分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
克隆技术的原理与实验操作
克隆技术的原理与实验操作克隆技术在现代生物科学领域发挥着重要作用，它可以复制出与原始生物基本相同的遗传特征。
本文将介绍克隆技术的原理和实验操作，以帮助读者更好地了解该技术的实际运用。
一、克隆技术的原理克隆技术主要基于细胞分裂和遗传物质的复制机制，通过以下步骤实现：1. 选择合适的供体细胞：克隆技术通常需要选择一个“供体细胞”，该细胞包含所需复制的遗传信息。
供体细胞可以来自人类、动物或植物。
2. 提取供体细胞核：通过细胞核提取方法，将供体细胞中的细胞核分离出来。
细胞核包含着细胞的遗传信息，其中包括DNA序列。
3. 建立核移植胚胎：取另一个无细胞核的受体细胞（通常是卵细胞），将提取的供体细胞核移植到受体细胞中。
4. 促使胚胎发育：通过合适的培养条件，促使移植的细胞核与受体细胞融合并发育成胚胎。
5. 植入或培养胚胎：将发育出来的克隆胚胎植入或继续培养在适当的环境中。
6. 新生物体产生：如果所有步骤都成功，克隆胚胎将发育成为一个与供体细胞基本相同的新生物体。
二、实验操作步骤1. 准备供体细胞：选择合适的供体细胞，如从一个特定的器官或组织中提取细胞样本。
2. 细胞培养：将供体细胞置于培养皿中，在适当的培养基中培养，以促使细胞分裂增殖。
3. 细胞核提取：使用细胞核提取试剂盒或其他方法，将细胞核从供体细胞中进行提取。
4. 受体细胞准备：选择一个无细胞核的受体细胞，并将其准备好以接受移植的细胞核。
5. 核移植：利用显微操作技术，将提取的供体细胞核移植到受体细胞中，确保细胞融合。
6. 培养与发育：将移植后的细胞培养在适当的培养基中，提供充足的营养和环境，以促使胚胎的发育。
7. 植入或继续培养：根据具体的实验目的，将发育良好的胚胎植入到合适的宿主生物体中，或继续培养在培养皿内。
8. 监测与分离：通过对克隆胚胎的观察和监测，检验其发育情况并确保正常的克隆过程。
最后，对成活的克隆个体进行分离和研究。
以上为克隆技术的原理和实验操作的基本介绍，这一技术的应用领域广泛，涵盖了医药科学、农业生产和环境保护等各个方面。
克隆技术的原理及过程
克隆技术的原理及过程
克隆技术是指利用生物学手段产生一种与原始个体基因完全一
致的后代。
克隆技术的原理是利用细胞分裂的能力和基因复制的原理，将一个成熟细胞的基因组复制到一个无性生殖的胚胎中，从而产生一个与原个体基因完全一致的后代。
克隆技术的过程可以分为以下几个步骤：
1.采集供体细胞：从一个生物体中采集一个成熟细胞，通常使用皮肤细胞或血细胞作为供体细胞。
2.细胞核移植：将供体细胞的细胞核移植到一个去核的卵细胞中。
这可以通过使用一个微针将细胞核插入卵细胞内来完成。
3.激活卵细胞：使用化学物质或电脉冲激活卵细胞，使其开始分裂。
4.移植胚胎：将发育良好的克隆胚胎移植到一个代孕母体中。
5.孕育后代：如果胚胎发育成功并且嵌入代孕母体，它将组成一个克隆胎儿并最终出生为克隆后代。
克隆技术具有广泛的应用前景，包括用于动物繁殖、药物开发、疾病治疗和农业生产等领域。
但是，由于克隆技术的伦理和道德问题，以及技术上的一些挑战，它仍然是一个备受争议和受限制的领域。
- 1 -。
克隆技术的原理和流程
克隆技术的原理和流程什么是克隆技术？克隆技术是指利用生物学和生物技术手段，对一个生物体进行复制，产生与原生物同源或者相似的个体。
通过克隆技术可以复制同样的物种，也可以产生基因相同的动植物个体。
克隆技术的原理克隆技术的原理就是从生物体细胞中提取出核，然后将该核移到另一个细胞内，使另一个细胞内的核被取代。
例如，将皮肤细胞中的细胞核移植到一个不成熟的卵细胞中，经过一定条件的激活和发育，最终可以得到和母体相同基因的个体。
在克隆技术的原理中，重要的一步就是将细胞核从一个细胞中取出，这个过程称为“核移植”。
核移植的操作需要非常非常的细致，因为任何一个细节的问题都可能导致失败。
同时，还需要配合一系列的化学物质和环境条件，使细胞得以完成生长和分裂。
克隆技术的流程克隆技术的流程非常复杂，虽然相同的基本步骤，但是对于不同的物种或者细胞类型，需要进行针对性调整，以适应克隆的需要。
下面我们详细介绍一下克隆技术的流程。
1. 细胞采集首先需要采集一个细胞，一般采用皮肤疱疹细胞或肌肉细胞等。
这个细胞称为“供者细胞”，也就是将来作为核移植的细胞。
2. 核移植将供者细胞中的细胞核移植到一个受体细胞内，并且将细胞融合在一起，使得其能够生长和分裂。
这个受体细胞通常是一个不成熟的卵细胞或胚胎细胞。
在一些特殊情况下，也可以将细胞核移植到一个去核卵细胞中。
3.重建胚胎将核移植后的细胞进行培养和激活，让它们能够重新组合成一个胚胎。
这个过程与自然界中的胚胎形成过程类似，主要是通过一系列的化学反应、分裂和生长过程完成。
4. 种植胚胎将重建好的胚胎种植到一只母体中，让母体完成后续的孕育过程。
在这个过程中，关键是要将胚胎与母体进行某些特殊的处理，以确保它们能够紧密适配并完成发育过程。
5. 分离与培养最后，在出生的个体完成了发育过程后，需要将其与正常的个体分离，并进行单独培养，以确定其是否具有和原来的供者细胞相同的基因。
如果是的话，那么就代表克隆成功。
同源重组法分子克隆 -回复
同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。
同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。
本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。
