烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生

σ=0.386
Uc= (p 光-p 暗)/ p 平均=-0.6686 | Uc |=0.6686＜uα/2=2.58，故接纳 H0，拒绝 H1，即光照培养和黑暗条件下
培养的愈伤组织的诱导率无明显差异
3.3.2 平均每个愈伤组织分化芽数的差异显著性分析 假设：H0 是没有显著差异的
不同光照条件对愈伤组织诱导情况的方差分析表
注意在夹取外植体时动作要快，也要注意在对镊子高温消毒后要适 当冷却，否则会造成外植体失水或者烫伤而影响生长。并且要严格进行 无菌操作。
2.4 烟草植株的再生
将上述愈伤组织按类型顺次转到分化培养基上，接种 18 瓶，20~22 条 件下连续光照培养 3~4 周，直到长出芽。
3 结果与分析
3.1 愈伤组织诱导
态发生，使一个细胞、一个组织或一个器官的细胞通过脱分化形成愈伤组 织，并再分化成植株[2]。为了获得用于细胞大量培养的培养物，要从植物 不同的部位诱导生长旺盛的愈伤组织[3]。所谓愈伤组织原是指植物在受伤 后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中则指在人工培养基上 由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞[4]。目前组织培养中能重复地 形成愈伤组织和再生植株的一般限于从活跃分生组织部分而来的外植体， 如不成熟的幼胚、幼叶和幼花序，叶肉组织是一般常用的起始材料[5]。得
到愈伤组织以后，在愈伤组织继代培养时需要通过改进培养基和调整培 养温度与光照对培养条件进行优化，以获取最大的生物量和有用成分的 产率。
烟草是植物组织培养的四大典型实验植物之一，也是一种重要的经 济作物，在国民经济发展中起着重要的作用。目前，通过烟草的花药培养， 原生质体培养，以及烟草叶组织培养已经成功获得烟草的体外再生植株。 烟草组织培养技术的成熟，为烟草的快速繁殖和新品种的筛选打下了坚 实的基础。
编 每瓶接种 培 养 条 愈 伤 组 织 诱 导 率 愈伤组织状态
号
数
件
（%）
污染率 （%）
1
5
光
100
绿色，体积大，疏松
0
2
5
光
3
5
光
80
黄绿色，体积中等， 疏松
0
100
绿色，体积大，疏松
0
4
4
光
5
5
光
6
5
光
100
黄绿色，体积中等， 疏松
0
100
黄绿色，体积中等， 疏松
0
100
绿色，体积大，疏松
0
Key Words : callosity, inducement ; light ;differentiation.
1.前言:细胞工程是应用细胞生物学的方法，有计划地改变细胞遗传物质并使之
增殖，从而生产有用的产物或引向成体化的综合科学技术[1]。 在植物细胞、组织和器官培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形
表 2 烟草叶片愈伤组织再生植株情况
Tabel2 Regeneration of tobacco plantlet
编 号
愈伤组织 来源（光、
暗）
分化率 （%）
分化 芽数
平均每个愈 伤组织分化
芽数
分化芽 状态
污染率 （%）
1
光
光 4
光 9
暗 12
15
暗
暗 17
100 46 100 30
80
32
80
18
本实验通过对烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生，来认识和掌握 诱导植物愈伤组织的诱导培养技术和调控条件，了解器官分化和植株再 生的过程。
2 材料与方法
2.1 培养基
愈 伤 组 织 诱 导 培 养 基 ： MS + BA 2.0 mg/ L + NAA2.0mg/ L+Sucrose 20g/L+ Agar 7g/L；分化培养基：MS + BA 2.0 mg/ L + NAA 0.5mg/ L Sucrose 20g/L+ Agar 7g/L 。将以上培养基用 0.5N NaOH 与 0.5N HCl 调 整 pH 调至 5.8~6.0 ，在高压灭菌锅中 121 ºC，1.1kg/cm2 条件下恒温灭 菌 20 min 备用。
100
密
0
乳白色，体积小，致
100
密
0
80
淡黄色，体积中等，
0
致密
乳白色，体积小，致
100
密
0
1
5
暗
8
100
淡黄色，体积中等， 致密
0
3.2 器官分化与植株再生
分化培养基上培养 3 周后，每一样品几乎都出现了分化，但分化程 度不一。光照处理的愈伤组织体积明显变大并长出了芽和芽点，其中一 部分已经分化出叶片；经过黑暗处理的愈伤组织体积也变大但是不如光 照的明显，而且颜色也由乳白色或淡黄色变为浅绿色，有芽及绿色的芽 点分化，但相对较少。从光培养和暗培养里各选出三瓶分化最多的，统 计其数据，填入下表。
callosity from leaf show that light have less effect on the inducement of callosity from leaf ,but have more effect on the differentiation of bud.
