流式细胞术多色荧光分析指南
细菌学检验-13-流式细胞技术
液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
荧光流式细胞术原理
荧光流式细胞术原理
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种先进的细胞分析技术，其工作原理可以概括为以下几个步骤：
首先，待测细胞需要经过染色处理，使其表面或内部特定的化学成分可以被荧光标记。
这些标记的细胞随后被制成单细胞悬液。
接下来，这些细胞悬液被送入流式细胞仪的流动室。
流动室中有一个液流驱动系统，它将细胞悬液以一定速度推动，使细胞单行排列，依次通过检测区域。
在检测区域，细胞会经过一束激光的照射。
激光激发荧光素，使得标记的细胞发出荧光。
这些荧光信号和细胞散射光会被不同的探测器接收。
其中，前向光电二极管检测细胞散射光，这种信号通常用来反映细胞的大小；而90度方向的光电倍增管（PMT）则接收荧光信号，这些信号代表了细胞表面抗原的强度或核内物质的浓度。
接收到的电信号经过光电转换器转换为电信号，再通过模数转换器转换为数字信号，由计算机进行采集和处理。
计算机对采集到的信号进行分析，将分析结果显示在屏幕上，也可以打印出来或以数据文件的形式存储，便于后续查询和分析。
此外，流式细胞仪还具有细胞分选功能。
通过在流动室喷口处安装超高频的压电晶体，可以产生液滴，使得待测细胞分散在这些液滴中。
液滴带有正负不同的电荷，当它们流经带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，最终落入各自的收集容器中，从而实现细胞的分离。
总的来说，流式细胞术通过高速、多参数的细胞分析，能够对细胞进行定量分析和分选，广泛应用于免疫学、血液学、细胞生物学等多个领域。
光谱流式细胞术
光谱流式细胞术
光谱流式细胞术（Spectral Flow Cytometry）是一种基于光学原理的高通量细胞分析技术。
通过该技术，可以对细胞进行快速、准确、高效的定量分析和分选。
光谱流式细胞术具有高灵敏度、高分辨率和高信噪比等特点，可广泛应用于生物学、医学、生物工程等领域。
光谱流式细胞仪主要由光源、分光器、检测器和数据处理系统等组成。
在分析过程中，细胞悬液通过流动室，受到光源发出的光照射。
光的波长可以根据需要选择，例如紫外光、蓝光、绿光、红光等。
细胞在光的作用下产生荧光信号，然后通过分光器将荧光信号分离，最后由检测器进行检测和分析。
根据不同的荧光染料和光波长，光谱流式细胞术可以对细胞进行多参数、多维度分析。
如，可以同时检测细胞的形态、大小、表面标记、内部结构等特征。
此外，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，还可以实现对细胞的分类和筛选。
光谱流式细胞术在生物学和医学研究中具有广泛的应用，例如细胞周期分析、细胞凋亡检测、细胞表面标记分析、细胞内信号传导研究等。
同时，该技术在药物筛选、疫苗研究、肿瘤诊断和治疗等领域也具有重要的应用价值。
1。
流式细胞术基本原理_
流式细胞术基本原理_流式细胞术（flow cytometry）是一种通过激光照射、细胞荧光标记和单个细胞分析的技术，用于研究和识别细胞的性质和功能。
它可以分析多种类型的细胞，包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。
流式细胞术具有高通量、快速并且可以同时分析多个参数等优势，因此被广泛应用于生物学研究、临床诊断和治疗等领域。
1.激光照射：流式细胞仪使用一束高能激光照射通过细胞悬液。
通常使用的激光有紫外线、蓝色、绿色和红色等多种波长。
激光束通过透镜系统聚焦，使细胞悬液中的细胞逐个经过照射点。
2.细胞荧光标记：在流式细胞仪实验前，细胞需要进行荧光染色，以便能够准确地测量和分析不同细胞参数。
荧光标记通常是通过将细胞与特定的标记分子（包括化学荧光染料、抗体或融合蛋白等）结合。
这些标记物可以与细胞的特定结构（如表面抗原、内源性蛋白等）相互作用，从而使细胞在流式细胞仪中发出荧光。
3. 光散射和荧光检测：经过激光照射后，细胞会散射光线。
光散射可以分为两种类型：前向散射（forward scatter，FSC）和侧向散射（side scatter，SSC）。
FSC反映细胞的大小，而SSC反映细胞的复杂性和内部结构。
同时，通过引入适当的滤光片和光学分束器，可以同时检测细胞所发出的荧光信号。
流式细胞仪通常具有多个荧光探测器，可以同时检测多个荧光染料。
4.数据分析：通过流式细胞仪获得的数据是复杂的多维数据，需要进行后续的数据分析和解释。
常见的数据分析方法包括数据精炼、数据规范化、聚类分析、细胞子群分析等。
