体外培养成骨细胞成纤维生长因子23表达及其对激素的反应
FGF21在营养代谢中的作用
FG F家族包含23个结构相似的蛋白质,并根据种系发生相似性分为7个亚家族,在发育、器官发生、细胞生长、分化和新陈代谢等方面发挥多种作用。
除FG F11亚蛋白外,其它FG F蛋白分别命名为胞内或核FG Fs,作为自分泌、旁分泌或内分泌因子以及与成纤维生长因子酪氨酸激酶受体(f i br ob-l as t gr owt h f act or t yr os i ne ki nase r ecept or,FG FR)的结合信号发挥作用,FG FR s分为7种亚型:1b、1c、2b、2c、3b、3c和4,分别由4种基因编码而成。
1内分泌FG FsFG Fs亚家族FG F19是一种内分泌FG Fs(en-docr i ne FG Fs,eFG Fs),具有非典型结构,缺乏胞外肝素结合区域,与肝素结合的亲和力较低,因此FG F19并不能保留于细胞外基质中,而是随体循环发挥作用。
eFG Fs需要FG FR(FG FR1c、2c、3c或4)与共受体形成的二聚体结合后才能激活其信号转导通路,共受体是kl ot ho蛋白(抗衰老蛋白),FG F23需要αkl ot ho,FG F19和21需要β-kl ot ho(K LB), FG FR-K LB二聚体受体下游是胞内级联反应,包括FG FR底物2α的磷酸化和R as-M A PK s和PI3-A kt 激酶的激活。
eFG Fs在维持代谢平衡中发挥重要作用,FG F23参与骨与肾、肠和甲状旁腺的内在联系,从而维持体内矿物质、VD3平衡及骨的健康,FG F21还可以通过调控葡萄糖和脂肪代谢参与维持体重和代谢平衡。
2FG F21与代谢平衡FG F21在脂肪和碳水化合物代谢中发挥有益作用,于2000年被N i s hi m ur a团队首次作为肥胖症和肥胖症相关代谢紊乱疾病的治疗靶点报道,之后FG F21同型物或激活剂被报道可提高胰岛素敏感性、改善肝功能,可作为抗肥胖和抗糖尿病药物。
碱性成纤维细胞生长因子
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）神经再生1975年Gospodarowicz首先报道运用理化方法从牛的大脑和垂体中分离纯化出碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）。
80年代，bFGF的氨基酸序列得到澄清。
90年代，国内外相继运用基因工程方法成功获得重组bFGF，有力推动了关于bFGF的研究。
系列研究证实，bFGF能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞分化增殖，在胚胎发育、组织愈合中起重要作用。
神经方面，关于bFGF的研究集中在中枢神经，发现其神经活性广泛，能保护神经元，促进突起增生，提示在周围神经再生方面的研究意义。
现参考近年来bFGF与神经再生的相关文献作一综述。
一、内源性bFGF正常情况下的表达和神经损伤后的变化(一)中枢神经：正常情况下，内源性bFGF以微量分布于脑、垂体和下丘脑等器官，已证实星形胶质细胞、垂体滤泡及部分神经细胞能分泌bFGF，在海马皮质、中脑、纹状体和小脑颗粒细胞均有其受体。
神经损伤后，早期就能观察到内源性bFGF表达增多，是神经损伤后早期反应之一。
叶诸榕用原代培养的大鼠大脑星形胶质细胞作成机械损伤模型，观察发现bFGF在损伤后2小时开始表达，12小时达高峰，2天后开始回落，星形胶质细胞胞体肥大，突起粗大。
崔建忠运用Northern杂交、组织学方法动态观察大鼠颅脑弥漫性损伤后bFGF的基因表达和组织学改变，结果发现轻度损伤后12小时，重度损伤后4小时，bFGF基因表达增加，均于第3天达到高峰。
Grothe〔1〕研究脊髓神经节bFGF及其Ⅰ型受体（FGFR-1)的表达时发现，正常情况下，bFGF和FGFR-1的mRNA在脊神经节均有表达，原位杂交显示星形胶质细胞产生bFGF，而感觉神经元表达FGFR-1，提示旁分泌作用；坐骨神经损伤后，L4～6感觉神经元bFGF的表达在1天内即上调，7天达高峰，28天后恢复，FGFR-1的变化则不明显。
骨髓间充质干细胞 骨形成标志物
骨髓间充质干细胞骨形成标志物骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的干细胞，在体内广泛存在于骨髓、脂肪组织、胎盘等多个组织中。
它们不仅可以分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等成骨细胞，还具有抗炎、免疫调节、创伤修复等多种生物学功能。
