)【作者】王秀青;苏春霞;周斌;曹瑞兵;陈溥言【作者单位】南京农业大学,农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学,农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学,农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学,农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学,农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】Q5【相关文献】1.抗菌肽Japonicin Ⅱ基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达 [J], 尹佳;詹冬玲;崔敬爱;陈晓平2.新疆家蚕抗菌肽(Cecropin-XJ)在Pichia pastoris中的表达 [J], 刘忠渊;张富春;赵干;单文娟;钟哲;王宾3.抗菌肽ABP3基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达 [J], 沈俊卿;田昱4.CecA-Mag及其突变体在Pichia pastoris中的表达及抗菌活性试验 [J], 王秀青;朱明星;张爱君;杨风琴;哈丽娜5.抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达 [J], 陈海旭;邹冠玉;屈贤铭;杨胜利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测
人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测申艳敏;魏建超;尚书文;牛明福;周玉珍;周斌;曹瑞兵;陈溥言;侯继波【期刊名称】《微生物学通报》【年(卷),期】2008(35)4【摘要】根据GenBank CAA86115中的LL-37氨基酸序列,选择毕赤酵母偏好密码子,采用SOE 方法合成了人源抗菌肽LL-37基因.所合成的LL-37基因全长为141 bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗茵肽具有天然N端.基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-LL-37.pPICZα-A-LL-37经Sac Ⅰ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33.PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌LL-37于发酵上清液,其表达量为206mg/L.表达产物LL-37耐热性强,在100℃条件下40 min内抗茵活性不变,煮沸3 h以上仍具有活性.琼脂糖孔穴扩散法检测显示LL-37对多种革兰氏阴性茵和阳性菌均具有很好的抑制活性,其对金黄色葡萄球菌Cowan I (Staphylococcus aureus)、致病性大肠杆菌K99(Enteropathogenic E.coli)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)分别为1.56 μg/mL、3.12 μg/mL和1.56 μg/mL.【总页数】6页(P539-544)【作者】申艳敏;魏建超;尚书文;牛明福;周玉珍;周斌;曹瑞兵;陈溥言;侯继波【作者单位】南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京,210014;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京,210014;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京,210014;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京,210014【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.人源抗菌肽LL-37在创伤修复中的研究进展 [J], 丁静;沈娟;朱家勇;金小宝2.抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定 [J], 刘德辉;何俊;林云熊;黄毓茂3.人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的高效表达及活性检测 [J], 王娜; 何成霞; 邹强; 苟兴华; 陈松; 吴昊俣; 蔡心析; 许天恒4.人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达 [J], 陆建荣;王惠民;吴萍;黄松平;常秋月;凌勇武;倪晓蓉5.人源抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达 [J], 韩艳非;袁红艳;廖翔宇;刘超;常雅萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定
抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定刘德辉;何俊;林云熊;黄毓茂【摘要】为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL37.pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrⅡ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168.经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合.在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237 mg/L.表达产物耐热性强,在100℃条件下30 min内仍保持一定的抗菌活性.表达产物对大肠杆菌DH5 α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)002【总页数】5页(P98-101,120)【关键词】抗菌肽LL-37;基因设计;高效表达;活性鉴定【作者】刘德辉;何俊;林云熊;黄毓茂【作者单位】华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S852.5抗菌肽(Antimicrobial peptides)最初是从昆虫的血淋巴细胞中发现的一类碱性多肽类物质，具有广谱抗菌活性，是生物先天性免疫的重要组成成分[1]。
Boman G 等人首次从天蚕蛹中发现抗菌肽Cecropins[2]，作为一种阳离子小肽，抗菌肽以其高效、广谱、抗菌机理独特等优点，日益成为最具开发前景的新型抗菌药物。
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Magainin和cecA2mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达
张素芳1 贾 1,2 蔡梅红1 仇妍虹1 陈溥言13(1南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室 南京 210095
2沈阳农业大学动物医学院 沈阳 110161)
摘要 选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin基因和cecA2mil杂合肽基因全长分别为101bp和60bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。其中,cecA2mil杂合肽基因根据cecropinAN端第1～7个氨基酸残基、melittinN端第5～12个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZα2A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα2A2mag和pPICZα2A2CM。在AOX1(醇氧化酶)启动子调控下,类似天然抗菌肽大小的magainin及cecA2mil蛋白获得分泌表达,其表达量分别为105mgΠL和118mgΠL。初步抑菌活性测定,显示两者对金黄色葡萄球菌及E.coliDH5α有较好的抑杀活性。关键词 抗菌肽 基因改造 SOE 毕赤酵母 分泌表达
收稿日期:2004202225 修回日期:2004205217
3通讯作者,电子信箱:aid@njau.edu.cn
抗菌肽(antibacterialpeptides,ABP)是生物体产生的一种阳离子小肽,具有广谱抗菌活性[1,2],其作为广谱抗菌药物所具有的应用开发前景十分可观。相反,传统的从天然资源中提取的抗菌肽成本高、得率低、工序繁琐;合成肽则价格相当昂贵,也难以应用于临床。由于抗菌肽基因一般都比较小,故可以采用人工合成的方法来获得目的基因,再进行基因工程生产。美国马盖宁公司通过基因工程生产的magainin类似物MSI278,上世纪末就已进入Ⅲ期临床实验阶段[3]。我们根据magainin、cecropin和milittin的氨基酸序列,选用毕赤酵母偏好密码子[4],兼顾大肠杆菌偏好性,消除潜在的糖基化位点,设计并合成了新型抗菌肽magainin基因和cecA2mil杂合肽基因,其中后者是由cecropinA成熟肽N端1～7位氨基酸和milittin成熟肽N端5～12位氨基酸杂合而成的15肽。在基因合成过程中,我们尝试了SOE(genesplicingbyoverlapextension,geneSOEing)和降落PCR(touchdownPCR)新方法。由于抗菌肽本身对原核宿主菌的杀伤作用,不适合在原核系统中直接表达,一般选用融合表达或真核表达。在此,我们选用Pichiapastoris系统并成功表达了抗菌肽magainin和杂合抗菌肽cecA2mil。
1 材料与方法111 主要材料E.coliDH5α为本实验室保存;Pichiapastoris受体菌X233
(
His
-Mut+
)、表达载体pPICZα2A购自
Invitrogen公司,指示菌金黄色葡萄球菌(CowanⅠ)由河南农业大学王川庆教授惠赠。T4DNAligase、T4polynucleotidekinase、dATP、pyrobestTMDNApolymerase、限制性内切酶购自TaKaRa公司。Tricine、SDS2PAGE低分子量Marker购自生星生物公司;Zeocin购自Invitrogen公司;其它试剂均为进口或国产分析纯产品。112 抗菌肽基因设计根据magainin、cecropin和milittin的氨基酸序列,选用毕赤酵母偏好密码子,利用DNAStar、primer