可以通过计算机软件对数据进行处理和可视化，以获得有关细胞种群组成和特征的更深入的理解。
流式细胞术在许多研究领域和临床应用中发挥着重要作用。
例如，通过流式细胞术可以定量检测一些细胞亚群的数量和频率，用于检测和监测疾病的发生和发展，如肿瘤、免疫性疾病等。
此外，流式细胞术还可以用于筛选新药的有效性和安全性评估，以及研究细胞信号转导、基因表达和细胞分化等生物学过程。
流式细胞术
荧光素直接与FcR结合
做多色分析时，要尽量选择荧光波谱重叠
较小的荧光染料进行组合。
荧光素的搭配
依据
流式细胞仪检测的通道数
需要同时检测的荧光抗体数
厂家提供的荧光素种类和数目
3. 仪器调整及数据获取
荧光补偿：指在流式细胞多色分析中，纠正荧
光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的 荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。
Mean：平均荧光强度 Geo mean：几何均数 CV：细胞荧光变异细胞 Median：荧光强度的中值
Peak Ch：峰值道数
多参数分析-二维散点图
散 射 光 越 强 ， 细 胞 内 部 颗 粒 和 细 胞 器 越 多
与 细 胞 内 部 的 精 细 结 构 和 颗 粒 性 质 有 关
侧 向 角 ： 细 胞 通 过 测 量 90° 方 向 的 散 射 光 前向角：激光检测区正向收集的小角度散射光。 与细胞的大小和细胞表面光滑度有关。
临床检验诊断学研究生课程
流式细胞术
检验科
参考书
实用流式细胞术
北京大学医学部出版社 刘艳荣 主编
临床流式细胞分析
上海科学技术出版社 王建中 主编
教学目的
掌握流式细胞术的基本工作原理
熟悉流式细胞术的临床及科研应用 了解流式细胞术的质量控制
流式细胞术定义
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞 仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞 理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。
门的形状：线性门、矩形门、圆形门、多边形
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
免疫荧光间接法流式细胞法
免疫荧光间接法流式细胞法引言免疫荧光间接法流式细胞法是一种常用的细胞学技术，通过结合免疫荧光染色和流式细胞术，能够快速、准确地分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况。
本文将介绍该方法的原理、步骤以及应用领域。
一、原理免疫荧光间接法流式细胞法基于免疫荧光染色的原理，利用免疫学技术中的特异性抗原与抗体结合的原理，将标记有荧光物质的二抗与目标细胞上的特定抗原结合，通过流式细胞仪的激光器激发荧光物质，从而实现对细胞的定量和定位分析。
二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样本收集并处理，如血液样本需要进行红细胞溶解，组织样本需要进行细胞分离等。
2. 免疫反应：将细胞与特异性的一抗进行孵育，使一抗与细胞表面或内部的特定抗原结合。
3. 洗涤：用含有缓冲剂的洗涤液洗去未结合的一抗。
4. 二抗结合：加入标记有荧光物质的二抗，使其与一抗结合。
5. 洗涤：用洗涤液洗去未结合的二抗。
6. 流式细胞术：将样本放入流式细胞仪中，通过激光激发荧光物质，收集并分析细胞的荧光信号。
三、应用领域免疫荧光间接法流式细胞法在许多领域都有广泛应用。
1. 免疫学研究：该方法可用于分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况，从而研究免疫细胞的功能和相互作用机制。
2. 肿瘤学研究：通过检测肿瘤细胞上的特异性抗原，可以实现肿瘤细胞的鉴定和分类，进而指导肿瘤的诊断和治疗。
3. 感染病原体检测：该方法可用于检测感染病原体在宿主细胞中的定位和表达水平，为感染病原体的诊断和治疗提供重要依据。
4. 免疫监测：通过定量分析细胞表面的特定抗原，可以评估免疫功能的状态，如淋巴细胞亚群的分析、免疫细胞活化的检测等。
5. 药物研发：该方法可用于评估药物对细胞表面或内部蛋白质的影响，为药物研发提供重要参考。
结论免疫荧光间接法流式细胞法是一种快速、准确的细胞学技术，通过免疫荧光染色和流式细胞术的结合，能够对细胞表面或内部的蛋白质表达进行分析。
该方法在免疫学研究、肿瘤学研究、感染病原体检测、免疫监测以及药物研发等领域有着广泛的应用前景。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析-精选文档
