蜂针对佐剂性大鼠关节炎滑膜细胞因子基因表达的影响
肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、HIF-1α和VEGF表达的影响
肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、HIF-1α和VEGF表达的影响徐育冬;靳洪涛;宋新梅;张绍君【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普)对佐剂性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法将成年雄性Wistar大鼠随机分为5组,Ⅱ～Ⅴ组建立佐剂性关节炎大鼠(AA)模型,于造模后第12天开始Ⅲ组给予甲氨喋呤灌胃治疗,Ⅳ～Ⅴ组给予益赛普皮下注射治疗.第28天取膝关节滑膜,常规HE染色,计算滑膜病理积分,免疫组织化学染色检测TNF-α、HIF-1α和VEGF在膝关节滑膜的表达.结果Ⅰ组大鼠滑膜组织均有少量TNF-α、HIF-1α和VEGF的表达,Ⅱ～Ⅴ组较Ⅰ组均明显增高.Ⅳ、Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达较Ⅱ组明显减低(P<0.01)而Ⅲ组与Ⅱ组差异无统计学意义.Ⅲ～Ⅴ组滑膜组织HIF-1α、VEGF的表达均明显低于Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.01).结论益赛普可明显降低AA大鼠滑膜组织TNF-α、HIF-1α和VEGF表达.益赛普可以降低AA大鼠的关节炎指数、足体积,减轻足肿胀程度,对AA大鼠的关节炎症有明显的治疗作用.【期刊名称】《河北医药》【年(卷),期】2010(032)018【总页数】4页(P2475-2478)【关键词】佐剂性关节炎;大鼠;可溶性重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白;肿瘤坏死因子-α;缺氧诱导因子-1α;血管内皮生长因子【作者】徐育冬;靳洪涛;宋新梅;张绍君【作者单位】050000,石家庄市,河北医科大学第二医院免疫风湿科;050000,石家庄市,河北医科大学第二医院免疫风湿科;华北石油总医院肾内科;050000,石家庄市,河北医科大学第二医院免疫风湿科【正文语种】中文【中图分类】R593.22类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎，对称性和破坏性关节病变为主要特征［1］。
电针对佐剂性关节炎大鼠踝关节滑膜细胞胞浆内IκB磷酸化的影响
1494大Journal of Hunan University of Chinese Medicine 2020年12月第40卷第12期Dec. 2020 Vol. 40 No.12本文引用：祁芳，李艳玲，艾坤，蔡雄，李鑫，刘梨，杨茜芸.电针对佐剂性关节炎大鼠踝关节滑膜细胞胞浆内I k B磷酸化的影响[J].湖南中医药大学学报,2020,40(12): 1494-1498.电针对佐剂性关节炎大鼠踝关节滑膜细胞胞浆内I k B磷酸化的影响祁芳\李艳玲\艾坤蔡雄1，李鑫\刘梨2,杨茜芸1(1.湖南中医药大学，湖南长沙410208,2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007)〔摘要〕目的探讨电针足三里、关元穴对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠踝关节滑膜细胞胞浆内核因子k B(nuclear factor k$pp$-B, ；F-k B)的抑制蛋白I k B磷酸化的影响。
方法将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、甲氨蝶呤组（MTX组）、电针组，每组15只。
模型组、MTX组和电针组大鼠均于尾根部皮下注入完全弗氏佐剂复制AA模型。
自造模后第1天开始，MTX组大 鼠予以0.35 mg/kg剂量的MTX灌胃治疗，电针组大鼠每日予以电针关元、双侧足三里、阿是穴，共治疗3周，正常组和模型组正常 饲养不作干预。
治疗过程中每3天行1次体质量、足爪容积、关节炎指数测评；实验结束后对各组大鼠踝关节行HE染色切片，并运 用Western blot法分别检测大鼠踝关节滑膜细胞胞浆内I k B磷酸化水平及其重要相关蛋白；F-k B的含量。
结果与正常组比较，模 型组大鼠踝关节滑膜细胞胞浆内I k B磷酸化水平显著升高(！<0.01)，细胞核内；F-k B的含量显著升高(！<0.01);与模型组比较，电针组踝关节滑膜细胞胞浆内I k B磷酸化水平低于模型组(!<0.05)，细胞核内；F-k B的含量显著降低(！<0.01)。
佐剂性关节炎(AA)大鼠血清中瘦素(leptin)与TNF-α的关系
佐剂性关节炎(AA)大鼠血清中瘦素(leptin)与TNF-α的关系孙晓鹏【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2008(031)002【摘要】目的:研究瘦素(leptin)在佐荆性关节炎(AA)大鼠血清中的表达,以及与TNF-α的关系,以探讨leptin在类风湿关节炎(RA)发病机制中的作用.方法:通过给大鼠右后足足跖部皮下注射完全弗氏佐剂(CFA)建立类风湿关节炎(RA)的动物模型-AA.用放免法(RIA)测定AA大鼠血清中leptin,TNF-α的表达水平.结果:AA组大鼠血清中leptin水平高于正常组,TNF-α水平高于正常组,且血清中Ieptin的表达水平与TNF-α呈显著正相关.结论:AA大鼠血清中leptin水平增高,并与TNF-α呈显著正相关,leptin可能参与了RA的发病,为RA的治疗提供了新的途径.【总页数】2页(P15-16)【作者】孙晓鹏【作者单位】哈尔滨医科大学2005级高校教师项士研究生班,黑龙江,哈尔滨,150000【正文语种】中文【中图分类】R684.3【相关文献】1.红霉素对佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6表达的影响 [J], 孙雪茜;苏连明2.红霉素对佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-10及IL-17细胞因子水平表达的影响 [J], 孙晓鹏;万德珩3.复方甘草酸苷对佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1和IL-6表达水平的影响[J], 孙晓鹏;史然然;袁学强4.重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠血清中白细胞介素—1和瘦素表达水平的影响[J], 李振英;刘玮;陈学旻5.瘦素在佐剂性关节炎大鼠血清中的表达及其在关节炎发病机制中的作用初探 [J], 邹晓军;李明娥;孙晓鹏;齐铁莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
蜂针对类风湿性关节炎患者HPA轴的影响
