实验十二转氨作用(精)
高中化学实验大全总结
高中化学实验大全总结高中化学教材常考实验总结一、配制一定物质的量浓度的溶液以配制100mL1.00mol/L的NaOH溶液为例：1、步骤：（1）计算（2）称量：（保留一位小数）（3）溶解（4）转移：待烧杯中溶液冷却至室温后转移（5）洗涤（6）定容：将蒸馏水注入容量瓶，当液面离刻度线1—时，改用胶头滴管滴加蒸馏水至凹液面最低点与刻度线在同一水平线上（7）摇匀：盖好瓶塞，上下颠倒、摇匀（8）装瓶贴标签：标签上注明药品的名称、浓度。
2、所用仪器：（由步骤写仪器）托盘天平、药匙、烧杯、玻璃棒、（量筒）、100mL容量瓶、胶头滴管3、注意事项：(1)容量瓶：只有一个刻度线且标有使用温度和量程规格，只能配制瓶上规定容积的溶液。
（另外使用温度和量程规格还有滴定管、量筒）(2)常见的容量瓶：50mL、100mL、250mL、500mL、1000mL。
若配制480mL与240mL溶液，应分别用500mL容量瓶和250mL容量瓶。
写所用仪器时，容量瓶必须注明规格，托盘天平不能写成托盘天秤！(3)容量瓶使用之前必须查漏。
方法：向容量瓶xx少量水，塞好瓶塞，用食指顶住瓶塞，用另一只手的五指托住瓶底，把瓶倒立过来，如不漏水，正立，把瓶塞旋转1800后塞紧，再倒立若不漏水，方可使用。
（分液漏斗与滴定管使用前也要查漏）高中化学尝试大全总结(4)误差分析(5)命题角度：一计较所需的固体和液体的量，二是仪器的缺失与选择，三是尝试偏差阐发。
二、Fe(OH)3胶体的制备：1、步骤：向沸水中加入FeCl3的饱和溶液，继续煮沸至溶液呈红褐色，停止加热。
操作要点：四步曲：①先煮沸，②插手饱和的FeCl3溶液，③再煮沸至红褐色，④截止加热2、涉及的化学方程式：Fe3++3H2O =Fe(OH)3（胶体）+3H+强调之一是用等号，强调之二是标明胶体而不是沉淀，强调之三是加热。
3、命题角度：配制步骤及对应离子方程式的书写三、焰色反应：1、步骤：洗—烧—蘸—烧—洗—烧2、该尝试用铂丝或铁丝3、焰色回响反映可以是单质，也能够是化合物，是物理性子4、Na，K的焰色：黄色，紫色（透过蓝色的钴玻璃）5、某物质作焰色反应，有黄色火焰一定有Na，可能有K高中化学实验大全总结6、命题角度：实验操作步骤及Na，K的焰色4、Fe(OH)2的制备：1、实验现象：白色沉淀立即转化灰绿色，最后变成红褐色沉淀。
生化试题
第一章蛋白质的结构与功能一、名词解释题1．peptide unit 8．结构域2．motif 9．蛋白质等电点3．protein denature 10．辅基4．glutathione 11．α—螺旋5．β—pleated sheet 12．变构效应6．chaperon 13．蛋白质三级结构7．protein quaternary structure 14．肽键二、问答题1．为何蛋白质的含氮量能表示蛋白质相对量实验中又是如何依此原理计算蛋白质含量的2．蛋白质的基本组成单位是什么其结构特征是什么3．何为氨基酸的等电点如何计算精氨酸的等电点(精氨酸的α—羧基、α—氨基和胍基的pK值分别为，和4．何谓肽键和肽链及蛋白质的一级结构5．什么是蛋白质的二级结构它主要有哪几种各有何结构特征6．举列说明蛋白质的四级结构。
7．已知核糖核酸酶分子中有4个二硫键，用尿素和β—巯基乙醇使该酶变性后，其4个二硫键全部断裂。
在复性时，该酶4个二硫键由半胱氨酸随机配对产生，理论预期的正确配对率为1％，而实验结果观察到正确配对率为95％—100％，为什么8．什么是蛋白质变性变性与沉淀的关系如何9．举列说明蛋白质一级结构、空间构象与功能之间的关系。
10．举例说明蛋白质的变构效应。
11．常用的蛋白质分离纯化方法有哪几种各自的作用原理是什么12．测定蛋臼质空间构象的主要方法是什么其基本原理是什么第二章核酸的结构与功能一、名词解释题1．核小体 6．核酶2．碱基互补 7．核酸分子杂交3．脱氧核苷酸 8．增色效应4．核糖体 9．反密码环5．Tm值 10．Z-DNA二、问答题1．细胞内有哪几类主要的RNA其主要功能是什么2．用32P标记的病毒感染细胞后产生有标记的后代，而用35S标记的病毒感染细胞则不能产生有标记的后代，为什么3．一种DNA分子含40％的腺嘌呤核苷酸，另一种DNA分子含30％的胞嘧啶核苷酸，请问哪一种DNA的Tm值高为什么4．已知人类细胞基因组的大小约30亿bp，试计算一个二倍体细胞中DNA的总长度，这么长的DNA分子是如何装配到直径只有几微米的细胞核内的5．简述DNA双螺旋结构模式的要点及其与DNA生物学功能的关系。