因此，MSCs在组织工程、再生医学和临床治疗等领域具有广阔的应用前景。
骨形成标志物是用来评估骨形成过程中相关细胞活性和功能的指标。
常用的骨形成标志物有碱性磷酸酶（ALP）、骨骼特异性碱性磷酸酶（BALP）、骨钙素（OCN）、骨形态发生蛋白（BMP）等。
这些标志物的表达水平可以反映骨细胞的分化和骨形成的程度。
研究表明，MSCs具有较高的骨形成潜能。
在适当的诱导条件下，MSCs可以分化为成骨细胞，并表达一系列骨形成标志物。
碱性磷酸酶是成骨细胞常见的表面标志物，其在骨细胞分化过程中起到重要的催化作用。
BALP是碱性磷酸酶的骨骼特异性亚型，其表达水平可以直接反映成骨细胞的分化程度。
OCN是一种由成骨细胞合成和分泌的蛋白质，是成骨细胞功能活性的重要指标。
BMP是促进骨细胞分化和骨形成的重要因子，在MSCs向骨细胞分化过程中起到关键的调控作用。
研究发现，MSCs在体外培养条件下，通过特定的生长因子和细胞因子的刺激，可以诱导其向成骨细胞分化，并表达骨形成标志物。
例如，将MSCs培养在含有骨形成相关因子（如BMP-2、BMP-7等）的培养基中，可以明显促进MSCs向成骨细胞分化，并增强其表达骨形成标志物的能力。
MSCs还具有抗炎和免疫调节的功能。
炎症反应是骨损伤和骨疾病发生发展的重要环节，而MSCs可以通过抑制炎症因子的产生和调节免疫细胞的活性，减轻炎症反应，促进骨修复和再生。
研究表明，MSCs分泌的细胞因子能够抑制炎症介质的产生和释放，减轻炎症反应，促进受损组织的修复。
同时，MSCs还可以调节免疫细胞的活性，抑制免疫反应的过度，减少免疫介导的骨破坏，并促进骨形成。
成骨生长肽促成骨作用的研究进展
成骨生长肽促成骨作用的研究进展陈晓;罗贝尔;苏佳灿【摘要】成骨生长肽(OGP)具有促成骨作用,具有较大的潜在临床应用价值,是国内外研究的热点.动物体内实验和体外细胞实验表明,OGP能促进骨密度增加,加速骨折愈合,促进体外培养大鼠成骨细胞的成骨功能,增加核心结合因子α1、Ⅰ型胶原mRNA表达水平,促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,上调成骨标志物的表达.文章对OGP促成骨作用的研究进展进行综述.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2010(030)012【总页数】4页(P1565-1568)【关键词】成骨生长肽;成骨;骨髓间充质干细胞【作者】陈晓;罗贝尔;苏佳灿【作者单位】第二军医大学附属长海医院骨科,上海,200433;第二军医大学附属长海医院骨科,上海,200433;第二军医大学附属长海医院骨科,上海,200433【正文语种】中文【中图分类】R681992年Bab等[1]从再生的骨髓细胞中分离出一种多肽，其在体内可激活造血系统、促进骨的合成代谢，在体外可刺激成骨细胞和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖和分化、促进成骨，遂命名为成骨生长肽(osteogenic growth peptide, OGP)。
OGP可促进骨折愈合，预防骨质疏松，可用于骨不连和股骨头坏死的治疗，具有广泛的临床应用前景。
本文就OGP促成骨作用的研究进展进行综述。
1 OGP的生物学特性完整的OGP有14个氨基酸，相对分子质量1 523，组成为丙-亮-赖-精-谷氨酰胺-甘-精-苏-亮-酪-甘-苯丙-甘-甘(H2N-ALKRQGRTLYGFGG-COOH)，C端5肽H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH [OGP(10-14)]为其功能活性基团，其中Tyr和Phe的侧链及Gly残基对于OGP的最佳生物活性至关重要[2]。
OGP的结构高度保守，人类和啮齿类等哺乳动物体内的OGP结构完全一致，具有相似的生物活性[3]，这种生物进化上的保守性提示OGP可能具有潜在的生物学和医学价值。
POSTN在各疾病中的表达与作用机理研究-病理学论文-基础医学论文-医学论文
POSTN在各疾病中的表达与作用机理研究-病理学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——periostin( POSTN) 为成骨细胞及成骨细胞样细胞系分泌的一种胞外基质分泌性蛋白，能促进成骨细胞及其前体在骨膜聚集及分化，最早是由日本学者Takeshita 等［1］从小鼠成骨细胞系MC3r13-E1cDNA 文库中克隆的一种骨黏附分子。
随着对其研究的加深，发现POSTN 在许多种组织中都有高表达，尤其与肿瘤恶性程度及转移、炎症组织的增生及纤维化有着密切的关系，有望成为许多肿瘤及炎症相关疾病的诊断及治疗的检测指标，具有重要的临床价值。
