硫醇类荧光探针研究进展

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课程论文 (科研训练、毕业设计)

题 目：硫醇类荧光探针研究进展

姓 名：xxxxx 学 院：化学化工学院 系：化学 专 业：化学 年 级：大一 学 号：xxxxxxxxxxxx

xxxxxxxxxxxxxxxx 硫醇类荧光探针研究进展

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硫醇类荧光探针研究进展 摘要:硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重

要的作用，定量检测硫醇在生物化学和临床化学中具有重要的意义。荧光法由于其具有灵敏度高、能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪的优点，成为目前广泛采用检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文引用文献 51篇，按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。

关键词:硫醇，荧光探针，综述

1 引言 硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。小分子硫醇包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、硫辛酸和辅酶A；大分子硫醇包括含巯基的多肽、酶和生物膜。大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶A参与的反应等。谷胱甘肽(GSH)是细胞内含量最高的小分子硫醇(1—10 mmol／L)，它存在氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型GSH的氧化还原动态平衡。大量资料显示，谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原动态平衡、氧化应激和在细胞的生长、功能中起着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。目前已报道的用于检测硫醇的方法主要有：高效液相色谱法、电化学法、荧光法等。荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。 2 正文：利用巯基的亲核性检测硫醇的荧光探针

1．利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇 硫醇类荧光探针研究进展 硫醇类荧光探针研究进展 - 2 -

利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇的探针主要为氮取代的马来酰亚胺类衍生物。马来酰亚胺通常易与硫醇类化合物发生亲核加成反应，在室温下pH 5～8时几分钟即可完成。Kanaoka等发现氮取代的马来酰亚胺类的大多数化合物自身没有荧光或荧光很弱，当它与包含巯基的化合物反应后形成具有强荧光的加成产物，并于1970年开发了第一个比较实用的马来酰亚胺类荧光试剂1。试剂1是一个非常灵敏的检测巯基类化合物的荧光试剂，缺点是激发和发射均处于紫外区，且水溶性差。经过对荧光发射团系统的研究后，Machida等又进一步开发了波长较长水溶性较好的试剂2。试剂2的激发和发射波长分别为400和480 nm，该探针在设计时为了增加水溶性引入了极性的香豆素荧光团和二甲氨基基团。试剂1和2被称为Kanaoka试剂，通常被用作荧光探针来共价标记蛋白质中的巯基活性点。近年来，许多氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针被开发，用来检测动物血清、肝脏、尿液等生物样品中的GSH、Cys等具有重要生物学意义的小分子硫醇。

1995年Langmuir等设计合成了5个以苯并香豆素(naphthopyranone)为母体荧光团的氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针4—8，这些探针与一些小分子硫醇如GSH、Cys等在生理pH条件下立即反应，脂肪族胺、氨基酸和非硫醇蛋白不干扰测定。他们将这5个探针与广泛使用的硫醇类荧光探针3比较，研究了其与硫醇反应前后荧光量子产率的变化，结果显示其与硫醇反应后荧光量子产率显著增大(其中试剂8荧光量子产率变化最大，0．012～0．66)，是比试剂3(0．021—0．13)更为灵敏的探针。

Liang等组设计合成探针5-maleimidyl-2-(in．methylphenyl)benzoxazole(MMPB)，与其它马来酰亚胺类探针相比，由于MMPB—GSH和MMPB—Cys荧光性质的不同，该探针可以实现对GSH和Cys的选择性响应。在激发和发射波长分别为299．2和355．8 nnl时，MMPB可以选择陛硫醇类荧光探针研究进展 硫醇类荧光探针研究进展 - 3 -

的检测GSH，在含有0．4倍的Cys的情况下对GSH的检出限可达3．23×10-10mol／L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于人的血液、猪肝和猪心中GSH含量的测定；在激发和发射波长分别为305．6和425．6 nln时，MMPB还可选择性的检测Cys。在同时存在0．15倍的GSH的条件下对Cys的检出限可达6．2×10-10mol／L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于蛋白质水解液、胱氨酸电解液和人尿液中Cys的测定，回收率高、重现性好。该探针虽然可以实现对GSH和Cys的选择性响应，但激发和发射波长短，生物样品中背景荧光干扰比较大。该课题组2005年又设计合成了一个新的波长较长的荧光探针9啪J，激发和发射波长分别为401和496 nm。试剂9用于检测Cys线性范围1．0×10-8～6．0×10-7moL／L，检出限5．7×10-9moL／L；检测GSH线性范围6．0×10-9～4．0×10-7 mol／L，检出限5．64×10-9moL／L。试剂9被成功应用于检测人血清和血浆中的GSH，人尿液中的Cys，回收率96．2％一103．0％。试剂9用于检测巯基类物质简单快速、可行性强，35℃时15 min即可反应完全，且与前一个探针MMPB相比波长较长，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰。