高考化学实验全总结(操作+方法+现象)
高考化学实验全总结（操作+方法+现象）一.中学化学实验操作中的七原则掌握下列七个有关操作顺序的原则，就可以正确解答“实验程序判断题”。
1.“从下往上”原则。
以Cl2实验室制法为例，装配发生装置顺序是：放好铁架台→摆好酒精灯→根据酒精灯位置固定好铁圈→石棉网→固定好圆底烧瓶。
2.“从左到右”原则。
装配复杂装置遵循从左到右顺序。
如上装置装配顺序为：发生装置→集气瓶→烧杯。
3.先“塞”后“定”原则。
带导管的塞子在烧瓶固定前塞好，以免烧瓶固定后因不宜用力而塞不紧或因用力过猛而损坏仪器。
4.“固体先放”原则。
上例中，烧瓶内试剂MnO2应在烧瓶固定前装入，以免固体放入时损坏烧瓶。
总之固体试剂应在固定前加入相应容器中。
5.“液体后加”原则。
液体药品在烧瓶固定后加入。
如上例浓盐酸应在烧瓶固定后在分液漏斗中缓慢加入。
6.先验气密性(装入药口前进行)原则。
7.后点酒精灯(所有装置装完后再点酒精灯)原则。
二.中学化学实验中温度计的使用分哪三种情况以及哪些实验需要温度计1.测反应混合物的温度：这种类型的实验需要测出反应混合物的准确温度，因此，应将温度计插入混合物中间。
①测物质溶解度。
②实验室制乙烯。
2.测蒸气的温度：这种类型的实验，多用于测量物质的沸点，由于液体在沸腾时，液体和蒸气的温度相同，所以只要测蒸气的温度。
①实验室蒸馏石油。
②测定乙醇的沸点。
3.测水浴温度：这种类型的实验，往往只要使反应物的温度保持相对稳定，所以利用水浴加热，温度计则插入水浴中。
①温度对反应速率影响的反应。
②苯的硝化反应。
三.常见的需要塞入棉花的实验有哪些需要塞入少量棉花的实验加热KMnO4制氧气制乙炔和收集NH3其作用分别是：防止KMnO4粉末进入导管；防止实验中产生的泡沫涌入导管；防止氨气与空气对流，以缩短收集NH3的时间。
四.常见物质分离提纯的10种方法1.结晶和重结晶：利用物质在溶液中溶解度随温度变化较大，如NaCl，KNO3。
2.蒸馏冷却法：在沸点上差值大。
实验十二 产蛋白酶菌株的筛选
整理版
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2 酶活标准曲线的制作
用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液， 取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混 合，40 ℃水浴显色30min，680nm测 定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度 为1是相当的酪氨酸质量（ μg ），及K 值。
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不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形 成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条 件和液体环境中生长的情况相差很大， 因此在平板上产圈能力强的菌株不一定 就是碱性蛋白酶的高产菌株。
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碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国 颁布标准QB747-80进行。
原理：Folin试剂与酚类化合物 （Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应 形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白 生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色 反应，通过分光光度计测定可知酶活大 小。