该文就POSTN 在各疾病中的表达及如何参与疾病发生、发展的相关研究予以综述。
1 POSTN 概述POSTN 基因位于第13 号染色体的长臂上，包含1 个典型的信号序列及4 个富含半胱氨酸的重复结构域，并具有C 端结构域。
由于 C 端结构域的不同引起转录过程选择性剪接，其转录产物具有4 种不同的单体，其克隆cDNA 由3187 个碱基对组成，包括5非编码区( 18 bp) 、开放读码框架( 2436 bp)和3非编码区( 733 bp) ，并且缺乏3poly( A) 尾。
它编码了811个氨基酸，分子质量约为90 254。
早期研究认为，POSTN 特异表达于骨膜及牙周膜组织，在肺中少量表达。
目前证实其在许多组织中均存在，如皮肤、肿瘤及癌细胞、肾脏及心脏瓣膜、损伤的肌肉及血管中都有表达。
在功能方面，作为成骨细胞及其前体细胞分泌产生的一种黏附分子，POSTN 可促进成骨细胞及其前体细胞在骨膜聚集、分化; 增强肿瘤的侵袭力，促进转移; 促进损伤血管重建; 促进炎症组织的增生及纤维化。
2 POSTN 相关的信号通路2．1 促进POSTN 表达的通路Li 等发现，肺血管平滑肌细胞在低氧环境下，通过成纤维细胞生长因子1、血管生成素Ⅱ表达的增高，分别激活受体酪氨酸激酶( receptor tyrosinekinases，ＲTK) 和G 蛋白偶联受体通路，使p70S6k、p38 及细胞外信号调节激酶1/2 等基因的表达上调，进而促进POSTN 的表达。
低氧及相关因子对成骨细胞分化影响的研究进展
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００３，１９６：２—８．
［４］
Ｇｏｒｄｉｌｌｏ Ｇ Ｍ，Ｓｅｎ ｃ Ｋ．Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎ
ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ａｍ Ｓｕｒｇ，２００３，１８３：２５９．２６３．
［５］
Ａｋｅｎｏ Ｎ，Ｃｚｙｚｙｋ—Ｋｒｚｅｓｋａ Ｍ Ｆ，Ｇｒｏｓｓ Ｔ ｓ，ｅｔ ａ１．ｎｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｅｓ
为了进一步证实Ｈ１Ｆ一１ａ依赖性的血管生成与骨形成 之间的关系，该研究在成骨细胞上特异性地敲除ＨＩＦ—ｌ ｎ基 因（△ＨＩＦ－１ｄ），ＡＨＩＦ一１ｄ小鼠骨量和血供均明显减少， 这种骨量和血供减少可通过补偿性表达ＨＩＦ．２ ｏ【得到部分 弥补。为了进一步证实ＨＩＦ－２ｃｔ与ＨＩＦ－１ｄ之间作用是否 有重叠，该研究设计了第３种基凶模型，在ＡＨＩＦ—ｌｅｔ小鼠 成骨细胞一卜特异性敲除ｐＶＨＬ基因．这些ＡｐＶＨＬ／ＡＨＩＦ一 １ ｏ【小鼠显示ＨＩＦ一２ｃｔ蛋白表达明鼹增多，并伴有骨量和血 管生成的恢复¨…。以上结果表明，在骨发育和骨塑形改建 过程中，ＨＩＦ一１０ｔ具有促进成骨细胞发育和分化的作用。 ２．２骨形态发生蛋白２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ２） 对成骨细胞分化的调控作用 ＢＭＰ２主要对未分化的间充 质十细胞和骨系细胞起到募集和分化作用，在骨形成早期， ＢＭＰ２不仅可使未分化的问充质干细胞向骨形成中心募集， 并分化为骨系细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓 的基细胞逆转分化为骨系细胞，其对成骨细胞的分化起重要 的调控作用。Ｓａｌｉｍ等将小鼠颅骨原代培养的成骨细胞、骨 髓问允质干细胞和ＭＣ３３＂３一Ｅ１细胞分别放在２０％、２％、 ０．０２％氧浓度中培养０、３、６、１２、２４ ｈ后，定量ＲＴ－ＰＣＲ技术 检测Ｒｕｎｘ２、Ｉ型胶原和骨钙素的表达变化，结果发现 ０．０２％氧浓度而不是２％氧浓度条件下，Ｒｕｎｘ２表达被抑制； 加入外源性ＢＭＰ２后，Ｒｕｎｘ２的表达上调，并且可改善严重 低氧对成骨细胞的分化抑制。但是，与正常氧条件下加入 ＢＭＰ２的成骨细胞相比，Ｒｍｒｘ２的表达水平较低。因此推测， 严重缺氧时，ＢＭＰ２可直接或间接抑制Ｒｕｎｘ２基因的转录， 从而抑制成骨细胞的分化。
成纤维细胞因子和血管生成
成纤维细胞因子和血管生成：血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)以及碱性成纤维细胞生长因子(Basic[ibrob—last growth factor．bFGF)碱性成纤维细胞生长因子和血管再生摘要关键词移植皮瓣坏死是整形外科常见的手术并发症之一，至今其发病机理仍不十分清楚。