Matsumoto等设计合成了基于PeT(光诱导电子转移)机理的绿色荧光探针o-maleimideBODIPY(10)，该探针的荧光被供体BODIPY到受体maleimide的激发态光致电子转移过程(d-PeT)强烈猝灭，与硫醇类物质反应后荧光团BODIPY的荧光恢复，荧光增强350倍，反应前后荧光量子产率变化比较大(0．002～0．73)。该探针是目前所见的马来酰亚胺类硫醇荧光探针中除荧光素马来酰亚胺(fluorescein-5-maleimide)外，唯一在可见光区激发和发射的探针，且信噪比远高于fluorescein-5．maleimide(荧光增强倍数仅有十倍，荧光量子产率变化为0．06—0．64)。探针10可以用来清楚定量地标记极低浓度的__牛血清蛋白(牛血清蛋白最低浓度为5 mg／L)。探针lo由于激发和发射波长均处于可见光区，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰，但是仍没有应用到细胞内进行检测。到目前为止，该类探针应用于细胞内成像的还未见报道。氮取代的马来酰亚胺基团对硫醇类物质选择性好、灵敏度高，是适于检测硫醇的活性基团。因此，改善传统荧光团，开发长波长、长寿命以及双光子激发的氮取代的马来酰亚胺类荧光分子探针，使其更适用于生物活体内检测硫醇或标记硫蛋白，硫醇类荧光探针研究进展 硫醇类荧光探针研究进展 - 4 -

是今后该类探针发展的一个重要方向。 Ahn等采用固相文库合成法合成出一系列的罗丹明类荧光化合物，并从中筛选出可高选择性的与谷胱甘肽响应的荧光探针11。试剂11在生理条件下(pH 7．4 HEPES缓冲液中)与GSH发生亲核加成反应使荧光增强，30 min即可达荧光最高点。荧光最大增强11倍，荧光量子产率由0．033升高到0．28。GSSG无荧光增强现象，包含巯基的其它分析物(例如DDT、巯基乙醇、Cys)有荧光弱增强现象但是不影响测定。探针被成功应用于实时检测活的成肌细胞(3T3 ceUs)中的GSH浓度的变化，通过加入增加细胞内GSH浓度的硫辛酸和减少GSH浓度的NMM，发现荧光强度发生显著变化，证明其探针能够对细胞内mmol／L的GSH产生响应。 2．利用巯基对缺电子芳环的亲核取代反应(ArSN)检测硫醇 Maeda等m1以荧光素为母体荧光团，设计合成了2个荧光素磺酸酯的硫醇荧光探针12和13。2，4-二硝基苯磺酰基(DBS)强吸电子作用将荧光素的荧光猝灭，由于巯基的强亲核作用发生ArS。反应，磺酸酯键断裂，荧光团母体结构恢复，荧光增强。探针与GSH反应在37℃生理条件(HEPES，pH 7．4)下，10 min即达到荧光最大值，探针12和13的反应速率分别为1．7×102和1．4×102 mol／(L·S)，检出限可达pmoL／L。探针虽然在水溶液中存在水解副反应，但对测定影响不大(37℃生理缓冲液中1 h探针12和13分别仅水解0．7％和1．1％)。

Zhang等设计合成了一个在可见区激发的荧光增强型的可选择性检测半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hey)的探针14。该探针激发和发射波长分别为465和588 nm，荧光最大增强可达75倍。更为突出的是该探针可用作Cys和Hcy的裸眼探针，加入Cys或Hcy后溶液颜色发生明显变化(由黄绿色变为橘红色)(图1)，其它18种氨基酸无明显颜色变化。探针利用巯基的亲核性，在温和条件下(25℃，y(甲醇)：y(HEPES缓冲液，pH 7．O)=7：3)反应10 min即可完成。由于位阻效应，其它硫醇在此条件下几乎不发生反应。ACCM细胞激光共聚焦成像实验显示探针膜渗透性好，可以显示Cys和Hcy亚细胞分布。更为突出的是该探针可用于双光子荧光成像，可以极大地减小对细胞的光损伤、提高光穿透的深度、降低细胞内本体自发荧光的干扰。