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5 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋 白酶活力
用初筛获得的5株蛋白酶菌培养 48h。
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6 酶活力的测定
空白对照 发酵液（或其稀释液）1ml
0.4mol/L 三氯醋酸 3ml 2% 酪蛋白1 ml
样品 发酵液（或其稀释液）1ml
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四 操作步骤
1 培养基和试剂的配制
（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体 培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶
（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉 3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到 9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧 瓶的装瓶量为50ml。
U=K×A×N×5/10 K：由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪 氨酸质量，本实验K=200 N：稀释倍数 A：样品OD值与空白对照ＯＤ值之差 5/10：测定中吸取的滤液是全部滤液的 １/５，而酶反应时间为１０ｍｉｎ
第十一章 蛋白质代谢(一)
胺的代谢
大多数胺类对动物有毒，去向： 1）随尿排出； 2）在胺氧化酶作用下可进一步氧化分解：
合成尿素
氨
新氨基酸
糖 葡萄糖或糖原
甘油三酯
脂肪
氨
磷酸丙糖
基
α-磷酸甘油
脂肪酸
酸
磷酸烯醇丙酮酸
、 丙氨酸 糖 半胱氨酸
丙酮酸
及 丝氨酸
异亮氨酸 乙酰CoA
乙酰乙酰CoA
酮体
脂 苏氨酸
亮氨酸
肪 色氨酸 代 谢
色氨酸 草酰乙酸
亮氨酸 赖氨酸
柠檬酸
酪氨酸 色氨酸 苯丙氨酸
的 联
天冬氨酸 天冬酰胺
TAC
CO2
系
延胡索酸
α-酮戊二酸
三、氨基酸的一般代谢
生物合成 蛋白质
氨基酸 脱氨 氨、α-酮酸
分解代谢 脱羧 CO2、胺能源
三大代谢
氨基酸代谢概况
食物蛋白质
消化吸收
合成
组织蛋白质
分解
尿素
氨 a-酮酸
脱氨基
氨基酸代谢库
酮体 氧化供能 糖
代谢转变
脱羧基
体内合成氨基酸 (非必需aa)
其它含氮化合物( 嘌呤、嘧啶等)
胺类
（一）脱氨基作用
（一）胃内消化： 1、胃蛋白酶（pepsin): 胃蛋白酶元→胃酸( H+) → 胃蛋白酶
2、胃酶作用：
蛋白质 胃蛋白酶 小分子肽→肠道 胃酶作用于：Phe(苯丙), Tyr(酪), Trp(色).( 芳香族）
Glu(谷), Gln(谷氨酰胺).(酸性氨基酸)。
（二）小肠消化
1、来自胰腺的酶： 1）内肽酶：水解pro内部肽键。 胰蛋白酶：Lys(赖)、Arg(精)羧基端肽键；(碱性） 糜蛋白酶：Phe(苯丙)、Tyr(酪)、Trp(色)肽键(芳香族） 弹性蛋白酶：Val(缬)、Leu(亮)、Ser(丝)、Ala(丙)肽
十二 核苷酸的代谢
（11）、 脱水环化
★5-甲酰胺基咪唑-4-氨甲酰核苷酸 → 次黄嘌呤核苷酸+H2O 此反应是在次黄苷酸环水解酶的催化下进行的。
IMP的合成过程总结
★上述反应中（1）是磷酸基转移反应,（2）,（5） 是氨基化反应,（3）,（4）,（8）,（10）是合成酰 胺键的反应,（6）和（11）是脱水反应,（7）是酰 基化反应,（9）为裂解反应。
次黄苷
尿囊素
尿囊酸
二 嘧啶的分解
★P234 图11-3 嘧啶的分解代谢
胞嘧啶脱氨基即转化为尿嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧 啶经还原打破环内双键后，水解开环化合物，继 续水解成CO2、NH3、丙氨基异丁酸，后者脱氨基后 进入有机酸代谢或直接排出体外。