一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。
同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。
同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。
同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。
两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。
接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。
1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。
一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。
2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。
需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。
3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。
4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。
5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。
6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。
7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。
同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆又称“定向酶促融合”，是一种新型的微生物发酵技术。
它以生物学特性为基础，使用带有正电荷的生物导向剂进行定向扩增，再把含有该正电荷生物导向剂的细胞裂解液体与细胞固体分离开来，并将细胞固体保留在无菌管内，只是把细胞裂解液体与细胞导向剂混合在一起；然后利用酶切或其他方法将含有某一特殊酶切位点的导向剂片段或其他标记单位置于目的基因的两端，使这些单位被带有特定正电荷的生物导向剂定向吸引到相应的基因上，使得基因表达合成目的蛋白质，由此而制备目的基因的表达产物。
分子克隆的基本原理是利用核酸碱基对，通过磷酸二酯键、糖苷键、疏水键和氢键的形成，或同核苷酸链接等连接方式，将两个核酸分子结合在一起，形成长度足够的片段，以实现目的基因在特定位点上的高效表达。
简言之，就是利用核酸连接酶，把两个DNA分子的长链分解成为几个小片段，通过酶的催化作用，使这些小片段连接成较大的分子，从而获得不同长度的核酸分子，使这些小片段能够携带某些特定的遗传信息，转入所需的细胞中去，并在适当的条件下，使它们表达出相应的功能性产物。
分子克隆技术可用于发酵工业的重组菌株的构建，这一技术的应用，能将工业上不易获得的，甚至不可能获得的工业菌种或经济价值很高的生物大分子，迅速地大量生产出来，以满足人类社会的需要。
不论是从数量上还是质量上，都具有显著的优势。
分子克隆技术已广泛应用于酶、抗体、激素、核酸、氨基酸、抗菌肽等生物大分子的生产，如用基因克隆技术培育的小鼠生长素基因，每只小鼠用量只需0．01微克。
一个小鼠一年就可生产近30万单位的生长素。
利用基因克隆技术生产的胰岛素，每人一天仅需2单位，而且纯度高、活性强。
此外，有关基因克隆还被用于生产除草剂、抗病毒和抗肿瘤的药物，甚至还可以利用基因克隆技术改变动植物的遗传性状。
人们常说，科学的春天是创造的春天，创造性思维才是科学研究的真正源泉。
随着生命科学的发展，将给人类健康带来新的希望。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理基本原理克隆开始前至少需要两个重要的DNA分子。
首先，您需要要克隆的DNA片段，也称为插入片段。
它可以来自原核，真核，灭绝的生物，也可以在实验室中人工创造。
通过使用分子克隆，我们可以更多地了解特定基因的功能。
其次，你需要一个矢量。
载体是用作分子生物学工具的质粒DNA，用于制备更多拷贝或从某种基因产生蛋白质。
质粒是载体的一个例子，是由细菌复制的圆形，染色体外的DNA。
质粒通常具有多克隆位点或MCS，该区域含有不同限制性内切核酸酶的识别位点，也称为限制酶。
可以通过称为连接的技术将不同的插入物掺入质粒中。
载体质粒还含有复制起点，使其可以在细菌中复制。
另外，质粒具有抗生素基因。
如果细菌整合了质粒，它将在含有抗生素的培养基中存活。
这允许选择已经成功转化的细菌。
将插入物和载体克隆到宿主细胞的生物体中，最常用于分子克隆的是大肠杆菌。
大肠杆菌生长迅速，可广泛获得并且具有许多可商购的不同克隆载体。
真核生物，如酵母，也可用作载体生物。
一般分子克隆方法的第一步是获得所需的插入物，其可以来自任何细胞类型的DNA或mRNA。
然后根据插入物的类型选择最佳载体及其宿主生物，最终将用它完成。
聚合酶链式反应或基于PCR的方法通常用于复制插入物。
然后，使用一系列酶促反应，将消化插入物连接在一起并引入宿主生物体中以进行大量复制。
从细菌中纯化重复的载体，并在限制性消化后，在凝胶上分析。
然后将在凝胶上纯化的片段送去测序以验证该奖章是所需的DNA片段。
操作过程(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA 片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。