但普遍认为血供不足和缺血再灌注损伤是其中的两个重要原因，我们推测将bFGF应用于缺血皮瓣，可能有利于皮瓣下新生血管形成，减轻再灌注损伤，促进皮瓣成活bFGF广泛存在于细胞外间质中，具有广泛的生物活性，能调节中胚层及神经外胚层来源的多种细胞的分裂，其中对血管内皮细胞有显著的增殖效应，是有效的血管生成因子(angiogenic factor)之一。
，但三种剂量组之间差异不显著，9∪g bFGF是皮瓣滴注的最佳剂量。
—般来说，大鼠皮瓣移植后6天～7天，从受床基底重建的有效血供已能够维持整个皮瓣的成活。
术后7天，确定皮瓣坏死率以及SDH含量和氧耗量，反映皮瓣的功能状况较为合适bFGF对大鼠缺血皮瓣琥珀酸脱氢酶含量和氧耗量的影响[1]孙同柱* 傅小兵许明火·王亚平·杨银辉中国重建修复外科杂志1997年11卷5期264-265bFGF可逆转缺氧导致的内皮细胞增殖能力下降】。
通常情况下，由内皮细胞合成的bFGF由于缺少传统的分泌性信号肽，主要存储在细胞质和基质分隔腔，不能以传统的形式分泌。
缺氧时，bFGF可从损伤细胞中释放，途径可能是浆膜破坏释放或内皮细胞膜通透性增加，bFGF从细胞胶质中释放。
这实质是细胞对缺氧的急性应答反应。
此外，缺氧时bFGF在细胞中的分布发生变化，以参与内皮细胞对缺氧的应答】。
常氧下bFGF散在、均匀地分布在胞质和基质分隔腔，缺氧后bFGF分布最明显的变化是核周环的出现和临近核细胞着色增强。
Miehiells 6 证实：外源性的bFGF(5 ng／m1)可刺激缺氧培养的内皮细胞生长，并表现对缺氧的修复能力。
成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究
成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：杨京，赵子瑜，何启芬，陈林【摘要】目的本实验拟通过研究激活成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)信号通路时骨组织成骨细胞分化程度在内毒素血症中的变化，为进一步阐明骨组织在炎症反应中变化的机制奠定基础。
方法8周龄雄性C57小鼠和FGFR3功能持续增强的软骨发育不全(Ach)小鼠各6只，分为脂多糖(LPS)组和生理盐水对照组，每组3只。
LPS 15mg/kg或等量生理盐水腹腔注射4小时后取右侧胫骨提取RNA，定量聚合酶链式反应(PCR)检测白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、骨钙素(OC)的变化。
LPS、碱性成纤维生长因子(bFGF)处理前成骨细胞系MC3T3E1 4小时后定量PCR检测IL6、TNFα、OC水平，成骨诱导7天后检测碱性磷酸酶(ALP)活性。
结果LPS刺激后，骨组织和MC3T3E1的炎症递质基因IL6、TNFα的RNA水平显著增加(P0.01)，成骨标志性基因OC表达下调(P0.05)。
且Ach 小鼠相应基因变化幅度显著高于C57的变化幅度(P0.05)。
MC3T3E1同时用LPS与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)处理组的IL6、TNF α、OC水平表达水平位于单独用LPS或bFGF组之间。
成骨诱导7天后LPS处理组细胞ALP活性显著低于未处理组(P0.05)，bFGF处理组显著增高(P0.01)。
结论LPS刺激骨组织发生炎症反应、抑制成骨细胞分化。
在整体动物水平持续性激活FGFR3信号通路加重上述反应，在细胞水平低剂量bFGF激活FGFR3减轻上述反应。
【关键词】脂多糖;骨;成骨细胞;成纤维细胞生长因子受体3 Abstract：Objective This experiment focuses on the differentiation of osteoblasts in the endotoximia while the FGFR3 pathway is activating,so as to understand the change of bone tissue in inflammation.Methods Six male C57 mice and 6 male Ach mice (persistently activating function of FGFR3),8 weeks old,were divided into normal saline(NS) group and lipopolysaccharide(LPS) group,3 