蜂针对类风湿性关节炎患者HPA轴的影响作者：黄胜光1周颖芳2李万瑶（39蜂疗网）3[关健词]蜂针；类风湿性关节炎；HPA轴类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis，RA)是一种以关节病变为主的慢性自身免疫性疾病，其病理改变主要为关节的滑膜炎，并可逐渐累及关节软骨和骨质，导致关节肿胀、疼痛和功能障碍，甚至引起残废。
因此，RA的早期诊断和治疗对于病情的控制非常重要。
临床上用于治疗RA的治疗包括非街体抗炎药、改善病情抗风湿药、肾上腺皮质激素、生物制剂等，这些西药对缓解关节肿痛、控制病情进展有一定的疗效，但长期应用可能会给患者带来胃肠道、肾毒性等不良反应。
因而寻找疗效确切而又无明显不良反应的治疗方法倍显重要。
蜂针疗法作为一种传统民间疗法，以其良好的临床效果为RA患者所接受，但其作用机理尚不十分明了。
随着近年来神经一内分泌一免疫学的发展，下丘脑一垂体一肾上腺轴(Hypothalam-ic-Pituitar犷Adrenalaxis，HpA轴)在RA发病机制中的作用逐渐引起了大家的广泛重视。
本课题通过观察RA患者在蜂针、西药等治疗前后临床疗效及实验室指标的变化，观察蜂针疗法对RA患者HPA轴的影响，以探讨蜂针疗法的作用机制。
1资料与方法1.1一般资料2005年3月~2007年2月期间在广州中医药大学第一附属医院针灸门诊就诊的患者，共100例。
按照1987年美国风湿病学会类风湿性关节炎诊断标准[l]，将确诊为类风湿性关节炎的患者按简单随机法(根据随机数字表中数字随机化)分为蜂针组、电针组和西药组，其中蜂针组40例，电针组30例，西药组30例。
蜂针组男13例，女27例，年龄15-75岁，病程0.5~26年。
电针组男10例，女20例；年龄21~69岁，病程1~21年。
西药组男14例，女16例；年龄19~72岁，病程2~23.5年。
各组例数、性别、年龄及病程等一般状况见表1，经统计学处理，其差异无统计学意义(P>0.05)，表明组间具有可比性。
蜂毒肽对胶原诱导关节炎大鼠模型Th17Treg平衡及炎症的影响
2019年2月第29卷㊀第2期中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINEFebruary,2019Vol.29㊀No.2谭宁,贺守第,关丽,等.蜂毒肽对胶原诱导关节炎大鼠模型Th17/Treg 平衡及炎症的影响[J].中国比较医学杂志,2019,29(2):1-6.Tan N,He SD,Guan L,et al.Effects of melittin on Th17/Treg balance and inflammation in rat model of collagen-induced arthritis[J].Chin J Comp Med,2019,29(2):1-6.doi:10．3969/j.issn.1671-7856．2019．02．001[基金项目]国家自然科学基金(81271950)㊁深圳市科技计划基础研究项目(JCYJ20170307162827158)㊁深圳市卫生计生科研项目(201506091㊁201606050);深圳市南山区科技项目(2015021㊁2017016)㊂[作者简介]谭宁(1977 ),女,硕士研究生,研究方向:风湿免疫㊁中药研究㊂E-mail:helunkun@ [通信作者]黎德育(1966 ),男,教授,主任医师,研究方向:风湿免疫㊁中医中药㊂E-mail:282111306@蜂毒肽对胶原诱导关节炎大鼠模型Th17/Treg平衡及炎症的影响谭㊀宁1,2,贺守第2,关㊀丽3,杨平常4,刘志刚4,黎德育2∗(1.广州中医药大学第一临床医学院,广州㊀510000;2.深圳市南山区人民医院中医风湿科,广东深圳㊀518060;3.深圳市罗湖区人民医院风湿免疫科广东深圳㊀518000;4.深圳大学过敏反应与免疫学研究所广东深圳㊀518055)㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨蜂毒肽干预胶原诱导关节炎大鼠模型后对Th17/Treg 平衡调控及关节炎症的影响㊂方法㊀将30组SD 大鼠随机分为正常对照组6只,其余24只SD 大鼠于第1天尾根部注射牛II 胶原,第10天再次注射II 胶原建立胶原诱导关节炎模型,第14天淘汰6只未建模成功的大鼠,筛选出18只建模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组㊁蜂毒肽组㊁甲氨蝶呤组,每组6只㊂第14天蜂毒肽组腹腔注射蜂毒肽(0．5mg /kg,隔日1次),甲氨蝶呤注射组注射甲氨蝶呤(每只1mg,每周1次,共3次),模型组㊁正常组腹腔注射等量灭菌注射用水,第32天麻醉处死后,收集血清,ELISA 法检测血清中TNF-α㊁IL-10㊁IL-17A 浓度,分离大鼠脾脏,提取淋巴细胞,MTS 检测单个核细胞活性,流式细胞术检测Th17㊁Treg 细胞的比例,HE 染色观察踝关节病理变化㊂结果㊀蜂毒肽㊁甲氨喋呤降低血清中TNF-α㊁IL-17A 浓度(P <0．01,P <0．05),升高IL-10浓度(P <0．05);蜂毒肽㊁甲氨喋呤抑制淋巴细胞活性(P <0．05);蜂毒肽㊁甲氨喋呤能下调Th17细胞比例(P <0．05),上调Treg 细胞比例(P <0．01,P <0．05);蜂毒肽㊁甲氨喋呤组减少滑膜增生,抑制炎性细胞浸润,延缓骨和关节软骨破坏㊂结论㊀蜂毒肽能调节胶原诱导关节大鼠模型Th17/Treg 平衡,抑制关节的炎症㊂ʌ关键词ɔ㊀蜂毒肽;Th17;Treg;胶原诱导关节炎;大鼠;炎症ʌ中图分类号ɔR -33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1671-7856(2019)02-0001-06Effects of melittin on Th 17/Treg balance and inflammation inrat model of collagen-induced arthritisTAN Ning 1,2,HE Shoudi 2,GUAN Li 3,YANG Pingchang 4,LIU Zhigang 4,LI Deyu 2∗(1.The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510000,China.2.Traditional Chinese Medicine Department of Rheumatism,Shenzhen Nanshan People s Hospital,Shenzhen 518060.3.Department of Rheumatological Immunology,Luohu District people s Hospital,Shenzhen City,Shenzhen 518060.4.Institute of Allergy and Immunology,Shenzhen University,Shenzhen 518060)㊀㊀ʌAbstract ɔ㊀Objective ㊀To investigate the effects of melittin on Th17/Treg balance and arthritis-associatedinflammation in a rat model of collagen-induced arthritis.Methods ㊀Thirty Sprague Dawley rats