实验十六烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生
烟草植物组织培养
烟草植物组织培养实验实验目的一学习和掌握植物组织培养技术，理解植物细胞的全能性。
实验原理二年代初期发展起来的一项生物技术。
由于其拥有占地世纪30植物组织培养是从20少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。
本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。
在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。
从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。
①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。
用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。
起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。
机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。
在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。
外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物、萘乙4-D4-二氯苯氧乙酸2，，质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2）细胞分裂素IBA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸NAA酸、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA））等。
分裂期是，KT-30CPPU糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（6-（苄氨基嘌呤6-BA、6-指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。
处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。
外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。
例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。
烟草植物组织培养
烟草植物组织培养实验一实验目的学习和掌握植物组织培养技术，理解植物细胞的全能性。
二实验原理植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。
由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。
本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。
在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。
从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。
①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。
用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。
起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。
机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。
在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。
外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、萘乙酰胺NA D和吲哚乙酸IAA、吲哚丙酸IP A和吲哚丁酸IBA）细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤6-BA、6-糠氨基嘌呤（K T）氯吡苯脲（KT-30，CPPU））等。
分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。
烟草的组织培养技术
烟草的组织培养技术一、目的与要求1.验证“植物细胞全能性”理论。
2.学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法。
二、实验原理植物组织培养是指在无菌条件下，分离、并在培养基中培养离体植物组织（器官或细胞）的技术。
植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适当条件下具有繁殖出完整植株的能力。
植物组织当中原本已经分化的细胞，组织、器官一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出细胞的全能性，从已经分化的细胞通过脱分化，成为重新具有分裂能力的胚性细胞，并能再分化重新生长发育成完整的植株。