mice per group.RNA was extracted from the right tibias 4 hours after LPS or physiological saline injection,and then the levels of interleukin 6(IL6),tumor necrosis factor α(TNFα),osteocalcin (OC) in tibia and osteoblast were measured by quantitative real time PCR.Four hours after the preosteoblast cell line MC3T3E1 was cultured with LPS and bFGF,the levels of IL6,TNF α,OC in tibia and osteoblast also were measured by quantitative real time PCR.The MC3T3E1 activities of alkaline phosphatase(ALP) were detected 7 days after culture.Results Bothof the levels of IL6 and TNFαin tibias and MC3T3E1 were increased while the levels of OC in tibias and MC3T3E1 were decreased 4 hours after LPS administration(P0.01).The expression change was more huge in Ach mice(P0.05).The expressions of IL6,IL1 and OC in MC3T3E1 cultured with LPS and bFGF were higher than those cultured only with LPS and lower than those only with pared with the untreated group,the activity of ALP in MC3T3E1 was decreased in LPS group(P0.05) and increased in bFGF group(P0.01).Conclusion LPS could involve bone tissue in inflammation and inhibit the differentiation of osteoblast.Persistently activating the function of FGFR3 in vivo could aggravate these effects.And low dose of bFGF in vitro which activates FGFR3 could relieve these effects.Key words：LPS;bone;osteoblast;FGFR3脂多糖(LPS)是脓毒症中主要致病菌革兰阴性菌的主要致病成分。
FGF论文
FGF受体研究进展[摘要] 成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)是一类穿膜的酪氨酸激酶受体,均为单链的糖蛋白分子。
由细胞外区、跨膜区和细胞内区组成。
成纤维细胞生长因子(FGFs)的生物活性是通过与FGFRs结合来启动细胞内信号转导。
受体的活化导致受体酪氨酸自磷酸化作用的产生。
FGFs/FGFRs在不同组织中。
通过复杂的信号传递路径对细胞的增殖、分化和移行进行调节。
由于它们具有广泛的生物学功能,目前FGF信号通路已应用到了人类的一些疾病治疗中。
[关键词] 成纤维细胞生长因子受体;信号转导;生物学功能;临床应用前言：据了解成纤维细胞生长因子最早是从脑和垂体的提取液中发现的，大约150 个氨基酸结构的酸性碱性成纤维细胞生长因子（aFGF：FGF1）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF：FGF2）。
该物质是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质，可以通过与细胞膜特异性受体结合对细胞生长进行调节。
目前发现FGF受体至少是由23个成员组成的大家族，即从FGF1到FGF23共23亚家族。
科发现FGF家族学可调节细胞的生长、存活、分化和迁移，已经在疾病治疗中得到应用。