were randomly allocated into a normal group,while 24SD rats were injected with bovine collagen II on the 1st day and again on the 10th day toestablish a collagen-induced arthritis model.On the14th day,elimination of6unmodeled rats and18model rats in which the model had been successfully established were selected and divided into a model group,a melittin group,and a methotrexate group by a random number table method.On the same day,the melittin group was injected with melittin(0．5 mg/kg,once every other day),while the methotrexate group was injected with methotrexate(1mg only,once per week, three times).The model group and the normal group were intraperitoneally injected with equal amounts of distilled water; then,on the32nd day,the rats were executed.The concentrations of TNF-α,IL-10,and IL-17A in serum were determined by ELISA.The spleen of each rat was removed,the leukomonocytes were extracted,the activity of leukomonocytes was detected by MTS,and the proportions of Th17and Treg cells were determined by flow cytometry. Pathological changes of the ankle joint were also observed by HE staining.Results㊀Melittin and methotrex significantly decreased the concentrations of TNF-αand IL-17A(P<0．01,P<0．05),increased the concentration of IL-10(P< 0．05),inhibited the activity of leukomonocytes(P<0．05),decreased the proportion of Th17cells(P<0．05),and increased the proportion of Treg cells(P<0．01,P<0．05).In the melittin group and methotrex group,the proliferation of synovial membrane was decreased,which prevented formation of the pannus and delayed the destruction of bone and articular cartilage.Conclusions㊀Melittin can regulate Th17/Treg balance and inhibit joint inflammation in rats with collagen-induced arthritis.ʌKeywordsɔ㊀melittin;Th17;treg;collagen induced arthritis;rats;inflammation㊀㊀类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种引起多关节功能障碍及畸形的自身免疫性疾病[1]㊂虽然RA的发病机制并不完全明确,但目前发现遗传和免疫因素与类风湿关节炎相关㊂RA的病因是多方面的,但主要炎症因子及促炎细胞因子的过度表达是本病大多数病理过程中的重要原因㊂虽然现在公认类风湿关节炎是以Th1细胞介导的炎症性疾病,但研究发现除了Th1细胞,Th17细胞在促进类风湿关节炎的炎症和疾病进展起重要作用㊂Th17细胞产生IL-17诱导关节炎症,同时还能激活核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)促进骨质破坏[2-3]㊂而Th17细胞的活化需要TGF-β㊁IL-10和IL-23等炎症因子的激活㊂研究表明调节性T细胞(Treg细胞)分泌诸如IL-10等免疫抑制性细胞因子,并抑制RA进程中的免疫反应㊂最近有人认为Th17和Treg细胞之间的相互平衡可能是的重要治疗策略[4-5]㊂目前治疗RA的西药有非类固醇抗炎药物㊁改变病情抗风湿药物㊁糖皮质激素以及生物制剂等㊂虽然上述药物对RA有较好的治疗作用,但是副作用大㊁价格昂贵,致使病人的依从性差,临床应用受到很大的限制㊂中医药对于风湿病的治疗有着悠久的历史,蜂毒疗法作为中医药的传统的治疗对RA确实有明显的疗效㊂蜂毒肽(melittin,MT)是蜂毒的主要成分,是蜂毒中具有药理作用和生物活性的主要组分[6]㊂MT具有抗炎㊁降压㊁抗风湿性关节炎及抗肿瘤等多种药理活性㊂本实验通过研究蜂毒肽对胶原诱导关节炎(collagen induce athritis, CIA)模型关节炎症及对Th17/Treg细胞影响,为蜂毒治疗类风湿关节炎提供新的理论依据㊂1㊀材料和方法1．1㊀实验动物SPF级健康SD雌性大鼠30只,体重150~ 170g,购于广东省实验动物中心[SCXK(粤)2014-0035];饲养于深圳大学医学部SPF实验动物中心[SYXK(粤)2014-0140]㊂饲养条件:自由取水和进食,温度20ħ~25ħ,相对湿度40%~50%,照明时间为白天12h和黑夜12h,适应性饲养1周㊂实验动物饲养及实验处理均严格遵循深圳大学实验动物福利与伦理委员会相关指南要求(伦理审查号: 2014-167)㊂1．