★人和某些动物体内脱氨基过程有的发生 在核苷或核苷酸上。脱下的NH3可进一步转 化成尿素排出。
氨甲酰天冬氨酸
(3) 二氢乳清酸的生成
-O
O
C
+
O
H2O
C HN CH2 H C COON H
NH3 CH2 H 二氢乳清酸酶 C C O N COOH
O
C
二氢乳清酸
(4) 乳清酸合成
O
C
O
C
HN
O
C
CH2 二氢乳清酸脱氢酶 HN H C C H2 O O2 O COON H
CH
C COO-
N H
乳清酸
2.胞嘧啶、尿嘧啶核苷酸的合成
▲UTP和CTP的合成与IMP的合成过程相同，起始 物同样是PRPP。 CO2 PPi ▲反应过程为：
PRPP+乳清酸 ① 乳清苷酸
②
UMP
③
ATP
ADP
注: ①乳清苷酸焦磷酸化酶
中药化学实验指导—实验十二 中药化学成分预试验
实验十二中药化学成分预试验（一）目的要求1．掌握常见中药化学成分的鉴别原理及实验技术。
2．能根据实验结果，判断检品中所含化学成分的类型。
3．认真做好预试验记录，正确书写实验报告。
（二）试验材料本实验中的供试液（品），可根据各类成分鉴别实验的具体需要，选择有代表性的各类成分或含相应成分的药材提取物，根据实验的具体要求进行准备。
需要鉴别的主要药物成分的类型有：生物碱、糖、苷、氨基酸、蛋白质、鞣质、黄酮、蒽醌、香豆素、强心苷、皂苷、挥发油、油脂、有机酸等。
（三）实验原理中药中所含的化学成分很多，在提取分离某种有效成分之前，一般可先通过简单的预试验，初步了解药材中可能含有哪些类型的化学成分，以便选用适当的方法对其中有效成分进行提取、分离。
预试验通常分为二类：系统预试验和单项预试验。
其基本原理是利用中药中各类化学成分在不同溶剂中溶解度不同，分成数个部分，如水溶性、醇溶性及石油醚溶性等部分，再分别进行各种定性反应。
各成分的检识反应可在试管或滤纸片上进行，也可用色谱法，然后根据各化学反应的现象进行分析判断，以了解试样中可能含有哪些类型的化学成分。
（四）实验内容1．水溶性成分的检识取中药粗粉5g，加50ml蒸馏水，浸泡过夜，或于50～60℃水浴中温浸1小时，滤过，滤液供检识下列各类成分：（1）糖、多糖和苷类1）Molish反应：取1ml供试液于试管中，加入1～2滴10％α-萘酚乙醇试剂摇匀，倾斜试管45°，沿管壁滴加1ml浓硫酸，分成两层。
如在两液层交界面出现紫红色环，表明可能含有糖、多糖或苷类。
2）斐林反应：取1ml供试液于试管中，加入新配制的4～5滴斐林试剂，在沸水浴中加热数分钟，如产生砖红色氧化亚铜沉淀，表明可能含有还原糖。
将上述溶液中沉淀滤过除去，滤液加1ml 10％盐酸溶液，置沸水浴中加热水解数分钟，放冷后，滴加10％氢氧化钠溶液调pH至中性，重复上述斐林反应，如仍产生砖红色氧化亚铜沉淀，表明可能含有多糖或苷类。
生化习题
第八章糖代谢1糖分解代谢有哪些途径？各个途径有哪些突出特点和生理意义？各个途径之间通过哪些重要的中间物质相互联系？2糖的有氧氧化分为哪几个阶段？说明具体酶促反应步骤及ATP生成和利用的数量3糖酵解和生醇发酵有哪些区别？4什么是糖异生？糖异生是否为糖酵解的逆过程？说明理由5丙酮酸脱氢酶系与α-酮戊二酸脱氢酶系含有哪些辅因子？写出丙酮酸脱氢酶系所催化的反应6激烈运动后产生酸痛，几天后酸痛感消失，说明生化机理7乙醛酸循环与三羧酸循环相比，有哪两个关键的酶？这一途径有何生理意义？8在代谢旺盛的红细胞内葡萄糖的C1被14C标记，问能否在红细胞内找到被标记的CO2？9标记Glucose的第二位碳原子，跟踪EMP、TCA途径，C2的去向。