premier软件设计了4个基因片段:F1、F2、F3和F4。其中F1和F2扩增改造后的magainin成熟肽基因,
2个片段的3′端有18个bp的互补序列,符合geneSOEing(genesplicingbyoverlapextension)的要求。F3为正义链序列,F4为反义链序列,2个片段经过磷
第24卷第7期中 国 生 物 工 程 杂 志CHINABIOTECHNOLOGY2004年7
月
© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net酸化、退火后,形成两端带有EcoRⅠ、XbaⅠ粘性末端的cecA2mil杂合肽序列。113 基因合成F1、F2片段长度分别为59bp、56bp,F3、F4长度均为63bp,由上海博亚合成。11311 magainin基因的SOE合成 应用SOE法,以F1、F2片段互为模板互为引物进行PCR扩增,合成magainin成熟肽基因。为了保证SOE合成的特异性,我们采用了降落(touchdown,TD)PCR技术进行优化。TD2PCR反应条件:10×PCRBuffer(Mg++free)510μl,MgCl2(25mmolΠL)310μl,dNTP(10mmolΠL)110μl,F1、F2(100pmolΠL)各110μl,TaKaRaExTaqTM015μl,灭菌超纯水3815μl,总体积50μl,混匀,瞬间离心,进行TD2PCR。94℃预变性2min,进入TD2PCR循环:94℃30s,退火温度从65℃降至50℃,每循环1min,每一个循环降低015℃,72℃1min,共30个循环后温度降至50℃,再在最适退火温度55℃的条件下进行15个循环。最后72℃延伸7min,取TD2PCR产物10μl,2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统下观察并记录拍照。11312 cecA2mil杂合肽基因的合成 F3、F4片段进行5′端磷酸化,退火,以合成cecA2mil杂合肽基因。(1)合成基因片段F3、F4的磷酸化 磷酸化体系如下:10×T4PNKBuffer510μl,dATP(10mmolΠL)110μl,T4PNK210μl,F3(100pmolΠL)或F4(100pmolΠL)1510μl,灭菌超纯水27μl,反应体系共50μl,混匀,37℃水浴1h。75℃5min以灭活T4PNK酶,后转入退火操作。(2)合成基因片段F3、F4的退火 取上述磷酸化产物等比例混合,置于85℃水浴锅温育1min后,关闭水浴锅电源,自然冷却至室温后取出,-20℃保存备用。114 序列测定基因工程操作根据文献[5]进行。MagaininPCR产物经PCR产物纯化试剂盒(Roche)纯化后,直接进行XhoⅠ、XbaⅠ双酶切,定向插入酵母表达载体pPICZα2A中,构建magainin重组质粒;CecA2mi磷酸化退火产物通过EcoRⅠ、XbaⅠ位点插入pPICZα2A。缺失酶切位点鉴定阳性的质粒命名分别为pPICZα2A2Mag、pPICZα2A2CM,送TaKaRa公司测序。115 抗菌肽重组酵母表达体系的建立及诱导表达X233感受态的制备、酵母的电击转化、重组酵母表型鉴定及筛选,均按Invitrogen公司提供的Pichiapastoris操作手册进行。116 重组表达抗菌肽的Tricine2SDS2PAGE重组magainin抗菌肽的分子量约为216kDa,
cecA2mil的分子量为119kDa,理论上,分子量低于15kDa的多肽在常规Tris2甘氨酸电泳系统中难以得到理想的电泳分辨率[6]。在此,我们使用Tricine
(三羟甲基氨基甘氨酸)代替甘氨酸作为终止离子
,
并增加电泳缓冲液的摩尔浓度,使重组magainin多肽得到了较好的分辨率及带型。117 重组抗菌肽抑菌活性的初步测定抑菌活性测定采用琼脂孔穴扩散法:将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌(CowanⅠ)悬浮液(A
600
=0163)15μl,与55℃的LB固体培养基25ml混匀后
铺平板,等其凝固后,用高压过的打孔器(直径5mm)打孔,滴加40μl待测表达上清的浓缩样品,37℃培养过夜,以同体积同倍浓缩的pPICZα2A空载体转化酵母表达蛋白为阴性对照。
2 结 果211 基因设计设计的magainin、cecA-mil基因的碱基序列如图1、图2所示。所合成的Magainin基因全长101bp,包括23个氨基酸的编码序列(包括起始密码子和终止密码子),基因N端设有EcoRⅠ、Xho
Ⅰ识别序列,C端设有XbaⅠ识别序列。CecA2mil基因全长60bp,包括15个氨基酸的编码序列和终止密码子,基因N端、C端分别设有EcoRⅠ、XbaⅠ粘性末端,并在基因的N端引入毕赤酵母Kex2蛋白酶裂解位点。212 基因合成及克隆鉴定F1、F2互为模板互为引物进行TD2PCR扩增,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,可观察到大小约为101bp的单一条带(图3)。F3、F4经磷酸化退火形成大小约60bp的cecA2mil基因,两端带有EcoR
Ⅰ、XbaⅠ粘性末端。
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