2㊀主要试剂与仪器蜂毒肽(分子式:Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Thr-Gly-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2,浓度98%,北京中科亚光生物科技有限公司合成);牛II型胶原(批号:C7806,美国Sigma公司);完全弗氏佐剂(批号:F5881,美国sigma公司);不完全弗氏佐剂(批号:F5506,美国sigma公司);Anti-Rat CD4FITC㊁Anti-Rat CD25 APC㊁Anti-Mouse/Rat IL-17A PE㊁Anti-Mouse/Rat Foxp3PE㊁Foxp3/Transcription Factor Staining B㊁Cell Stimulation Cocktail㊁Intracellular Fixation& Permeabilization Buffer㊁Flow Cytometry Staining Buffer (批号分别为:11-0040-82㊁85-17-0390-82㊁12-7177-81㊁85-12-5773-82㊁00-5523-00㊁00-4970-03㊁88-8824-00㊁00-4222-26,美国Ebiosience公司);抗大鼠TNF-α血清ELISA试剂盒(批号: 4AA171420,北京四正柏公司);抗大鼠IL-17A㊁IL-10血清ELISA试剂盒(批号:BMS635㊁BMS629,美国Ebioscience公司),MTS试剂(G1112,美国Promega公司)㊂流式细胞仪RACS CAlibur(美国BD Biosciences公司);全波长酶标仪Multiskar(美国Thermo公司);二氧化碳细胞培养箱INC108(德国Memmert公司)㊂1．3㊀实验方法1．3．1㊀动物模型建立将II型牛胶原溶于0．01mmol/L醋酸,配置成4mg/mL牛II型胶原溶液;再将配置好的牛II型胶原与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀成油包水乳剂用于造模㊂同时另外将配置好的牛II型胶原与等体积的不完全弗氏佐剂充分混匀成油包水乳剂用于激发㊂将30只雌性大鼠分为空白对照组(6只)㊁模型组(24只),第1天在模型组大鼠尾根部1cm皮下注射牛II胶原与弗氏佐剂乳剂每只150μL(含牛II型胶原每只0．3mg),第10天再次注射配置好的II胶原与不完全弗氏佐剂乳剂每只50μL (含牛II型胶原每只0．1mg),建立胶原诱导关节炎模型(collagen-induced arthritis,CIA)㊂正常对照组6只大鼠用同样方法注入等量灭菌注射用水㊂1．3．2㊀药物治疗第14天统计关节肿胀评分,取关节肿胀评分大于4分的大鼠共18只,同评分的动物按随机分配原则分为模型组㊁蜂毒肽组,甲氨蝶呤组,每组各6只㊂蜂毒肽组(0．5mg/kg,溶于灭菌注射用水,腹腔注射,隔日1次),甲氨蝶呤组(每只1mg,溶于灭菌注射用水,腹腔注射,每周1次,共3次),模型组注射等量灭菌注射用水,第32天麻醉处理,心脏穿刺取血,脱颈处死㊂1．3．3㊀标本采集及处理心脏穿刺取血5mL,4ħ静置30min,3500r/min 离心10min,取血清,放置-80ħ冰箱保存,待测;超净工作台中分离出大鼠脾脏,剪少量脾脏组织,放入尼龙网中,加入适量淋巴细胞分离液,充分碾磨脾组织至无块状物,尼龙网过滤,加入1640培养基,放入离心机(20ħ,800r/min)离心30min,吸取淋巴细胞层,培养基洗涤㊂1．3．4㊀大鼠血清TNF-α㊁IL-10㊁IL-17A检测采用ELISA法检测各组大鼠血清血TNF-α㊁IL-10㊁IL-17A的水平,具体操作根据试剂盒说明书进行㊂采用全波长酶标仪(波长为450nm)检测吸光度值(A450值),绘制标准化曲线,计算TNF-α㊁IL-10㊁IL-17A含量㊂1．3．5㊀脾脏淋巴细胞活性检测取分离好的脾脏淋巴细胞,以200μL细胞悬液(细胞数约2ˑ105个)加入96孔板中;细胞培养箱孵育过夜后,加入20μg/mL的collagen100μL,培养3d后,加入20μL的MTS试剂,培养4h后,采用全波长酶标仪(波长为450nm)检测吸光度值(A450值)㊂1．3．6㊀Th17㊁Treg细胞检测(1)Th17细胞检测:取分离好的脾脏淋巴细胞,稀释至1ˑ108/mL,加入培养板中,加入2μL cell stimulation cocktail,孵育16h㊂1400r/min离心5min,加入2mL培养基,取100μL加入流式上样管,加入anti-rat-CD4-APC,4ħ孵育30min㊂离心5min,去上清,加入1mL IC Fixation Buffer,室温孵育20min,离心5min,去上清,洗涤两次㊂再次加入1mL IC Fixation Buffer,避光4ħ孵育20min,加入2mL Permeabilization Buffer后,离心10min,弃上清;100μL破膜缓冲液重悬细胞,室温孵育15min,离心5min,加入anti-rat-IL-17A-PE㊂4ħ避光孵育30min;1mL Permeabilization Buffer混匀后,离心5 min,去上清,加入1mL流式细胞缓冲液重悬细胞㊂并上机检测并分析,应用Flowjo7．61分析数据㊂(2)Treg细胞检测:取分离好的脾脏淋巴细胞,稀释至1ˑ108/mL,取100μL加入流式上样管,依次加入anti-rat-CD4-FITC和anti-rat-CD25-APC(说明书剂量),避光4ħ孵育30min㊂Flow Cytometry Staining Buffer1mL洗涤后,1400r/min离心5min,弃上清,加入1mL的Intracellular Fixation& Permeabilization Buffer,混匀避光4ħ孵育30min, Flow Cytometry Staining Buffer1mL洗涤;加入1mL 的固定/破膜工作液,避光4ħ孵育20min㊂加入2mL Permeabilization Buffer后,离心10min,弃上清㊂重悬细胞,加入anti-rat-Foxp3-PE,避光4ħ孵育40min㊂加入2mL Permeabilization Buffer,离心10min,弃上清,流式缓冲液重悬细胞,并上机检测并分析,应用Flowjo7．6．1分析流式数据㊂1．3．7㊀踝关节HE染色取大鼠双踝关节,剔除皮肤和脂肪,固定24h,放入10%EDTA-2Na脱钙,隔日1次换液,60d后分离踝关节;分别脱水,包埋,HE染色,光镜下观察踝关节病理组织变化㊂1．4㊀统计学方法所有数据均采用SPSS17．0软件进行统计学处理,所得结果以平均数ʃ标准差(ʏxʃs)表示㊂资料满足正态性㊁方差齐性的多组定量资料比较采用方差分析,不满足正态性或方差不齐的多组定量资料比较采用非参数检验㊂以P<0．05为差异有统计学意义㊂2㊀结果2．1㊀大鼠血清TNF-α㊁IL-10㊁IL-17A浓度通过ELISA检测血清中特异性TNF-α㊁IL-10㊁IL-17的浓度,与正常组比较,模型组中TNF-α㊁IL-10㊁IL-17A水平高于正常组(P<0．01,P<0．05,P< 0．05);与模型组比较,蜂毒肽组㊁甲氨蝶呤组TNF-α㊁IL-17A低于模型组(P<0．01,P<0．05);与模型组比较,蜂毒肽组㊁甲氨蝶呤组IL-10高于模型组(P <0．05)㊂(表1)2．2㊀脾脏淋巴细胞活性检测通过MTS法检测脾脏淋巴细胞活性,与正常组比较,模型组单个核细胞活性高于正常组(P< 0．01);与模型组比较,蜂毒肽组㊁甲氨蝶呤组单个核细胞活性低于模型组(P<0．05)㊂(图1)2．3㊀大鼠脾细胞Th17㊁Treg细胞比较通过流式细胞术检测脾细胞Th17㊁Treg细胞比例,与正常组比较,模型组Th17细胞比例高于正常组(P<0．01);与模型组比较,蜂毒肽组㊁甲氨蝶呤组Th17细胞比例低于模型组(P<0．05);与模型组比较,蜂毒肽组㊁甲氨蝶呤组Treg细胞比例高于模型组(P<0．01,P<0．05)(图2)㊂2．