10标记Glucose的第一位碳原子，生成的乙醇分子哪位被标记？11一分子的葡萄糖在脑和神经组织内彻底氧化产生多少ATP？在心脏、肝脏、肾等组织产生多少ATP？说明理由12丙酮酸羧化支路及其反应方程式13写出6-磷酸葡萄糖脱氢酶所催化的反应方程式；写出FAD作辅酶的反应（产生FADH2）14下列物质彻底氧化产生多少ATP？3-P-甘油酸乳酸磷酸烯醇式丙酮酸磷酸二羟丙酮 1，6-二磷酸果糖 3-P-甘油醛15说明UDPG、ADPG的作用16己糖激酶与葡萄糖激酶有什么区别？有何生理学意义？17 概述糖酵解、三羧酸循环、糖异生作用中的调控酶18什么是转酮醇酶、转乙醇酶？二者有什么区别？19 假设由葡萄糖转变为丙酮酸的过程中，缺失磷酸果糖激酶，试问：此过程是否能实现？为什么？20血糖有哪些来源和去路？为什么说肝脏是维持血糖浓度的重要器官？第九章脂类代谢习题一写出下列酶催化的反应方程式乙酰CoA羧化酶甘油激酶硫激酶二解释下列名词（1）CDP-乙醇胺（2）CDP-胆碱（3）α-氧化（4）β-氧化（5）ω-氧化（5）肉毒碱（6）生物素（7）ACP-HS （8）柠檬酸穿梭（9）必需脂肪酸三回答下列问题1、为什么对糖的摄取不充分的爱斯基摩人来说，在营养上吃奇数碳脂肪酸要比吃偶数碳脂肪酸更好些？2、胞液中脂肪酸的合成需要乙酰CoA和NADPH+H+，而乙酰CoA的产生是在线粒体中，细胞通过什么样的方式解决乙酰CoA 和NADPH+H+的来源问题？3、脂肪酸可由乙酰CoA和丙二酰CoA装配成，在脂肪酸合成酶系催化的反应中，如果用14C标记乙酰CoA的两个碳原子，并加入过量的丙二酰CoA，如果所合成的软脂酸只有两个碳位被标记，问被标记的部位是C1和C2，还是C15和C16？为什么？4、利用脂肪酸合成酶系的纯酶制剂及必需的辅助因子存在情况下，进行下列实验：（1）假设3H标记乙酰CoA的甲基碳上的氢，丙二酰CoA不标记。
生物化学名词解释(下)
第五章 糖 代 谢1．糖异生：非糖物质（如丙酮酸乳酸甘油生糖氨基酸等）转变为葡萄糖的过程。
2．Q 酶：Q 酶是参与支链淀粉合成的酶。
功能是在直链淀粉分子上催化合成（α-1，6）糖苷键，形成支链淀粉。
3．乳酸循环乳：酸循环是指肌肉缺氧时产生大量乳酸，大部分经血液运到肝脏，通过糖异生作用肝糖原或葡萄糖补充血糖，血糖可再被肌肉利用，这样形成的循环称乳酸循环。
4．发酵：厌氧有机体把糖酵解生成NADH 中的氢交给丙酮酸脱羧后的产物乙醛，使之生成乙醇的过程称之为酒精发酵。
如果将氢交给病酮酸丙生成乳酸则叫乳酸发酵。
5．变构调节：变构调节是指某些调节物能与酶的调节部位结合使酶分子的构象发生改变，从而改变酶的活性，称酶的变构调节。
6．糖酵解途径：糖酵解途径指糖原或葡萄糖分子分解至生成丙酮酸的阶段，是体内糖代谢最主要途径。
7．糖的有氧氧化：糖的有氧氧化指葡萄糖或糖原在有氧条件下氧化成水和二氧化碳的过程。
是糖氧化的主要方式。
8．肝糖原分解：肝糖原分解指肝糖原分解为葡萄糖的过程。
9．磷酸戊糖途径：磷酸戊糖途径指机体某些组织（如肝、脂肪组织等）以6-磷酸葡萄糖为起始物在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸进而代谢生成磷酸戊糖为中间代谢物的过程，又称为磷酸已糖旁路。
10．D-酶：一种糖苷转移酶，作用于α-1，4 糖苷键，将一个麦芽多糖的片段转移到葡萄糖、麦芽糖或其它多糖上。
11．糖核苷酸：单糖与核苷酸通过磷酸酯键结合的化合物，是双糖和多糖合成中单糖的活化形式与供体。
第六章 脂类代谢1．必需脂肪酸：为人体生长所必需但有不能自身合成，必须从事物中摄取的脂肪酸。
在脂肪中有三种脂肪酸是人体所必需的，即亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸。
2.α-氧化：α-氧化作用是以具有3-18碳原子的游离脂肪酸作为底物，有分子氧间接参与，经脂肪酸过氧化物酶催化作用，由α碳原子开始氧化，氧化产物是D-α-羟脂肪酸或少一个碳原子的脂肪酸。
3. 脂肪酸的β-氧化：脂肪酸的β-氧化作用是脂肪酸在一系列酶的作用下，在α碳原子和β碳原子之间断裂，β碳原子氧化成羧基生成含2个碳原子的乙酰CoA 和比原来少2 个碳原子的脂肪酸。
实用营养学【第二节蛋白质】
实用营养学【第二节蛋白质】蛋白质(protein)是一切生命物质基础，没有蛋白质就没有生命，可见蛋白质对人体是非常重要。
正常成人体内16％～19％是蛋白质。
人体内蛋白质始终处于不断地分解，又不断地合成的动态平衡中，借以可达到组织蛋白不断更新和修复。
肠和骨髓内蛋白质更新速度较快。
但总体来说，人体内每天约更新3％的蛋白质。
一、蛋白质功能1．构成人体组织成分人体任何组织和器官，都以蛋白质作为重要组成成分，所以人体在生长过程中，就包含着蛋白质不断地增加。