本文就FGF受体在药理学与临床用药的研究进展作一综述。
为从事FGF受体学习和研究的人群提供全面、系统，具有一定广度和深度的知识大餐。
成纤维细胞生长因子（FGF）家族成纤维生长因子（Fibroblast growth factor, FGF）又被称为肝素亲和生长因子(Heparinbinding growth factor, HBGF)，是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用的多肽分子。
现已知FGF家族至少包括23个成员，即FGF1～FGF23。
FGF家族成员之间的氨基酸序列同源性约为25%～50%，其每个成员都有140个氨基酸的中轴，该中轴在不同的成员中有高度的同源性。
结构分析表明，此中轴折叠成12条逆向平行的β链，它们又进一步形成圆柱状的结构。
骨形态发生蛋白-2在骨形成过程中的作用机制(一)
骨形态发生蛋白-2在骨形成过程中的作用机制(一)骨和软骨组织中含有多种参与调节骨骼发育及生长的多肽类生长因子。
此类因子通过自分泌、旁分泌或者内分泌的方式，在细胞与细胞之间，细胞与细胞外基质之间传递信息，参与复杂的骨形成调节过程。
在诸多因子中，骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)是唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。
由于BMPs与转化因子在C端都含有7个保留的半胱氨酸残基，所以属于转化生长因子-B超家族(transforminggrowthfactor-batesuperfamily,TGF-βs)成员。
本文仅对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在骨形成过程中分子生物学作用机制综述如下。
1骨形态发生蛋白研究概况1965年，Urist首次将0.6M盐酸制备的脱钙骨基质(decalcifiiedbonematrix,DBM)植入鼠股肌内，成功诱导异位骨形成，从而提出了骨诱导理论(Osteoimductivetheory)。
Urist认为DBM 中存在着非特异性物质，其降解片段能够诱导血管周围的未分化间充质细胞分化为骨系细胞。
在异位或常位的骨组织或软骨组织中形成过程中〔1〕，这类骨诱导物质作为形态原(Morphogen)，可以为反应细胞所感知，通过激活或抑制细胞内的基因，调节骨系细胞的分化和增生。
1971年，Urist将这类诱导成骨物质定义为骨形态发生蛋白(BMPs)〔2〕。
在近20年中，人们不仅从多种动物骨组织中分离和纯化出天然的BMP-1、BMP-2、BMP-3和BMP-4，而且还通过基因重组技术进一步在中国仓鼠的卵母细胞和大肠杆菌中表达出了人类基因重组的骨形态发生蛋白(rhbMPs)〔3，4〕。
迄今为止，已经报导了13种BMPs，而且数目仍在继续增加〔5〕。
研究结果表明，在动物生长发育中，BMPs及其相应的受体几乎遍及动物体内所有内脏及体表器官。
因此，BMPs的功能远远地超出了单纯的骨诱导作用。
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复旦学报(医学版)
FudanUnivJMedSci2010Jan,37(1)
△Correspondingauthor E2mail:jjgao@shmu.edu.cn
体外培养成骨细胞成纤维生长因子23表达及其对激素的反应
唐雯菁 周 轶 徐小雅 金慰芳 高建军△(复旦大学放射医学研究所骨代谢研究室 上海 200032)
【摘要】 目的 研究体外培养大鼠成骨细胞在不同分化阶段的成纤维生长因子23(fibroblastgrowthfactor23,
FGF23)基因表达水平,并观察其对钙、磷、甲状旁腺激素(PTH)和1,25二羟维生素D[1,25(OH)2D3]的反应。方法 酶消化法分离培养新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,于细胞半汇合、汇合、基质堆积和矿化4个阶段收获细胞,
Trizol一步法提取总RNA,Real2timePCR法检测其FGF23mRNA水平,并通过其碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨钙素(bonegla2protein,BGP)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA表达水平变化评价成骨细胞分化状态。进一步取汇合细胞,分别用3.2mmol/L氯化钙、4.4mmol/Lβ甘油磷酸钠(βGP)、10