4㊀大鼠踝关节HE染色通过HE染色,显微镜下观察踝关节病理变化:正常组:可见关节结构完整,单层滑膜组织,无炎性细胞浸润,无滑膜增生和血管翳形成,无骨和软骨破坏;模型组:可见关节结构不完整,大量滑膜组织表1㊀大鼠血清TNF-α㊁IL-10㊁IL-17A浓度水平的比较(ʏxʃs,n=6)Table1㊀Comparison of the serum levels of TNF-α,IL-10,and IL-17A in rat serum组别Groups TNF-α(pg/mL)IL-10(pg/mL)IL-17A(pg/mL)正常组Normal group156ʃ4．635ʃ2．162ʃ9．2模型组Model group673ʃ10．3∗∗93ʃ4．7∗178ʃ8．2∗蜂毒肽组Melittin group356ʃ21##145ʃ5．7#143ʃ7．6#甲氨蝶呤组Methotrexate group301ʃ14．3##135ʃ4．6#123ʃ5．2#注:与正常组比较,∗P<0．05,∗∗P<0．01;与模型组比较,#P<0．05,##P<0．01㊂pared with the normal group,∗P<0．05,∗∗P<0．pared with the model group,#P<0．05,##P<0．01.注:㊀与正常组比较,∗∗P<0．01;与模型组比较,#P<0．05㊂图1㊀脾脏淋巴细胞活性检测pared with the normal group,∗∗P<0．pared with the model group,#P<0．05.Figure1㊀Detection of the splenic lymphocyte activity 增生,大量炎性细胞浸润,明显的骨和关节软骨破坏㊂蜂毒肽组:可见关节结构不完整,部分的滑膜组织增生及炎症细胞浸润,部分骨和关节软骨破坏㊂甲氨蝶呤组:可见关节结构完整,部分滑膜组织增生,少量炎性细胞浸润,无明显的血管翳㊁骨和关节软骨破坏㊂(图3)3㊀讨论RA是一种以周围关节炎为特征的自身免疫性疾病㊂胶原诱导关节炎模型是最常的类风湿关节炎研究的动物模型[6]㊂目前RA的病因和发病机制尚未完全明确,蜂毒肽是蜂毒的主要成分,蜂毒肽具有抗炎作用,但对其免疫调节的作用研究知之甚注:与正常组比较,∗∗P <0．01;与模型组比较,#P <0．05;与模型组比较,##P <0．01㊂图2㊀大鼠脾细胞Th17㊁Treg 细胞检测pared with the normal group,∗∗P <0．pared with the model group,#P <0．05.Compared with the model group,##P <0．01.Figure 2㊀Detection of Th17/Treg cells among rat spleencells图3㊀大鼠踝关节病理检测(HE 染色,ˑ4)Figure 3㊀Pathological changes of the rat qnkle joints(HE staining)少㊂本研究表明蜂毒肽能抑制胶原诱导关节炎大鼠模型的脾脏淋巴细胞活性,说明蜂毒肽具有抑制免疫作用㊂目前Th17/Treg 细胞平衡成为自身免疫性疾病的研究热点㊂研究表明类风湿关节炎中如TNF-α㊁IL-10等炎症介质,激活T 细胞分化,促进Th1㊁TH17和Treg 细胞等T 淋巴细胞参与关节炎症的发病机制[7]㊂Th17细胞分泌的IL-17与其他炎症因子促进关节的炎症,并且抑制Treg 细胞分化㊂而Treg 细胞产生IL-10,能够限制炎症反应引起的组织损伤[8-9]㊂IL-10缺乏能够刺激Th1和Th17细胞分化,抑制Treg 细胞分化,导致RA 疾病的发生[10]㊂因此,Th17/Treg平衡,包括Th17细胞分泌的促炎症因子和Treg细胞分泌的细胞因子,在类风湿关节炎疾病等自身免疫性疾病中起着非常重要的作用㊂既往的研究表明在类风湿关节炎中Th17细胞明显增加,而Treg细胞则显著减少[11],本研究证实模型组大鼠脾脏淋巴细胞中Treg细胞的的表达下降, Th17细胞的表达水平升高㊂在本研究中,发现蜂毒肽提高了IL-10水平,并在体内增加了Treg细胞的分化,这些结果表明,蜂毒肽通过促进IL-10的表达和促进Treg细胞的分化而减弱CIA的炎症㊂同时发现治疗后IL-17A㊁TNF-α浓度降低,在CIA模型中Th17细胞比例减少,说明蜂毒肽能通过降低Th17细胞比例,减少CIA模型炎症㊂传统的治疗RA的经典药物是甲氨蝶呤等免疫抑制剂㊂该研究表明甲氨蝶呤也能调节Th17/Treg细胞的失衡㊂类风湿关节炎的病理机制主要是滑膜增生,形成血管炎,导致软骨破坏及骨侵蚀㊂本研究通过观察踝关节病理切片,发现蜂毒肽能抑制滑膜增生,本研究发现蜂毒肽能抑制关节炎模型血清炎症因子表达,说明蜂毒肽可能通过抑制炎症因子改善关节症状㊂同时发现,蜂毒肽组踝关节的软骨破坏及骨质侵蚀减少,而类风湿关节炎中,骨质破坏与RANKL通路及基质金属蛋白酶表达有关[12],本课题组推测蜂毒肽可能通过抑制RANKL通路等抑制骨质破坏,这也是下一步将继续探究的方向㊂综上所述,蜂毒肽抑制胶原诱导关节模型炎症因子的表达,抑制关节滑膜增生及延缓骨质破坏,同时能上调Treg细胞㊁降低Th17细胞起到抑制免疫作用㊂因此,本研究提示蜂毒肽可能通过调节Th17/Treg细胞平衡来治疗RA㊂参考文献:[1]㊀Gulati M,Farah Z,Mouyis M.Clinical features of rheumatoidarthritis[J].Medicine,2018,46(4):211-215. [2]㊀De Souza TR,De ATCA,DuarteÂP,et al.Th1and Th2polymorphisms in Sjögren s syndrome and rheumatoid arthritis[J].Oral Pathol Med,2014,43(6):418-426.[3]㊀Van Hambarg JP,Tas SW.Molecular mechanisms underpinningT helper17cell heterogeneity and functions in rheumatoidarthritis.[J].J Autoimmun,2017,87:69-81.[4]㊀van den Berg WB,Mcinnes IB.Th17cells and IL-17a-focus onimmunopathogenesis and immunotherapeutics[J].Semin ArthritisRheum,2013,43(2):158-170.[5]㊀Liu KS,Fan XQ,Zhang L,et al.Effects of recombinant humaninterleukin-10on Treg cells,IL-10and TGF-βin transplantationof rabbit skin[J].Mol Med Rep,2014,9(2):639-644. [6]㊀施佳君,陈方明,马全鑫,等.胶原诱导Wistar和Lewis大鼠类风湿关节炎模型病理特点的比较[J].中国比较医学杂志,2018,28(04):19-26+37.[7]㊀Kelepouri D,Mavropoulos A,Bogdanos DP,et al.The role offlavonoids in inhibiting Th17responses in inflammatory arthritis.