酶切常见问题
酶切常见问题
问题：DNA完全没有被内切酶切割
原因：
1) 内切酶失活
2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子
3) 条件不适（试剂、温度）
4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化
5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）
6) DNA位点上存在其它修饰
7) DNA不存在该酶识别顺序
对策：
1）标准底物检测酶活性
2）将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3）检查反应系统是否最佳
4）换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株
5）换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增
6）将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证
7）换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证
问题：DNA切割不完全
原因：
1) 内切酶活性下降
2) 内切酶稀释不正确
3) DNA不纯，反应条件不佳
4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存其它修饰
5) 部分DNA溶液粘在管壁上
6) 内切酶溶液粘度大，取样不准
7) 酶切后DNA粘末端退火
8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性
9) 过度稀释使酶活性降低
10)反应条件不适
11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
对策：
1）用5-10倍量过量消化
2）用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
3）同上
4）同上
5）反应前离心数秒
6）将内切酶稀释，增大取样体积
7）电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷
8）使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡
9）适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏
10）使用最佳反应体系
11）加大酶量5-10倍
问题：DNA片段数目多于理伦值
原因：
1) 内切酶星状活性
2) 其它内切酶污染
3) 底物中含其它DNA杂质
对策：
1）检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量
2）用λDNA作底物检查酶切结果
3）电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段
问题：酶切后没有观察到DNA片段的存在
原因：
1) DNA定量错误（如RNA含量较高）
2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀
对策：
1）用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量
2）在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次
问题：内切酶保存期内快速失活
原因：
1) 保存温度不合适
2) 以稀释形式保存
3) 贮藏缓冲液不适当
4) 低蛋白浓度
对策：
1）内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存
2）稀释酶液不宜长期存放，应一次使用
3）使用厂家推荐的贮藏缓冲液
4）内切酶与500ug/ml的BSA一起保存
问题：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原因：
1) DNA上结合有蛋白质
2) 内切
酶中含有DNA外切酶
对策：
1）电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化
2）减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
问题：酶切后的DNA片段连接效率低
原因：
1) 含磷酸盐的浓度高
2) 内切酶失活不全或含有ATP酶
3) 平末端连接
4) 外切酶污染
5) 连接缓冲液不合适
对策：
1）透析，乙醇沉淀去除磷酸盐
2）延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
3）加大T4 DNA Ligase用量
4）减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA
5）重新配制连接缓冲液
三、DNA分子量标准问题分析：
问题：带弱或无DNA带
原因：
1) 上样DNA的量不够
2) DNA降解
3) DNA走出凝胶
4) 对于EB染色的DNA，所用紫外光源不合适
对策：
1）增加DNA的上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高
2）避免DNA的核酸酶污染
3）减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
4）应用短波长（254nm），紫外灯增强灵敏度
问题：DNA带缺失
原因：
1) 小DNA带走出凝胶
2) 分子大小相近的DNA带不易分辨
3) DNA 变性
4) 巨大DNA链，凝胶电泳不合适
对策：
1）减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
2）增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度
3）电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA
4）在脉冲电声凝胶电泳上分析
问题：DNA带模糊
原因：
1) DNA降解
2) DNA上样量过多
3) 所用电泳条件不合适
4) DNA样含盐过高
5) 有蛋白污染
6) DNA变性
7）电泳缓冲液陈旧
对策：
1）避免核酸酶污染
2）减少凝胶中DNA上样量
3）电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃，巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
4）电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
5）电泳前酚抽提去除蛋白
6）电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA
7）电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液
问题：不规则DNA带迁移
原因：
1) 电泳条件不合适
2) DNA变性
对策：
1）电泳电压不超过20V/cm，温度＜30℃，电泳缓冲液有足够的缓冲能力
2）以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热