2018_2019学年高中生物专题1基因工程的基本操作程序1.2.2目的基因的导入、检测与鉴定学案新人教版

1．2.2 目的基因的导入、检测与鉴定 [学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。

方式一 通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。 在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。 方式二 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

一、将目的基因导入受体细胞 1．转化的含义 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2．转化的方法 (1)导入植物细胞 ①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。

a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。 b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插 入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。 ②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。 目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。 ③花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 (2)导入动物细胞 ①方法：显微注射技术。 ②常用受体细胞：受精卵。 ③步骤：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物 (3)导入微生物细胞 ①原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。 ②常用的方法： a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。 b．感受态细胞和重组表达DNA分子在缓冲液中混合，细胞吸收重组表达载体DNA分子。 归纳总结 1．上述方法中，在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。 2．对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。 例1 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现____________________________________________________________________ ________________________________________________________________________的目的。 具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞____________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____________(部位)即可。 (2)根据T-DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制______________________酶合成的基因。 (3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是__________类化合物。 (4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取____________________________(至少写出两种)。 答案 (1)单子叶植物 将目的基因导入植物细胞 染色体的DNA T-DNA片段(内部) (2)DNA连接酶、限制 (3)酚 (4)基因枪法、花粉管通道法 解析 (1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞的目的。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据T-DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。 易错易混 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 例2 下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( ) A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效 B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C．大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变 D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法 答案 A 解析 不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有利弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化。 二、目的基因的检测与鉴定 1．分子水平的检测 (1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中：DNA分子杂交技术。

用放射性同位素标记的含有目的基因的单链DNA片段制成基因探针。将转基因生物的基因组DNA提取出来，和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。 (2)检测目的基因是否转录：分子杂交技术。 将转基因生物提取出来的mRNA和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经转录。 (3)检测目的基因是否翻译：抗原－抗体杂交技术。 从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。 2．个体水平的鉴定 (1)抗虫或抗病的接种实验。 (2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。 归纳总结 1．目的基因的检测与鉴定归纳

2．不同分子检测原理的异同 (1)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被 检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。 (2)进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。 例3 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( ) ①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录出了mRNA ④检测目的基因是否翻译出了蛋白质 A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④ 答案 C 例4 利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是( ) A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白 答案 D 解析 基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，A、C项只能说明完成了目的基因的导入，B项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。 名师点拨 关注基因工程操作过程的四个易误点 (1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒一般只需要限制酶剪切1次，产生2个黏性末端或平末端，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。 (2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下，目的基因与载体也可以连接起来。 (3)目的基因的插入点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。 (4)基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象。