人体组织(1ean tissue)中，如肌肉、心、肝、肾等器官含大量蛋白质；骨骼和牙齿含大量胶原蛋白，指(趾)甲含角蛋白；细胞中从细胞膜到细胞内各种结构均含蛋白质。
可见蛋白质是人体不能缺少的构成成分。
2．构成体内各种重要物质如含蛋白质的酶，催化体内一切物质分解和合成；激素使内环境稳定，并调节许多生理过程；抗体可以抵御外来微生物及其他有害物质入侵；细胞膜和血液中蛋白质担负着各类物质运输相交换；体液内可溶性且可离解为阴、阳离子的蛋白质，使体液渗透压和酸碱度得以稳定；此外血液凝固、视觉形成、人体运动等等，无一不与蛋白质有关。
故蛋白质是生命的物质基础，是生命存在的形式。
3．供给能量因蛋白质含碳、氢、氧元素，当机体需要时，可以被代谢分解，释放出能量。
19食物蛋白质在体内约产生16．7kJ(4．0kca1)能量。
二、氨基酸和必需氨基酸1．氨基酸和肽蛋白质是由许多氨基酸(amino acid)以肽键连接，并形成一定空间结构的大分子。
由于氨基酸种类、数量、排列次序和空间结构千差万别，就构成无数种功能各异的蛋白质，也才有丰富多彩奥妙无穷的生物世界。
构成人体蛋白质氨基酸有20种(不包括胱氨酸，cystine)，见表2-4。
蛋白质分解时次级结构称肽(peptide)，含10 个以上氨基酸的肽称多肽(po1ypeptide)，含4-6个氨基酸称寡肽(o1igopeptide)，含3个或2个氨基酸分别称3肽 (tripeptide)和2肽(dipeptide)。
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实验十二 转氨作用 【实验目的】 1．通过实验掌握水平方向滤纸层析原理和技术 2．了解转氨作用过程。 【实验原理】 转氨基作用是由转氨酶（氨基转移酶）催化的，在这个反应中，α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间交换，α-氨基酸转变成相应的α-酮酸，α-酮酸变成新的一种α-氨基酸。转氨基作用是一种可逆反应。每个转氨基反应均由专一的转氨酶所催化，在不同的生物有机体中均有转氨酶分布。 本实验是将丙氨酸和α-酮戊二酸与肝匀浆一起水浴反应，肝中的丙氨酸氨基转移酶（ALT，又称谷丙转氨酶GPT）含量丰富，该酶可将丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸，产生丙酮酸和谷氨酸。利用圆盘纸层析鉴定谷氨酸的存在，并且验证组织中的转氨作用。在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化的转氨基作用，反应方程式如下：
CHCOOHCH2NH2CH2COOH++COCOOHCH3谷丙转氨酶CHCH3COOHNH2CCOOHCH2OCH2
COOH
谷氨酸丙氨酸丙酮酸α‐酮戊二酸
【实验材料】 1． 实验器材 培养皿；表面皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格尺。 2． 实验试剂 ⑴ 0.01M pH7.4磷酸缓冲液：0.2MNa2HPO4溶液81ml, 0.2MNaH2P04溶液19ml混匀，蒸馏水稀释20倍。 ⑵ 0.1M丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液中，以1MNa0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml。 ⑶ 0.01Mａ-酮戊二酸溶液：称取ａ-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸缓冲液中，用1M Na0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml。 ⑷ 0.1M谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735克先溶于少量0．01M pH7.4磷酸缓冲液中， 以1MNa0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。 ⑸ 0.2％茚三酮溶液：称取茚三酮0.2克溶于100ml 95％乙醇中。 (6)层析溶剂：水饱和的苯酚。 【实验操作】 1． 肝匀浆的制备： 取新鲜的猪肝5g,加入20m1预冷0.01M pH7.4磷酸缓冲液，用捣碎机迅速成匀浆(1万转大约30秒)。两人一组进行如下的实验。 2． 转氨反应： 取干燥大试管二支，分别标明测定管与对照管，按下表进行操作： 试剂(ml) 测定管 对照管 肝匀浆 0.5 0.5 放入沸水中煮5分钟， 冷却，摇匀 0.1M 丙氨酸溶液 0.5 0.5 0.01M α-酮戊二酸溶液 0.5 0.5 0.01 M pH7.4 磷酸缓冲液 1.5 1.5 摇匀，放进37℃水浴保温50分钟 沸水浴中煮5分钟，终止反应，取出冷却后摇匀 取出冷却后，分别用滤纸过滤或2000rpm离心3～5分钟，滤液或上清液分别收集到新的干燥小试管中。 3. 纸层析： ⑴ 取直径12cm圆形滤纸一张，通过圆心作两条2cm相互垂直的线，两个线的末端作点样点，分别标定“测定”、“对照”、“谷氨酸”、“丙氨酸”。 ⑵ 取4支毛细管，分别吸取测定管溶液、0.1M谷氨酸溶液、对照管溶液、0.1M丙氨酸溶液。在点样处点样，注意斑点不可太大，直径要小于0.3cm。而且每点一滴，吹干后方可再点第二滴，每个样品可点2～3次。 ⑶ 在滤纸圆心处打一小孔(1mm直径)，另取同类滤纸条(0.5×2.5cm)，下一半剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，从点样相反的一侧插入小孔。 ⑷ 将层析溶剂(水饱和酚溶液)放入直径为3～5cm的干燥表面皿正中，表面皿置于直径10cm培养皿正中，将滤纸放平在培养皿上，灯芯浸入溶剂中，将另一同样大小培养皿反盖上，溶剂沿灯芯上升到滤纸，再向四周扩展，（层析时间大约45～60分钟）。溶剂前缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，用铅笔划出溶剂的边缘，烘箱中干燥之。 ⑸ 显色：将滤纸放在培养皿上，喷0.2%的茚三酮乙醇溶液，烘箱中干燥，滤纸上会呈现紫色弧状条带。 【实验结果】 用铅笔画出条带的边框，测出表格中的数值，计算Rf 值。
测定参数 测定样品 谷氨酸 丙氨酸 对照
点样点到斑纹中心距离 (cm) 点样点到溶剂前沿距离 (cm) Rf 值 与已知的标准的氨基酸Rf进行对比，指出条带所对应的氨基酸，并根据结果解释转氨作用。 【注意事项】 1．层析滤纸不可用手触摸，以免有手印。 2．在滤纸上划线时只需用铅笔，不可用其它笔。 3．烘烤时要注意明火。 4．点样时毛细管不能交叉污染。 【思考题】 1．如果对照管在沸水中煮的时间不够充分，会在层析结果中出现什么现象？ 2．氨基酸纸上色谱鉴定法操作的关键是什么？ Experiment 12 Transamination 【Purpose】 1．Master the principles and the basic technological operation of round paper chromatography. 2．Learn the process of transamination. 【Principle】 Transamination reactions are catalyzed by transaminases (aminotransferases). In this process the α-amino group is transferred from an α-amino acid to an α-Keto acid，and the α-amino acid forms an α-Keto acid. In the meantime, the α-Keto acid converts to a new amino acid. Transamination reactions are reversible. Every transamination reaction is catalyzed by a specific transaminase. Transaminases are widespread in each organ of an organism. In this