-9
mol/LrhPTH(1234)和
10-8mol/L1,25(OH)2D3作用3d,检测其FGF23的mRNA表达变化,结果与空白对照组比较。结果 体外培养成骨细胞生长良好,成骨细胞FGF23的mRNA水平在汇合时显著上调,为半汇合阶段的7.5倍(P<0.001),于基质堆积和矿化时期回落至半汇合水平,提示成骨细胞FGF23的表达呈阶段特异性。10
-8
mol/L1,25(OH)2D
3刺
激后,FGF23的mRNA表达水平明显上调,约为对照组的16倍(P<0.001);而CaCl2、βGP、PTH刺激后,FGF23的mRNA表达水平与对照组相比,差异无统计学意义。结论 FGF23的表达与成骨细胞的分化状态有关,1,25(OH)2D3能强烈刺激体外培养成骨细胞FGF23的表达。
【关键词】 成纤维生长因子23; 成骨细胞; 1,25二羟维生素D
【中图分类号】 R336;R589.5 【文献标志码】 A
Fibroblastgrowthfactor23expressioninratcalvarialosteoblasticcellsanditsresponsestohormonesinvitro
TANGWen2jing,ZHOUYi,XUXiao2ya,JINWei2fang,GAOJian2jun△(DepartmentofBoneMetabolism,InstituteofRadiationMedicine,
FudanUniversity,Shanghai200032,China)
【Abstract】 Objective Toinvestigatetheexpressionpatternsoffibroblastgrowthfactor23(FGF23)in
osteoblastanditsresponsestocalcium,phosphate,exogenousPTHand1,25(OH)2D3. Methods TheprimaryratcalvarialosteoblastswereculturedinMEMmediumwhichcontaining10%FBS,thenwereharvestedwhencellswereinhalf2confluence,confluence,osteoiddepositionandosteoidmineralizationstagesrespectively.Theprocedurewasmonitoredundermicroscopy.TotalRNAwasextractedfromcellsaccordingtotheTrizolprocedure.FGF23mRNAlevelsweredeterminedbyReal2timePCR.Further,theconfluentosteoblastsweretreatedwith3.2mmol/LCaCl2,4.4mmol/Lβ2glycerophosphate,10-9mol/LrhPTH(1234)and10-8mol/L1,25(OH)2D3respectivelyfor3days,andsamevolumeofthemediumwasaddedas
thecontrol.ThegeneexpressionsweredeterminedbyReal2timePCR. Results FGF23expressionwastransientlyup2regulatedatcellconfluentstageanddown2regulatedafterthat.TheFGF23mRNAlevelswere7.52foldhigherinconfluentcellscomparedwiththatinhalf2confluentcells(P<0.001).Themarkedllystimulatingeffect(about16times)onFGF23expressionwasstimulatedbyexogenous1,25(OH)2D3
treatmentwhilenosignificanteffectwasfoundonFGF23mRNAlevelsbyCaCl2,β2glycerophosphate,and
rhPTH(1234)treatmentswhencomparedwiththecontrol. Conclusions TheFGF23expressionin
1复旦学报(医学版) 2010年1月,37(1) osteoblastisdevelopmentalstage2relatedanditspowerfulstimulatoris1,25(OH)2D.【Keywords】 fibroblastgrowthfactor23; osteoblasts; 1,25(OH