[J].J Immunol Res,2018,2018(13):1-11.[8]㊀Isailovic N,Daigo K,Mantovani A,et al.Interleukin-17andinnate immunity in infections and chronic inflammation[J].JAutoimmun,2015,60:1-11.[9]㊀Liu B,Tonkonogy SL,Sartor RB.Antigen-presenting cellproduction of IL-10inhibits T-helper1and17cell responses andsuppresses colitis in mice.[J].Gastroenterology,2011,141(2):653-662.e4.[10]㊀Chaudhry A,Samstein R,Treuting P,et al.Interleukin-10signaling in regulatory T cells is required for suppression of Th17cell-mediated inflammation[J].Immunity,2011,34(4):460-462.[11]㊀Niu Q,Cai B,Huang ZC,et al.Disturbed Th17/Treg balance inpatients with rheumatoid arthritis[J].Rheumatol Int,2012,32(9):2731-2736.[12]㊀Tanaka Y,Ohira T.Mechanisms and therapeutic targets for bonedamage in rheumatoid arthritis,in particular the RANK-RANKLsystem[J].Curr Opin Pharmacol,2018,40:110-119.收稿日期 2018-07-24。
风湿康对佐剂性关节炎大鼠滑膜IL-1β、IL-6、IL-10的影响
骨侵蚀情况 。分离后肢膝 关节 ， 用手术刀取 出滑膜组织 ， 电
子天平称重 ， １Ｉ 按 ０ｒ 培重量 ：．ｍ 匀浆介质 ， ０５ ｌ 冰浴下眼科剪碎 剪后用匀浆器做 成 滑膜 匀浆 ， ℃冰箱过 夜 ， ４ 低温离 心 取上
［］ １
。
风湿康是南方医院中医科协定方 ， 在临床用 于治疗湿
热痹阻型 Ｒ Ａ等风湿 疾病有较 好 的疗效 。本文 对风 湿康对 从 大 鼠的防治作用进行 了实验研 究 ， 为其 临床进 一步开发
和应用提供药理学参考。
１ 实 验 材 料
清 ，ＩＳ Ｅ ．Ａ法检测滑膜 几一１、Ｌ 、Ｌ—ｌ Ｉ ８ Ｉ 一６ Ｉ ０的水平 ， 严格 按
试剂盒说明书操作 。 ２３ 统计学处理 ． 实验 数据 以均数 ±标准差 （ ±ｓ 表示 ， ）
１１ 动物 ．
ＳＦ 雄性 ｓ Ｐ级 Ｄ大 鼠， 体重 １０—１０ ， 自南方 ５ ７ｇ 购
ｂｃ ｒ ｍ ｔｂｒｕ ￣ ３Ｒ ， ｔ） 美 国 Ｄｆ ａｏ ｔ ｅ ａｔｉ ａபைடு நூலகம்ｃｌ ｉ Ｈ ７ ａ Ｍ ｂ ： ｅｕ ｕ ｅｓ ｉｏＬｂｒ ｏ ｓ提 ｃ ａｒ ｉ
３ １ 各组大鼠踝关节病理 学改 变 模 型组 ： 鼠踝关 节滑 ． 大 膜细胞 重度到极重度增生 ， 呈短绒毛状 或指 突状伸入关节腔 内， 滑膜下可见大量 淋 巴细胞 、 单核细胞及 少数散在 分布的
（ 南方 医科 大学中医药学院・ 广州 ５０ １） １５５
摘
一
要 目的 ： 观察风 湿康对佐剂性关节炎模型 大鼠关节病理损伤 的防治作 用及 对 关书滑膜 几一１、Ｌ ８ Ｉ
６ Ｉ 一１ 、Ｌ ０水平的影响 。方 法： 用热杀死结核分枝杆 菌免疫 ｓ 采 Ｄ大鼠诱 导的佐剂性 关节炎模型 ， 观察 风
天星健骨方对佐剂性关节炎大鼠血清白介素-1和肿瘤坏死因子-α的影响
天星健骨方对佐剂性关节炎大鼠血清白介素-1和肿瘤坏死因子-α的影响杨晓军;苗文丽;裴林;于素静;郑惠军【摘要】目的:观察天星健骨方对佐剂性关节炎大鼠血清IL-1、TNF-a的影响.方法:采用注射弗氏完全佐剂制作类风湿关节炎模型大鼠模型,足容积法测量继发侧足肿胀度;双抗体夹心ELISA法检测IL-1、TNF-a.结果:中药中高量组足肿胀度与模型组比较均有下降(P ＜0.01,P＜0.05),且IL-1、TNF-a水平显著降低(P＜0.05).结论:天星健骨方对佐剂性关节炎大鼠关节炎症状具有一定抑制作用,其作用机制可能是通过降低大鼠血清中的IL-1、TNF-a含量发挥作用.【期刊名称】《中国中医基础医学杂志》【年(卷),期】2013(019)011【总页数】3页(P1284-1285,1294)【关键词】天星健骨方;佐剂性关节炎;IL-1;TNF-a【作者】杨晓军;苗文丽;裴林;于素静;郑惠军【作者单位】河北省中医药研究院,石家庄 050031;河北省中医药研究院,石家庄050031;河北省中医药研究院,石家庄 050031;唐山市第四医院,河北唐山 063000;唐山市卫生监督所,河北唐山 063000【正文语种】中文【中图分类】R285.5类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病，是临床常见多发病，发病机理尚未完全明确，亦缺乏根治及预防本病的措施。
近年来发现，免疫调节功能紊乱在RA的发病、病理改变中起主导作用，其中细胞因子的大量释放在介导AR炎症组织损伤中起关键作用［1］。
本室从事风湿免疫性疾病研究多年，有着丰富的临床经验，在中医理论指导下，采用天星健骨方在控制活动期RA中发挥其独特的功效。
本研究以细胞因子为切入点，通过天星健骨方对佐剂性关节炎大鼠血清IL-1、TNF-a影响的研究，以探讨中医药起效的主要作用机制。
1 材料与仪器1.1 实验动物SD清洁级雌性大鼠60只，体质量120±10 g，由河北医科大学实验动物中心提供(合格证编号DK0411-0005)。
红霉素对佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6表达的影响
红霉素对佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6表达的影响孙雪茜;苏连明【期刊名称】《牡丹江医学院学报》【年(卷),期】2009(030)003【摘要】目的:研究红霉素对佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6表达的影响,以探讨红霉素对佐剂性关节炎的治疗作用.方法:通过给大鼠右后足跖部皮下注射完全弗氏佐剂(CFA)建立类风湿性关节炎的动物模型(AA).在致炎后第14d,大鼠继发性关节炎出现.开始在治疗组AA大鼠腹腔注射红霉素注射液50mg/kg,连续7d,直至第28d处死全部大鼠,断头取血后用放免法测大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6的表达水平.结果:治疗组大鼠血清中的TNF-α、IL-1、IL-6水平均低于模型组,红霉素对佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6表达均成抑制作用.