愈伤组织：是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的细胞团。
脱分化：已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性细胞的过程。
再分化：经过脱分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细胞、组织、器官或完整植物体。
三、材料和用具1.材料：无菌烟草叶盘（已经诱导成芽），拟南芥。
2.用具：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、电子天平、移液器、手术解剖刀、大、小镊子、30ml烧杯、500ml烧杯、药勺、玻璃棒、培养瓶、平皿、试纸（PH5.4-7），报纸等。
3.试剂：MS培养基、0.5mol/LNaOH、1mol/L HCl。
四、操作步骤（一）诱导培养基配制（见表1）1.加MS储液（储液配置见附表）大量元素和微量元素的母液都是高浓度的，为防止混合后发生沉淀，建议加完大量元素后先加水（约总体积3/4），再加各微量元素和有机成分。
铁盐也是微量元素，因为易发生沉淀，所以与其它微量元素分开配。
储液中的铁盐存于棕色瓶中。
配好的储液应当4℃保存。
表1是4瓶培养基（1组）的配置方案。
表1 诱导培养基配制表成分实际称取量蒸馏水120 mlMS母液15 mL蔗糖 4.5 g用蒸馏水粗略定容至100mlpH值 5.8琼脂 1.2 g2.加蔗糖（3%）（m/v）。
烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证
+ + 都较均匀
+
1块上面较43; 分化出了大量丛生芽 ,且均匀
注 :“ + ”表示极度分布不均 ,多数在一个以下 ;“ + + ”表示均匀分布 ,但都较小 ,多为分化点 ,且其数量在 10～20;“ + + + ”表示分布均匀 ,且都很 多 ,最少的愈伤组织上至少也有 20个丛生芽或者分化点。
愈伤组织形成数 ∥块
诱导率 ∥%
愈伤组织生长状态
Pollution number 0 0 0 0 0
Callus number 5 4 4 3 5
Induction rate 100 80 80 60 100
Growth state of callus 5块都比较大 ,且较均匀 有 2块较小 不均匀 , 2块中等 , 2块很小 2块较小 , 1块上面有黑点 中等均匀
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
6334
安徽农业科学 2009年
ferentiation point, the number is 10 - 20; + + + indicates the distribution is even and much, the least callus number is 20 multip le shoots or differen2
分化数
D ifferentiation number 5 5 4 3 5
分化率 ∥% D ifferentiation
rate 100 100 80 60 100
烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证
烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证陈辉;姚志恒【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2009(037)014【摘要】[目的]研究烟草愈伤组织的发育情况及其丛生芽或分化点的形态建成.[方法]在无菌条件下,把烟草叶片切块培养在含有2mg/L NAA和1 mg/L6-BA的MS 培养基上诱导愈伤组织的形成;而后,转移愈伤组织到含有NAA 0.1 mg/L+BA 2.0 mg/L的分化培养基上使其产生丛生芽或分化点.[结果]诱导培养20 d后,愈伤组织基本形成且没有发生污染,烟草叶片愈伤组织的诱导培养是成功的.愈伤组织的整体分化率比较高,愈伤组织上形成的丛生芽或分化点比较多,且分布比较均匀;编号为4的分化培养基上愈伤组织的分化不理想,且其丛生芽或分化点分布极不均匀.在烟草叶片愈伤组织的分化培养中NAA和6-BA的添加量分别为0.1和2.0 mg/L.[结论]该研究为植株繁育提供了良好的技术支持.【总页数】2页(P6333-6334)【作者】陈辉;姚志恒【作者单位】荆州职业技术学院,湖北荆州,434020;荆州职业技术学院,湖北荆州,434020【正文语种】中文【中图分类】S572【相关文献】1.培养基和继代时间对番茄叶片愈伤组织诱导和芽分化的影响 [J], 毕建水;李翠翠;徐丽丽2.灵发素(LFS)诱导烟草叶片愈伤组织的研究 [J], 李廷洋;周凤珏;许鸿源;周文亮;龚银花;赖洪敏;陈念平;解云英;许鸿章3.红花烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生 [J], 董行健;余宗波4.迷迭香叶片愈伤组织诱导及再分化培养 [J], 董玉梅;李正楠;钱成;刘宝刚;段如兰;刘雅婷5.汾阳核桃叶片愈伤组织的诱导、增殖及分化培养 [J], 张燕;范宏伟;张国强;张鹏飞;吴国良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
2 烟草愈伤组织诱导实验