(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。
在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。
分子克隆技术
分子克隆技术分子克隆技术是指利用体外的人工方法将一个DNA分子（称为目的DNA）复制到一组DNA分子（称为载体DNA）中的过程。
这项技术能够在体外精确复制和扩增DNA分子，从而可以用于研究基因功能、制备重组蛋白、基因治疗等领域。
下面是分子克隆技术的详细步骤：1.选择载体DNA：首先需要选择一个合适的载体DNA，一般会使用细菌的质粒作为载体，因为细菌质粒具有稳定、易扩增和实验操作简单的特点。
2.制备DNA片段：将目的DNA通过PCR扩增或者其他方法制备出来。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶在体外将目的DNA的特定序列进行大规模复制的过程，一般需要利用引物引导PCR反应。
3.处理载体DNA：将载体DNA进行处理，一般需要进行酶切。
通过选择性酶切酶将载体DNA的一部分切除，形成切口，为接下来的目的DNA连接提供空位。
4.连接DNA：将目的DNA与处理后的载体DNA连接起来。
一般利用DNA连接酶进行连接，将目的DNA的末端与载体DNA的末端互补连接。
连接反应通常需要一定时间和温度来保证连接的效率和稳定性。
5.转化细胞：将连接好的DNA转化到细菌等宿主细胞中。
这一步可以通过热激转化、电转化等方法实现。
转化后，将细胞培养在含有相应抗生素的培养基上，只有携带目的DNA的细菌才能存活，从而筛选出含有目的DNA的克隆。
6.筛选克隆：通过筛选抗生素抗性或其他标记物的方法来筛选出含有目的DNA的细菌克隆。
一般需要进行筛选接种、PCR鉴定、酶切及测序等手段来确认克隆是否含有目的DNA，并进一步分析目的DNA的表达和功能。
这些步骤是分子克隆技术的基本流程，但在实际操作中可能会根据具体情况进行相应的调整和优化。
分子克隆技术的发展和应用使得我们可以对基因进行精确操作和研究，对于推动生命科学的发展和应用具有重要的意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子克隆主要技术：
（1）限制性内切酶酶切与连接
基因克隆也叫DNA分子克隆，即在体外重组DNA分子，而实现该技术的
关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。每一种限制性核酸内切酶可以
识别DNA分子上特定的碱基序列，切断DNA分子。依据碱基互补的原理，在
DNA连接酶的作用下可以把切开的DNA片段连接起来，因此可以把目的片段
连接到合适的载体上形成重组子。
（2）转化与转染
作为表达载体，必须具有复制起始序列、多克隆位点及选择标记，可以在
宿主细胞中进行自我复制或整合到宿主基因组中进行复制。作为宿主的工程菌
或细胞在某些化学条件或物理刺激下会改变其细胞膜的通透性，从而易于将细
胞表面附着的外源基因吸收到胞内，这一过程即转化（工程菌）或转染（细胞）。
利用选择标记可以很容易鉴别成功导入目的基因的工程菌或细胞，比如抗
生素抗性筛选—凡是成功导入重组载体的工程菌或细胞均获得某种抗生素抗
性，而未导入的工程菌或细胞则不能在含该抗生素的培养基中生长。
（3）聚合酶链式反应
聚合酶链式反应，即PCR。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过
程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--
延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左
右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成
为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复
性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃（具体退火温度根据引物
的Tm值确定）左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延
伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，
靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA
链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半
保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～
4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
整个分子克隆从设计引物开始，根据需要拿到的目的蛋白相应地
核酸序列，设计出含有酶切位点及所需Tag的特异性引物，至于设计
引物的原则，可以从网上、书上查到，这里不再赘述。以下框架图给
出了分子克隆的基本流程：
PCR扩增目的基因 提取载体质粒
限制性内切酶双酶切 限制性内切酶双酶切
DNA连接酶连接目的片段和载体
制备感受态细胞 转化感受态细胞
转化的细胞铺抗性平板
从平板上挑取单菌株，37℃培养
菌液PCR或抽提质粒酶切、PCR鉴定单阳性克隆
阳性克隆菌株保留甘油菌，并送出该菌或其质粒测序