结论:红霉素可降低佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6的表达,对类风湿性关节炎的治疗具有一定的作用.【总页数】3页(P4-6)【作者】孙雪茜;苏连明【作者单位】佳木斯大学,黑龙江,佳木斯,154007;牡丹江医学院附属红旗医院,黑龙江,牡丹江,157011【正文语种】中文【中图分类】R58【相关文献】1.丹参酮Ⅱa对佐剂性关节炎大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平及滑膜MMP3/TIMP1表达的影响 [J], 杨东威;孟彪;高立珍;王熙;赵和平2.伸筋草正丁醇提取物对佐剂性关节炎大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的影响 [J], 敖鹏;刘玉婕;尹丽颖;边晓燕3.伸筋草氯仿提取物对佐剂性关节炎大鼠血清RF、TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响 [J], 敖鹏;周忠光;韩玉生;尹丽颖;边晓燕4.复方甘草酸苷对佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1和IL-6表达水平的影响[J], 孙晓鹏;史然然;袁学强5.红霉素对佐剂性关节炎大鼠血清中IL-1、IL-4及IL-8水平表达的影响 [J], 孙晓鹏;王建峰;孙雪茜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
川芎嗪对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞TNF-α表达影响的实验研究
川芎嗪对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞TNF-α表达影响的实验研究张涛;柳朝阳;张鹏霞;荣光影;商宇;王茉琳;王小灵【期刊名称】《中国老年学杂志》【年(卷),期】2009(29)6【摘要】目的研究川芎嗪对佐剂性关节炎(AA)大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响.方法采用大鼠足跖注射Freundi′s完全佐剂形成AA,观察川芎嗪对模型大鼠滑膜细胞TNF-α mRNA表达的变化.结果川芎嗪抑制滑膜细胞TNF-α表达.结论川芎嗪通过降低TNF-α的表达起到抗RA的作用.【总页数】2页(P659-660)【作者】张涛;柳朝阳;张鹏霞;荣光影;商宇;王茉琳;王小灵【作者单位】佳木斯大学儿童神经康复实验室;佳木斯大学第一附属医院神经三科;佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007;佳木斯大学医政管理处;佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007;佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007;佳木斯大学基础医学院,黑龙江,佳木斯,154007【正文语种】中文【中图分类】R-692.39【相关文献】1.白虎追风丸对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞分泌TNF-α的影响 [J], 施旭光;张声鹏;徐志东2.羧胺三唑对TNF-α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞中细胞因子分泌和NF-κB活化的影响 [J], 朱蕾;李娟;武丹威;罗丽丰;郭磊;于晓丽;叶菜英;张德昌3.曲克芦丁对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞分泌PGE2、IL-1β和TNF-α水平的影响[J], 邹薇;徐红梅4.通痹灵对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达的影响 [J], 陈纪藩;沈晓燕;赵会芳;李迎敏;李颂华;廖世煌;黄仰模;奥西秀树;邱联群;关彤;方永奇;刘晓玲5.通痹灵对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞产生IL-1、TNF-α及PGE_2的影响 [J], 陈纪藩;赵会芳;沈晓燕;李颂华;李迎敏;廖世煌;黄仰模因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苗药四大血减轻大鼠的类风湿性关节炎：基于下调基质金属蛋白表达
The Miao medicine Sidaxue alleviates rheumatoid arthritis in rats possibly by downregulating matrix metalloproteinasesLI Yunfei,YANG Jingyi,ZHANG Ying,ZHANG Caixia,WEI Yuxiang,WANG Yiying,WU Ning,SUN Jianfei,WU Zunqiu Laboratory of Chemistry and Biochemistry,School of Basic Medical Sciences,Guizhou Medical University,Guiyang 561113,China摘要：目的探究贵州苗医验方“四大血”（SX ）对胶原诱导型关节炎（CIA ）大鼠关节骨、软骨破坏及滑膜血管新生的作用机制。
方法将42只SD 大鼠均分为空白组（Nor ）、模型组（Mod ）、雷公藤多苷片阳性对照组（GTW ，40g/kg ）和SX 高、中、低剂量组（SX 40、20、10g/kg ），7只/组。
通过皮下注射牛型II 胶原来建立CIA 大鼠模型，并且通过每天经口灌胃的方式给予治疗，持续3周。
采用AI 评分分别于造模前，灌胃前1周，灌胃后1周，灌胃2周，灌胃3周观察大鼠后足关节病变情况。
HE 染色法观察大鼠关节滑膜病理变化，ELISA 法检测TNF-α、IL-1β，Real-time PCR 检测滑膜组织中NF-κB p65、MMP1、MMP2、MMP9mRNA 表达水平，Western blot 检测滑膜组织中NF-κB p65、基质金属蛋白1（MMP1）、MMP2、MMP9蛋白表达水平。
网络药理学获取SX 外用途径治疗类风湿性关节炎（RA ）中的重要靶蛋白，经拓扑分析后筛选出核心靶蛋白。
结果GTW 组和SX 高、中、低剂量组足跖肿胀度及关节炎指数评分均小于Mod 组（P <0.05）。
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目的:检测IL-1B、IL-6在类风湿性关节炎(RA)的表达，探讨蜂针治疗RA的作用机理。方法:
将40只大鼠随机分为四组，采用PCR微板核酸杂交-ELISA方法检测滑膜IL-1B、IL-6的mRNA
表达水平。结果:蜂针组和激素组IL-1B、IL-6的mRNA表达水平无显著性差异，而与模型组
比较有显著性差异。结论:RA早期IL-1B、IL-6的mRNA表达水平是上调的，蜂针治疗后可以
抑制其转录和表达，有利于RA病情的缓解。
关键词 蜂毒疗法 类风湿 IL-1BmRNA IL-6mRNA 基因表达