)
2D3
成纤维生长因子23(fibroblastgrowthfactor23,FGF23)在磷代谢和维生素D代谢调节中发挥重要调节作用[1]。FGF23能减少尿磷的重吸收,同时,又能抑制1,25(OH)2D3的合成,从而间接影响体内的钙、磷离子浓度,对骨的发生和重建发挥重要作用。FGF23广泛表达于人体内各组织,然而骨组织特别是成骨细胞是血循环FGF23的主要来源[2]。作为骨组织内分泌功能的典型体现,FGF23的过表达或缺乏与许多骨代谢疾病有关,但目前对成骨细胞FGF23表达和调节机制的认识仍十分有限。为此,本研究通过体外分离培养大鼠成骨细胞,分析了成骨细胞不同分化阶段FGF23基因的表达水平,以探讨FGF23表达与成骨细胞发育的关系,并观察其对钙、磷、PTH和1,25(OH)2D3的反应,以了解体内钙磷水平及内分泌激素对于成骨细胞FGF23表达的影响,促进对其调控机制的认识,希望能对有关疾病的成因和治疗有所帮助。材料和方法成骨细胞分离培养 查考文献[3],取新生SD大鼠,处死后经70%乙醇消毒,取颅盖骨于0.25%胰蛋白酶(Sigma公司)中37℃预消化20min后,将骨片剪成约1mm2的小块,于0.1%Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)中37℃消化50min,收集消化液。用新鲜胶原酶重复消化残留骨碎片1次。将两次收集的消化液离心,弃上清液,沉淀用MEM培养液[含10%胎牛血清(FBS,Gibco公司)、青霉素(上海新先锋药业)100U/mL、链霉素(华北制药公司)100μg/mL]
重悬接种,于5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养,
每2～3d换液1次。取第2继代细胞以8×104个/
只接种于直径35mm培养皿,倒置相差显微镜观察,分别于细胞生长至半汇合、汇合、基质堆积及矿化4个阶段收获细胞。药物干预 取汇合阶段细胞,随机分为5组,每组6孔,分别给予3.2mmol/LCaCl
2(Sigma公司)、
4.4mmol/Lβ2甘油磷酸钠(βGP,Sigma公司)、10-9mol/LrhPTH(1234)(Sigma公司)和10-8mol/L1,25(OH)2D3(Sigma公司),以上各试剂用MEM培养液新鲜配制。取等量MEM培养液为空白对照。每日换液,连续3d后收获细胞。Real2timePCR分析细胞mRNA水平 取成骨细胞,Trizol(北京天根生物制品公司)一步法抽提总RNA,采用QuantiTectRev.TranscriptionKits
试剂盒(Qiagen公司)逆转录合成cDNA,采用QuantiTectSYBRGreenPCRKits(Qiagen公司)试剂盒于Mx3000P实时定量PCR系统(Stratagene
公司)进行目的基因Real2timePCR定量分析。引物序列见表1,实验操作按试剂盒说明进行,四步法进行PCR扩增,产物经融解曲线单峰验证,于T阶段采集信号获得Ct值,计算各测试基因与内参基因GAPDH比值,作相对量分析。统计学分析 数据采用x—±s表示,SPSS11.0
统计软件进行单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有显著统计学意义。
表1 检测基因Real2timePCR引物序列Tab1 PrimersequencesoftestgenesforReal2timePCRGeneSense(5′→3′)Antisense(5′→3′)Productsize(bp)SequencereferenceFGF23TTGGATCGTATCACTTCAGCTGCTTCGGTGACAGGTAG88NM-130754.1
ALPTCCCAAAGGCTTCTTCTTGCATGGCCTCATCCATCTCCAC108NM-013059.1
OPNCTGCCAGCACACAAGCAGACTCTGTGGCATCGGGATACTG145NM-012881.2
BGPCTGAGTCTGACAAAGCCTTCCCATAGATGCGCTTGTAGGC205NM013414.1
Cyp24aTGGATGAGCTGTGCGATGATGCTTTCAAAGGACCACTTGTTC75NM-201635.2
CYP27b1CAGGTGCTCTTCCAGTCAAAAAAGGATCCTGGTTCTGTGG253NM-053763.1
GAPDHAAACCCATCACCATCTTCCAGTGGTTCACACCCATCACAA198DQ403053