experiment, liver homogenate is under water bath with L-alanine and pyruvate, while alanine aminotransferase (ALT; also called glutamate-pyruvate transaminase,) that are important in the diagnosis of liver damage catalyzes the transfer of the amino group of alanine to α-ketoglutarate, thus yield pyruvate and glutamate. Using round paper chromatography can evaluate the existence of glutamate and can prove the transamination reaction in the tissue.
CHCOOHCH2NH2
CH2
COOH
++COCOOHCH3谷丙转氨酶CHCH3COOHNH2CCOOH
CH2
O
CH2
COOH
L-GlutamateL-AlaninePyruvateα-ketoglutarate
【Materials】 1. Apparatus Petri dish; Watch-glass; A piece of chromatography filter paper; Homogenizer; Test tubes; Test tube rack; Constant temperature water boiler; Several glass capillaries; Pipette ; Sprayer; Scissors; Pencil; Ruler. 2．Reagents ⑴ 0.01M phosphoric acid buffer of pH 7.4: Prepare 0.2M Na2HPO4 and 0.2M NaH2PO4, then mix 81 ml of the former and 19 ml of the latter and dilute 20 times with distilled water. ⑵ 0.1M alanine solution: Weigh 0.891g alanine and add trifle 0.01M phosphoric acid buffer of pH 7.4. Adjust pH to 7.4 with 1M NaOH and set the volume at 100ml with 0.01M phosphoric acid buffer. ⑶ 0.01M α-ketoglutarate solution: Weigh 1.461g α-ketoglutarate, and add a dollop of 0.01M phosphoric acid buffer of pH 7.4. Adjust pH to 7.4 with 1M NaOH and set the volume at 100ml with 0.01M phosphoric acid buffer. ⑷ 0.1M glutamate solution: Weigh 0.735g alanine, and dissolve it with a dollop of 0.01M phosphoric acid buffer of pH 7.4. Adjust pH to 7.4 with 1M NaOH and set the volume at 100ml with 0.01M phosphoric acid buffer. ⑸ 0.2% ninhydrin ethanol solvent : Dissolve 0.2g ninhydrin into 100ml of 95% ethanol. ⑹ Chromatography solvent: Phenol saturated by water.
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