免疫组化流程示意图
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
免疫组织化学结果分析
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。 孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。
HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时
2.非特异性显色
石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
IHC常用酶标二抗原理示意图
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
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流式细胞术多色荧光分析指南
流式细胞术多色荧光分析是一种用于细胞表型、功能和状态分析的重
要方法。
利用流式细胞仪和多色荧光标记的抗体，可以同时检测多个细胞
表面分子、胞内蛋白、核酸等分子的表达水平和活性状态，为研究细胞的
功能和疾病发生机制提供了强大的技术支持。
本文将详细介绍流式细胞术
多色荧光分析的实验步骤、注意事项和数据分析方法。
一、实验步骤
1.细胞样品的制备
首先，需要准备良好生长状态的细胞样品。
细胞可以来自体外培养的
细胞系、原代细胞、细胞悬液、血液或组织样本等。
将细胞样品离心收集，并用适当的生理盐水或细胞培养基洗涤细胞，去除杂质和细胞培养基中的
药物或抗体。
2.细胞荧光标记
在合适的体积中加入细胞样品，使细胞浓度适宜（一般为10^6 ~
10^7个/ml）。
接下来，根据研究需求，在细胞样品中加入适当浓度的荧
光标记抗体，进行免疫反应。
免疫反应一般需要在室温下进行20 ~ 30分钟。
为了防止非特异性结合，可以添加适当浓度的不相干（Isotype）控
制抗体。
3.洗涤和固定
免疫反应结束后，需要用生理盐水或缓冲液进行洗涤，去除未结合抗体。
洗涤时可以采用离心沉淀法或流式细胞术仪器自带的洗涤功能。
洗涤
后，用合适的细胞固定液对细胞进行固定。
常见的细胞固定液有甲醛、乙醛、琼脂糖等，可以依据实验设计选择适当的固定液。
4.流式细胞仪检测
固定后的细胞样品可以在流式细胞仪上进行数据采集和分析。
在操作流式细胞仪之前，需要对仪器进行标定，确保仪器的精度和准确性。
将固定细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，设置适当的流速和相关参数。
流式细胞仪会激发标记物的荧光信号，并检测细胞产生的荧光信号。
根据标记物的不同荧光波长，可以设置相应的滤光片和探测器。
二、注意事项
1.细胞保存和操作温度
细胞样品的保存温度和操作温度对实验结果具有影响。
一般细胞样品需要在4℃冷藏保存，防止细胞的失活和变性。
在实验过程中，保持适宜的操作温度（一般为室温）是重要的，避免细胞过热或过冷。
2.荧光标记抗体的选择
选择合适的荧光标记抗体对于多色荧光分析的成功至关重要。
首先需要确保抗体的特异性，避免非特异性结合；其次需要选择不同激发波长和发射波长的荧光染料，避免荧光重叠；还需要考虑各种探测器的敏感度和分辨率，确定合适的荧光通道组合。
3.数据分析和解释
流式细胞仪采集的原始数据可以通过特定的软件进行分析和解释。
常见的分析方法包括细胞计数、细胞表面分子的表达比例和强度分析、细胞
亚群的分析等。
根据研究的目的，可以采用不同的数据统计和图表展示方法。
三、数据分析方法
1.细胞计数
流式细胞仪可以记录细胞的数量，可以通过统计每个细胞事件的数量
来得到细胞总数。
通过细胞计数，可以比较不同条件下的细胞数量变化，
评估细胞增殖、凋亡等生理过程。
2.细胞表面分子的表达比例和强度分析
通过荧光标记的抗体，可以检测细胞表面分子的表达。
根据荧光信号
的强度，可以计算细胞表面分子的表达比例，并细分不同表达水平的细胞
亚群。
通过比较不同样品中细胞亚群的变化，可以研究细胞增殖、分化、
活化等过程。
3.细胞亚群的分析
通过对多个荧光标记的抗体进行组合，可以同时检测多个细胞表面分
子的表达，在细胞亚群中表达不同分子，从而描述细胞的群体复杂性。
通
过染色和分析荧光信号的强度，可以分离和刻画不同的细胞亚群，并研究
其功能和状态。
综上所述，流式细胞术多色荧光分析是一种重要的细胞表型分析方法，为研究细胞功能和疾病机制提供了强大的技术支持。
在实验中需要注意细
胞样品的制备、荧光标记抗体的选择和数据分析方法的应用。
通过合理的
实验设计和数据解读，可以获取准确、可靠的实验结果，为细胞生物学和
医学研究提供有力的支持。