烟草叶片愈伤组织诱导分化实验1. 实验目的（1）通过诱导植物（烟草叶片、水稻种子）愈伤组织和器官发生，分析生长素和细胞分裂素对烟草叶片离体培养的作用。
（2）了解植物组织在离体培养条件下脱分化和再分化的特点。
2. 实验原理外植体形成愈伤组织大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。
启动期主要通过激素以及环境因素的诱导使外植体细胞代谢增强，大量蛋白质与核酸形成为细胞分裂做准备；分裂期时外植体细胞在激素诱导下脱分化并不断增殖，形成结构疏松的组织块；形成期时，由于不同植物生长激素的诱导使愈伤组织形成根、芽等形态分化。
烟草为常见模式植物之一，常用于植物组织培养，是研究细胞脱分化和再分化的理想材料。
在愈伤组织诱导及分化过程中，光照条件起到的作用是促使愈伤组织进行光合作用生成糖类，促使代谢活动进行。
6-BA、NAA均为植物生长调节剂，6-BA属于细胞分裂素，可诱导愈伤组织发生并促进牙的形成；NAA属于细胞分裂素，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。
根据Skoog和Miller提出的生长素和细胞分裂素相对浓度调节器管分化的概念，相对高的生长素有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂素浓度有利于不定芽的分化。
通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官分化，已经在许多植物的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物中也得到了证实。
3. 实验材料与操作方法3.1 实验材料3.1.1 材料选择：烟草By-2，滤纸片，枪头3.1.2 实验试剂：（1）植物生长调节剂（超净台过滤灭菌，1.5 mLEP管分装后-20℃贮存）6-BA 0.5mg/mL（1mol/L NaOH溶解再用蒸馏水定容）NAA 0.5mg/mL（1 mol/L NaOH溶解再用蒸馏水定容）（2）抗生素（超净台过滤灭菌，1.5 mLEP管分装后-20℃贮存）卡那霉素50 mg/mL（蒸馏水定容）利福平15 mg/mL（无水乙醇溶解再用蒸馏水定容）链霉素30 mg/mL（蒸馏水定容）羧苄青霉素100 mg/mL（蒸馏水定容）（3）实验用培养基MS大量元素储存母液（50×，蒸馏水定容）：1650mg/L NH4NO3+1900mg/L KNO3+370mg/L MgSO4·7H2O+170mg/L KH2PO4+440mg/LCaCl2·2H2O（CaCl2·2H2O在配制过程中不易溶解，可单独配成储液存放）MS微量元素储存母液（100×，蒸馏水定容）：0.83mg/L KI+6.2mg/L H3BO3+22.3mg/L MnSO4·4H2O+8.6mg/L ZnSO4·7H2O+ 0.25mg/L Na2MoO4·2H2O+0.025mg/L CuSO4·5H2O+0.025mg/L CoCl2·6H2O +27.8mg/LFeSO4·7H2O +37.3 mg/L Na2-EDTA·2H2O（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA·2H2O两个试剂配制成100×溶液4℃冰箱避光储存）MS有机成分储存母液（100×，蒸馏水定容）：3mg/L甘氨酸+0.5mg/L烟酸（维生素B5）+0.5mg/L盐酸吡哆醇（维生素B6）+0.1mg/L盐酸硫胺素（维生素B1）+100mg/L肌醇（肌醇难溶解，一般独自配成浓缩液储存）MS培养基（NaOH调节至pH 5.8，蒸馏水定容）：1×大量元素+1×微量元素+1×有机成分+30g/L蔗糖+0.8%琼脂+不同比例生长素（6-BA+IAA）3.1.3 实验仪器：超净工作台，烧杯，锥形瓶，培养皿，枪形镊子，眼科剪，移液枪，酒精灯，光照培养室，3.2 操作方法取幼嫩烟草叶片约5片（选择幼年的外植体较好，如分生组织、维管束、形成层组织、静止的薄壁组织），用自来水清洗晾干。
烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立分析
实验原理
分化了的植物叶片细胞往往具有全能性，因 此将烟草叶片从植株上分离后，给予一定的培养 条件，可以诱导叶片细胞脱分化，脱分化的细胞 不断分裂就形成愈伤组织，愈伤组织再在合适的 培养条件下又能够再分化形成完整植株，烟草愈 伤组织的再分化是以不定芽的方式，即愈伤组织 先形成不定芽，再由不定芽形成完整植株，从而 完成了再生体系的建立。
接种第一天
接种第二天，因为外植体细胞开始被诱导脱分化， 并不断分裂增殖，造成叶片中央与边缘的细胞分 裂不均匀，因此，叶片中央凸起。
接种第五天，脱分化细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织， 表现为叶片边缘泛黄增脱分化细胞不断增值，愈伤组织 不断增厚，整个叶片都翘起，并且已经开始再 分化形成绿色生长点。
实验十
烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立
实验目的： 1.通过实验，掌握无菌操作方法，熟悉烟草愈伤组织 的诱导及再生体系的建立的整个过程。 2.学习再生体系的建立方法，为掌握其他植物的组织 培养奠定基础；同时为转基因技术提供一个平台。
再生体系的建立主要应用于以下几个方面： 1、用于验证植物细胞的全能性。 2、是植物基因工程的重要基础，外源基因 转入受体细胞，受体细胞通过脱分化形成愈伤组 织，愈伤组织通过再分化形成植株，从而获得转 基因植株。 3、也是植物快繁的一种方式，通过诱导愈 伤组织再分化，能够在短时间内形成大量的不定 芽或胚状体，从而获得大量的植株。