2 mm2 tobacco leaf discs were inoculated on MS medium supplemented with BA (2.0 mg/L) and NAA(2.0 mg/L).Then induce the callosity , one group in light and the other group in darkness . After two weeks , culture the callosity on MS medium supplemented with BA(2.0 mg/L) and NAA(0.5 mg/L) in light . after three weeks it will produce the bud.
愈伤组织在分化形成芽和整个小苗的过程中对光照有一定的需求， 除了对叶绿体等细胞器的形成有重要作用外，还与其他的因素有关，比
如与激素之间的相互影响和作用。光照对器官发生的调节可能与调节培养 物的内源激素平衡有关。潘战生等研究了光效应与激素作用之间的关系后 认为：光效应与激素作用的效应不是简单相加，而是相互影响的。这具体 体现在激素浓度低时，蓝光外其他波长的光对愈伤组织生长均有明显的 促进作用；而在激素浓度高时，蓝光外其他波段的光对组织的作用甚微， 这可能是被激素的效应所掩盖。在不改变光照条件时，激素的作用与两类 激素的浓度比例有关。而用不同波段的光照时，则显示出光的作用的光谱 特征还与激素浓度绝对值有关[9]。光照还可能影响生长素的信号转导系统， 调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。
组织培养中光照是重要的条件之一，主要表现在光强、光质和光照时 间方面。光照时间对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，对外植体、 细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗 壮，而强度较弱的幼苗容易徒长。光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖 以及器官的分化都有明显的影响[2]，。Seibert 等在烟草叶组织培养中发现 蓝光和近紫外光有促进芽的发生和愈伤组织增重的作用[10]。光质对器官分 化的影响可能与光受体精确调节系统有关。
3.3.1 愈伤组织诱导的差异显著性分析
假设 H0：p 光=p 暗，H1：p 光≠p 暗
n 光=44，x 光=42 ，p 光=95.45%
n 暗=44，x 暗=43 ，p 暗=97.73% 对水平 α=0.01 作双侧检验，uα/2=2.58
p 平均= （x 光+ x 暗）/（n 光+n 暗）=0.9659，q 平均=0.0341
光 照 可 以 促 进 组 织 的 分 化 和 植 物 的 正 常 形 态 的 建 成 [6] 。 颜 季 琼 等 （1982）发现烟草叶肉原生质体壁的再生率在光下最高，达到 60-76%[7]。 光照对植物的叶绿体的形成有重要的作用，在个体发育中，叶绿体是由 前质体分化而来。前质体的进一步发育主要与光照条件有关。在光照条件 下，形成基质类囊体和光合色素，前质体即发育成叶绿体。在黑暗条件下， 前质体形成前片层体。具有这种结构的质体称为白色体或黄化质体，一般 颜色为白色或黄色，当白色体重新受到光照后，前片层体弥散，发育而 形成具有正常机构和功能的叶绿体[8]。
2.2 烟草无菌试管苗（由老师提供）
将烟草种子用消毒液 84#消毒后，以无菌水洗 3 次，无菌吸水纸吸 干水分，然后接种在 MS 培养基上。种子苗具 4~5 叶时继代扩繁备用。
2.3 烟草叶片愈伤诱导
消毒后，在超净工作台上夹取上述烟草无菌试管苗幼嫩叶片 2mm2 左右并接种到愈伤组织诱导培养基上，每瓶接 5 片，共接种 18 瓶，快速 封口后顺次将其编为 1~18 号。将接种后的三角瓶置于 24ºC 条件下黑暗 培养一周，然后在同样温度下把 1~9 号瓶放在光照条件下培养，10~18 号瓶放在黑暗条件下培养，直至愈伤组织形成。
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生
朱健 01 级生物技术（1）班 200113712 王宇 01 级生物技术（1）班 200113724 孙亮 01 级生物技术（1）班 200113703
摘要： 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的实验结果表明：光照对于愈伤组 织的诱导没有特别明显的影响，而对组织的分化和植株再生有一定的 影响。 将 2mm2 左右的烟草叶片接种到 MS + BA 2.0 mg/ L + NAA2.0mg/ L 的培养基中分光照和黑暗两种条件分别诱导愈伤组织。2 周后，将愈 伤组织按类型转到 MS + BA 2.0 mg/ L + NAA 0.5mg/ L 培养基中光照培 养，3 周后长出烟草幼芽。