类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫
性疾病，其病理特征是滑膜慢性炎症。其关节损伤的病理过程与细胞因子网络失调密切相关，
其中白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)异常表达和失调可
能是其发病的重要因素。本文采用PCR微板核酸杂交-ELISA方法[1，2]，观察蜂针对RAIL-1B、
IL-6mRNA表达的影响。
1材料与方法
1.1动物处理及分组40只Wistar大鼠，雌雄各半，由中山医科大学提供。体重200+20g观
察2天无异常，随机分为四组，每组10只。参照文献[3]，模型组:大鼠右后足趾皮内注射
Freund氏完全佐剂0105mL致炎;激素组:造模后每只每日经腹腔注射012mL醋酸氢化可的松
注射液(10mg/2mL);蜂针组:造模后蜂针治疗每日1次，每次治疗取一个穴位;正常组:不造模。
全部标本均为各组治疗21天后采取，经眼眶静脉取血后处死，切开每只大鼠右膝关节囊，
切取关节滑膜组织10mg，标本处理见以下所述。
1.2蜂针组选穴及治疗方法
选取“肾俞”、“足三里”、“命门”、“大椎”。取穴根据有关文献[4]并参照人体有关穴位，以
动物比较学方法定位。以75%的酒精消毒所取的穴位，用镊子轻轻捏住蜜蜂的腰部，将其尾
部对准穴位，让其自然螯入穴位后并留针10min，待毒囊中的毒液全部排入后，将毒刺拔除，
每只大鼠只螯一个穴位，以上穴位轮流交替使用。
1.3试剂和仪器
PCR微板核酸杂交-ELISA试剂盒由第一军医大学生物学诊断研究中心提供;PCR仪为上海复华
公司产品;550型酶标仪为BIO-RAD公司产品;生物素、底物、Taq酶、dNTP、Ficoll400、辣根
过氧化物酶(HRP)分别购自宝灵曼公司、华美公司和化粤公司。
1.4杂交液主要配方
20ˣSSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸三钠)、硫酸葡聚糖(PEG)、去离子甲酰胺、十二烷基硫
酸钠(SDS)等;杂交洗液:1ˣSSC;封闭剂:1%Ficoll400，0.5%HS-DNA、0.5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、
1%BSA、脱脂奶粉、甘氨酸。上述溶液均由第一军医大学生物医学诊断研究中心提供。
1.5引物与探针采用
Primer软件设计引物，选用IL-1B、IL-6的特异性序列作为引物与探针，由上海生物工程公司
合成。
1.6总RNA提取
大鼠眼眶静脉取血后，即用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞，按Promega公司提供
的试剂盒说明书操作，得到RNA沉淀，用无RNase的水溶解，紫外分光光度计A260/A280nm
测定总RNA浓度和纯度，大于1.8表明纯度较好。经1%琼脂糖电泳凝胶鉴定，28S及18S
条带清晰，所获RNA具有较好完整性。于-70度保存。
1.7探针包被与封闭
在37度下，用碳酸盐缓冲液(pH9.6)在微板上包被14hr，用封闭剂封闭微板孔非特异性结合
位点。
1.8标本处理
取滑膜组织标本用剪刀剪碎于离心管内，加2~3倍体积的处理液(由第一军医大学诊断研究
中心研制提供)，在65度下不时振摇30~40min，然后在100度的环境下于12000rpm离心
5min，取上清液作为模板液。
1.9基因扩增
于反应管内加入模板液4uL及反应液9uL，加反转录液9uLL，55度反应50sec，取3uL含有
正义引物1、反义引物1、dNTP、Taq酶等的反应液及1B100倍比稀释液各4LL，5种浓度加
入大反应管内，弹匀，上机，预变性94e50sec，循环条件:94度50sec，53度50sec，72度
60sec，共循环38次，最后72度延伸3min，再取其扩增产物3uL，加入含有正义引物2、
反义引物2等的反应液内，弹匀，上机，预变性94度2min，循环条件:94度50sec，53度
50sec，72度65sec，共循环38次，最后72度延伸3min。取最后扩增产物变性:100度水浴
10min，冰浴10min，成为变性产物。
1．10微板夹心杂交与显色
取变性产物20uL、杂交液90uL、显色探针25uL，轻轻摇匀，50度杂交60min，甩净。于每
孔中加入杂交洗液200uL，置室温3~5min，甩净，再重复2次。然后在每孔中加入[wxk1]
辣根过氧化物酶100LL，37e30min后，甩净，每孔加入洗液200LL，置室温5~10min，再重
复2次，每孔加入底物TMB液1滴，终止反应，并在酶标仪450nm波长测OD值。
1.11统计学处理
实验结果用均数+标准差表示，采用t检验，SPSS软件包处理。
2结果
2.1扩增片段长度以提取的RNA作为逆转录反应的模板，IL-1B、IL-6mRNA最终扩增出的片
段分别长为190bp和245bp，与设计的IL-1B、IL-6mRNA扩增片段长190bp[wxk2]和245bp
相一致。见图1。
2.2蜂针对滑膜IL-1B、IL-6mRNA水平的影响蜂针组能显著地抑制滑膜IL-1B、IL-6的基因表
达，其结果与激素组无明显的差异。见表2。图1IL-1B、IL-6扩增片段长度
表2蜂针对佐剂性关节炎大鼠IL-1B、IL-6mRNA相对表达量的影响
3讨论
本研究表明，滑膜中IL-1BmRNA、IL-6mRNA的基因表达在RA病理模型中是上调的，提示
RA早期不仅存在IL-1B、IL-6转录增强，对IL-1B、IL-6反应的敏感性亦可能增强，且与炎症
程度相关，IL-1BmRNA、IL-6mRNA的表达水平具有协同性，这进一步支持了IL-1B、IL-6在炎
症部位具有相互促进作用的论断，这可能是RA发病的机制之一。在RA关节腔损伤机理中，
IL-1的局部生物效应发挥最为充分[4]。在RA早期病程中，IL-1可以扩大内皮细胞中粘连分
子的表达;诱导中性细胞、单核细胞和淋巴细胞的趋化，通过诱导IL-6的合成参与免疫调节
过程[5]，刺激成纤维样细胞的增生;IL-1尚可进一步通过滑膜成纤维细胞及关节软骨中的软
骨细胞诱导PGE2及胶原酶的产生，增强破骨细胞活性，促进骨的重吸收，造成关节软骨和
骨破坏，且IL-1可对软骨和滑膜细胞造成直接损伤，使RA病变向中、晚期发展。
IL-6是免疫反应中的四大炎症介质之一[6]，RA患者的炎性滑膜可释放一些细胞因子，这些
细胞因子可刺激破骨细胞释放一些酸性蛋白水解酶，从而导致骨吸收和软骨钙化增加[7]。
IL-6异常表达和失调是RA的典型特征，关节组织中IL-6主要由滑膜细胞产生，有研究表明，
RA早期患者滑膜内检测到的IL-6的水平显著增高，其含量是患者血清内的280倍，提示IL-6
主要在局部病灶内产生[8]。IL-6可刺激B细胞合成自身抗体，促进类风湿及其他细胞因子的
产生[9]，从而加剧炎症过程，加重关节病变。
蜂毒具有多种药理作用，直接或间接地抗炎止痛、调节免疫机能，并有类激素样的作用。蜂
针具有蜂毒和针灸的双重作用，可以活血化瘀、消肿止痛、通经活络、祛风散寒。本研究说
明，用蜂针治疗RA后可以使IL-1B、IL-6的转录和表达受到抑制，使IL-1B、IL-6的基因表达
下调，这对抑制RA滑膜炎症以及阻断关节软骨基质的降解和破坏是十分有利的，能起到保
护关节软骨细胞的作用。其疗效与激素治疗没有显著性的差异。