第九天（诱导生成愈伤组织）
接种第十九天，绿色生长点进一步发育形成了不定芽， 不定芽长度最长可达1 cm 。
第十九天（长出幼叶）
将不定芽在无菌条件下，从芽的基部切下，然后插入生根培养基 中（1/2 MS），诱导生根。
芽的生根情况
实验步骤 一）材料的消毒 ： 1）剪取生长健壮的叶片，最好带有叶柄。 2）将整个叶片（包括叶柄）全部浸入70％的乙醇中， 不断振荡30 s。 3）将乙醇倒掉，迅速加入0.1％ 的升汞，再将整个叶片 （包括叶柄）全部浸入0.1％ 的升汞中，不断振荡 10 min。 4）于工作台上用无菌镊子将上述叶片夹入无菌烧杯中， 同时将升汞倒入盛有硫化钠的桶里。 5）用无菌水冲洗上述叶片3－5遍，取出后用无菌滤纸 吸干，备用。
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立一、概述烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，是植物组织培养领域中的一项重要研究。
烟草作为一种重要的经济作物，其组织培养技术的研究对于提高其生产效率、优化品质具有重要意义。
愈伤组织的诱导是植物组织培养的第一步，也是后续细胞悬浮培养、基因工程操作等的基础。
烟草愈伤组织的诱导，通常通过无菌操作，利用激素等生长因子刺激烟草叶片等外植体细胞脱分化形成。
这一过程不仅受到激素种类和浓度的影响，还受到光照、温度、湿度等培养条件的影响。
优化诱导条件，降低褐化等不利因素的影响，是烟草愈伤组织诱导研究的关键。
细胞悬浮培养体系的建立，则是进一步将愈伤组织转化为可用于大规模生产和基因操作的细胞悬浮液。
通过选择适当的培养基、调节生长条件、优化细胞悬浮密度等手段，可以实现烟草细胞的稳定增殖和高效表达。
本文旨在探索烟草愈伤组织的诱导条件以及细胞悬浮培养体系的建立方法，通过系统的实验设计和优化，为烟草组织培养技术的发展和应用提供理论基础和实践指导。
这一研究也将为其他植物的组织培养提供有益的参考和借鉴。
1. 烟草愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系的重要性烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，在植物组织培养、基因工程以及植物快繁等多个领域都具有重要的科学意义和实践价值。
愈伤组织的诱导是植物组织培养中的关键环节。
通过特定的培养基和培养条件，可以诱导烟草叶片等外植体脱分化形成愈伤组织。
这一过程不仅验证了植物细胞的全能性，而且为后续的细胞悬浮培养提供了适宜的起始材料。
细胞悬浮培养体系的建立为植物细胞的大规模培养和遗传转化提供了平台。
通过优化悬浮培养条件，可以获得大量生长状态良好的细胞，进而用于后续的基因转化、次生代谢产物生产等研究。
悬浮培养体系还可以用于筛选具有优良性状或抗性的细胞株系，为烟草育种提供新的途径。
烟草愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系在植物快繁方面也具有潜在的应用价值。
通过诱导愈伤组织再分化形成不定芽或胚状体，可以在短时间内获得大量的植株，从而实现烟草的快速繁殖。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（3）记录： 1）愈伤组织出现时间，不定芽和不定根出 现时间。 2）统计愈伤组织诱导率，不定芽和不定芽 诱导率。 3）组培苗高度，根长度。 4）其他生长现象。
4、配制培养基
（1）按比例吸取培养基贮存液（各组设计不同浓度的BA 和NAA组合2个）
（2）称取琼脂（0.7%）、蔗糖（3%）
（3）加入蒸馏水到一定体积 （4）调节pH到5.6~5.8 （5）煮沸后分装到三角瓶中，封口膜封口。 5、高压灭菌 （1）培养基
（2）培养皿（带滤纸），5个；烧杯：200ml和500ml各2个。
实验十六 烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生
1、实验目的
2、实验原理 3、配制MS培养基贮存液
（1）大量元素（10）
（2）铁元素（100 ） （3）微量元素（100 ） （4）有机营养（100 ） （5）植物生长调节剂（mg/ml）
100ml/L；50ml/500ml
10ml/L； 5ml/500ml 10ml/L； 5ml/500ml 10ml/L； 5ml/500ml
（3）蒸馏水：500~1000ml
6、实验材料
（1）取样：取完全展开的幼叶，自来水洗净 晾干。
（2） 整理
7、外植体的表面消毒（在超净工作台内）
（1）消毒剂：70%或75%乙醇；10%次氯酸钠 （2）步骤： 70%乙醇 30s 10%次氯酸钠 3~5次，每次间隔3~5min
5-8min
无菌水清洗
8、接种
准备下次实验
1、配制D2原生质体培养基（D2大量元素+MS的 铁+MS的微量元素+MS的有机营养+0.5mg/L 2,4D+0.05mg/L BA+0.2mol/L葡萄糖+0.1mol/L甘露醇 +1%蔗糖，pH5.6），各组50ml，过滤灭菌。
2、CPW培养基+0.4mol/L甘露醇，pH 5.4，各组 50ml，分装成10ml和20ml，高压灭菌。 3、其他高压灭菌的用具：过滤器（2），注射筒 （1），不锈钢网筛（=54m）（1），漏斗 （1），三角瓶（5），滴管（10支），10ml刻度 离心管（2支）。